Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine unkonventionelle intraepitheliale Zellpopulation, eine Gamma-Delta-T-Zellpopulation, aus einer humanen endozervikalen Bürstenprobe zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zum Verständnis der Immunereignisse innerhalb des endozervikalen intraepithelialen Kompartiments zu beantworten und so bei der Entwicklung wirksamer Strategien zur Prävention von Infektionen zu helfen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein leistungsstarkes und effizientes Werkzeug für die Untersuchung endozervikaler intraepithelialer Gamma-Delta-T-Lymphozyten in vitro darstellt.

Laura Romero, eine leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Stellen Sie das Röhrchen mit der Zytobürste unmittelbar nach der Entnahme auf Eis. Innerhalb einer Stunde nach der Entnahme das Röhrchen mit der Zytobürste für vier Impulse von 10 Sekunden vortexen.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen und entfernen Sie vorsichtig den Pinsel, ohne die Palette zu stören. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter IMDM-Medium in die Zellen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Legen Sie die Zytobürste auf ein 100-Millimeter-Zellsieb in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Bürste mit 20 Millilitern frischem IMDM.

Zentrifugieren Sie die Wäsche. Die Palette wird in einem Milliliter frischem IMDM resuspendiert und mit den Zellen im originalen Cytobrush-Sammelröhrchen gewaschen. Um die endozervikalen Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, aliquotieren Sie ein- bis dreimal 10 bis die fünften Zellen in 100 Mikrolitern Faxpuffer pro Fünf-Milliliter-Röhrchen und markieren Sie die Zellen mit den Antikörpern und dem Viabilitätsfarbstoff von Interesse für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in einem Milliliter des Kit-Puffers. Nach dem Schleudern der Zellen wird der Überstand vollständig dekantiert. Verwenden Sie Kügelchen und die entsprechenden IgG-Kontrollantikörper, um die Kompensationskontrollen einzustellen.

Laden Sie dann das erste Röhrchen und setzen Sie das Gate auf die gesamte endozervikale Zellpopulation in einem Streudiagramm vorwärts nach nebeneinander, gefolgt vom Ausschluss der Zelldubletten. Die toten Zellen werden entsprechend ihrer Lebensfähigkeitsfarbstoffexpression ausgeschlossen, wobei die lebenden CD45-positiven und CD3-positiven Zellen angesteuert werden. Die Gamma-Delta-Eins- und Gamma-Delta-Zwei-positiven Zellen sind definiert als die Subpopulationen von CD3-positiven Zellen, die Gamma-Delta-TCR exprimieren.

Um die Gamma-Delta-T-Zellen durch magnetische Bead-Isolierung zu isolieren, resuspendieren Sie bis zu einem Mal 10 bis zum siebten frisch geernteten endozervikalen Zellen in 40 Mikrolitern TCR-Gamma-Delta-MicroBead-Kit-Puffer. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das zweistufige Färbeprotokoll, markieren Sie die Zellen mit Anti-TCR-Gamma-Delta-Hapten-Antikörpern, gefolgt von Anti-Hapten-FITC-konjugierten MicroBeads für 15 Minuten bei vier bis acht Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in einem Milliliter des Kit-Puffers und dekantieren Sie den Überstand vollständig.

Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Kit-Puffer und tragen Sie die Zellsuspension direkt auf eine magnetische Bead-Säule auf, die in den entsprechenden Separatormagneten eingesetzt ist, und sammeln Sie den Durchfluss in einem neuen Röhrchen. Wenn alle Zellen die Säule durchlaufen haben, waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern frischem Puffer und legen Sie die Waschgänge mit den gesammelten Zellen zusammen. Um die Gamma-Delta-T-Zellen zu sammeln, geben Sie die Säule in ein konisches Röhrchen und spülen Sie die T-Zellen mit dem Säulenkolben mit einem Milliliter frischem Puffer aus der Säule.

Um die Gamma-Delta-T-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu isolieren, markieren Sie die Zellen mit einem Viabilitätsfarbstoff im Antikörperpanel, wie gerade gezeigt. Sortieren Sie dann die Zellen nach ihrem lebensfähigen Farbstoff und der CD45-, CD3- und Gamma-Delta-Positivität. Eine einzigartige Population von Gamma-Delta-V1-exprimierenden T-Zellen kann in humanen endozervikalen Zellproben leicht nachgewiesen werden.

Eine detaillierte phänotypische Analyse der gated CD3-positiven Gamma-Delta-Eins-positiven Zellen zeigt, dass die Mehrheit dieser Zellen CD4- und CD8-negativ ist. Die magnetische Kügelchentrennung der endozervikalen Zellen, wie gerade gezeigt, führt zur Reinigung einer fast 98%igen reinen Population dieser TCR-Gamma-Delta-Zellen. Dieser Reinheitsgrad kann auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erreicht werden, was die Verwendung beider Techniken für die Isolierung von endozervikalen Gamma-Delta-T-Zellen validiert.

Interessanterweise zeigt die Analyse von endozervikalen Intraepithelzellen, Gamma-Delta-T-Zellen, die von weiblichen HIV-infizierten Patienten entnommen wurden, und gesunden Spenderkontrollen, eine leichte Verringerung der Anzahl und Lebensfähigkeit dieser wichtigen Zellen bei HIV-infizierten Personen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Probe schnell zu verarbeiten und die Zellen während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten, um eine gute Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie die Einzelzellsortierung in Kombination mit einer hochsensitiven Durchsatz-Multiplex-PCR, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Entzündungs- und Signalwegen innerhalb des endozervikalen intraepithelialen Kompartiments zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet von HIV und Infektionskrankheiten, um neuartige Zellmarker für die Verwundbarkeit der Schleimhäute zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie intraepitheliale Lymphozyten aus einer menschlichen endozervikalen Bürstenprobe hergestellt werden.