Name: Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung humaner endozervikaler Gamma-Delta-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die effiziente Charakterisierung intraepithelialer Lymphozyten für immunologische Forschung.

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Wir danken den Studienteilnehmern Miami WIHS für ihre Bereitschaft, an dieser Arbeit teilzunehmen. Die Daten in diesem Manuskript wurden von der Vermittlungs-HIV-Studie Miami gesammelt Frauen (WIHS). Der Inhalt dieser Veröffentlichung sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht die offizielle Position der National Institutes of Health (NIH) darstellen. Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten unterstützt und Vermittlungs-HIV-Infektion Studie Frauen (WIHS) [Gewährungsnummer U01 AI103397], Nationales Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, National Institutes of Health [Grant-Nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences und das Nationale Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten, National Institute of Health [Gewährungsnummer UL1TR000460 und 1KL2TR000461] und National Institute of Child Health und Human Development, National Institute of Health [Gewährungsnummer K23HD074489].

Study Aktivitäten fand an der Universität von Miami HIV Research Unit in Zusammenarbeit mit dem HIV-Vermittlungs-Studie Miami Frauen (WIHS) und dem Miami Zentrum für AIDS-Forschung (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) Genehmigung wurde vor erhalten zur Rekrutierung und jegliche Beurteilung oder Untersuchung im Zusammenhang mit Verfahren. 1. Endozervikale Pinsel Probenentnahme HINWEIS: Die Teilnehmer unterzog sich einer vaginalen Untersuchung durch geschultes MD oder Gynäkologen und Sammlung von intraepitheliale Lymphozyten wurden durchgeführt durch das Einfügen Zytobürste unter Speculum Prüfung durchgeführt. <ol><li> Teilnehmer Merkmale <ol><li> Rekrutieren Frauen Teilnehmer, die 18 bis 45 Jahre alt sind, sexuell aktiv, nicht schwanger und nicht auf Verhütungsmittel Medikamente oder mit einem Intrauterinpessar. </li><li> Vor vaginale Untersuchung unterziehen haben die Teilnehmer 10 ml Blut ziehen in grünTop-Heparin Vacutainer für Pbmc (PBMC) Isolierung. dienen als Kontrolle für endocervical intraepitheliale Analyse 9. </li></ol></li><li> Sammlung der endozervikale Proben <ol><li> Legen Sie eine sterile Speculum von geeigneter Größe in die Vagina ohne Schmierung. Verwenden Sie ein warmes Wasser Einführen des Spekulums zu erleichtern und steriler Gaze den Schleim zu reinigen. Die Position des Speculum ermöglicht eine vollständige Visualisierung des Os und ectocervix. </li><li> Legen Sie endocervical Pinsel in die Endozervikalkanal, bis nur noch die Borsten am nächsten an der Hand sichtbar sind. Drehen Sie die Bürste im Uhrzeigersinn um 360 °. Übertragen Sie die Bürste in einem 15 ml-Röhrchen, die 5 ml IMDM-Medium. </li><li> Unmittelbar nach der Entnahme wird das Reagenzglas Zytobürste auf Eis enthält. Um eine hohe Lebensfähigkeit der gesammelten intraepitheliale Zellen zu erhalten, liefern die Zytobürste ins Labor und Prozess innerhalb von 1 h. </li></ol></li></ol><ol><li> Vortex-Röhrchen mit endocervical Zytobürste Anwendung 4 kurz (10 sec) Schlägen. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen, mit Zytobürste, 10 min bei 250 x g. </li><li> Vorsichtig die Cytobrush aus dem Rohr zu entfernen (nicht das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören) und 1 ml IMDM Medium hinzuzufügen und das Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Legen Sie die Zytobürste auf der 100 mm Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube. </li><li> Waschen Sie die Zytobürste mit 20 ml IMDM. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 250 x g. </li><li> Den Überstand abgießen und pelletierten Zellen resuspendieren in 1 ml IMDM und verbinden sich mit dem bereits wieder suspendierten Pellets in 2.3 beschrieben. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler 10 oder die Zellen zählen Zählkammer durch die Kombination von 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension mit 10 &amp; mgr; l Trypanblaufarbstoff. Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zehnmal um die Zellen zu mischen und färben. Last 10 &amp; mgr; ldes Gemisches in der Öffnung der einen der beiden Kammern Hämozytometer. Zählen Sie alle Zellen in den fünf Rasterflächen. Halten Sie eine separate Zählung der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:% Lebensfähige Zellen = Nicht lebensfähige Zellen x 100 / Gesamtzellzahl Zellen. Bestimmen die nachfolgenden Zellkonzentration pro ml (und die Gesamtzahl der Zellen) unter Verwendung der folgenden Berechnungen. Insgesamt Zellen pro ml = Gesamt Zellen gezählt x (Verdünnungsfaktor / Anzahl der gezählten Quadrat) x 10.000 Zellen / ml. </li><li> Gefriert isoliert endozervikale Zellen mittels Einfrieren-Medium, enthaltend 10% DMSO und 90% FBS. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie <ol><li> Re-suspendieren 1-3 x 10 5 Zellen endocervical in 100 ul FACS - Puffer (PBS , enthaltend 1% Rinderserumalbumin </li><li> 1 &amp; mgr; l / 10 6 , LIVE / DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit und Antikörper für Oberflächenmarker in den in Tabelle 1 beschrieben Konzentrationen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 4 ° C, vor Licht geschützt. </li><li> 1 ml FACS-Puffer und die Zellen und Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 350 xg </li><li> Re-suspendieren Zellpellet in 300 &amp; mgr; l 1% Paraformaldehyd. </li><li> Bereiten Kompensationssteuerungen für die Färbung verwendet, um Perlen und Antikörper durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer und ein Tropfen der Perlen und die gleiche Konzentration der für die Probenfärbung verwendeten Antikörper. </li><li> Erwerben gefärbten Perlen und Proben auf einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit 405 nm, 488 nm und 635 nm Laser. </li></ol> 4. Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen Isolation <ol><li> Magnetic - Bead - Isolation <ol><li> Re-suspend endocervical Zellpellet (≤10 7 insgesamt Zellen) beschrieben in 2,6, in 40 &amp; mgr; l Puffer, die in der TCR gamma delta Mikrobead Kit in der Tabelle der Materialien und Reagenzien verwiesen. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen Kit für zweistufigen Färbeprotokolls: Erstens, Witzh anti-TCR gamma delta Hapten-Antikörper und der zweite, mit anti-Hapten-Mikrobeads-FITC </li><li> Nach einer Inkubation von 15 min bei 4-8 ° C, wasche die Zellen durch Zugabe von 1 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min. Den Überstand umfüllen durch das Rohr Umkehren und tippen Sie trocken mit Hilfe von einem Stück Papier. </li><li> Re-suspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l Puffer zur Verfügung gestellt und bereiten die magnetische Säule, indem sie in geeigneten Magnetscheider Platzierung gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Bewerben Zellsuspension auf die Säule und sammeln unmarkierten Zellen, die durchlaufen und waschen Säule 3x mit entsprechenden Menge an Puffer (500 ul). Führen Waschschritte durch Zugabe von Puffer dreimal, jedes Mal, wenn die Spalte Behälter leer ist. Sammeln gesamten Ausflusses. Dies ist die unmarkierten, negativen Zellfraktion </li><li> Entfernen Sie die Säule bilden die Magnetscheider und Pipette 1 ml Puffer auf die Säule und sofort spülen Fraktion mit dem magnetisch-Labeled-Zellen, indem Sie den Kolben mit der Säule geliefert Anwendung. HINWEIS: Isolierte gamma delta T-Zellen sind bereits für durchflusszytometrische Analyse fluoreszenz gefärbt, da magnetisch markierten Anti-Hapten-Mikrokügelchen mit Fluoreszenzfarbstoff FITC konjugiert sind. </li></ol></li><li> Zellsortierung <ol><li> Für Zellsortierung, Etikett Endozervikalzellen mit Lebensfähigkeit sterben und Antikörper-Panel, wie in Kapitel 3 beschrieben. </li><li> Richten Sie elektronische Tore auf dem Live - CD45 + CD3 + und Gamma - Delta - positive Zellen und Zellsortierung durchführen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Autoren haben keine gewerblichen oder anderen Verein, der einen Interessenkonflikt (zB Pharma Aktienbesitz, Beratung, Beirat Mitgliedschaft, relevante Patente oder Forschungsförderung) darstellen könnten.

Bewertung der weiblichen Genitaltrakts unteren Anfälligkeit Schleimhaut ist ein wesentlicher Bestandteil von klinischen Studien Risiko einer HIV-Erfassung und Übertragung Adressierung. Typischerweise wird FGT Anfälligkeit für eine HIV - Infektion durch Messung löslichen Immunmodulatoren in Genitalsekreten (Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide) bewertet 12, 13. Allerdings sind diese Biomarker nur indikativ für vaginale Entzündung, werden von physiologi...

Wir entwickelten Methodik der Verwendung von endozervikalen Bürstenproben intraepitheliale GD-T-Zellen zu bewerten. Der Endozervikalkanal wird durch eine einzige Schicht von Epithel ausgekleidet. Intraepitheliale Lymphozyten repräsentieren Front - Lymphozyten in der Epithelschicht Wohnsitz, die sich schnell Immunreaktionen auslösen können pathogene Mikroben 7 nach der Begegnung, 8. die immunologischen Ereignisse des endozervikalen intraepitheliale Kompartiment zu verstehen, ist für das Design von wirksamen Strategien wichtig zur Verhinderung von Infektionen, einschließlich HIV. Unser Verfahren kann für frisch gesammeltem humanen endozervikalen Proben sowie gefrorene endozervikalen Zellen angewendet werden, um die Rolle von intraepithelialen GD T-Zellen bei Frauen mit HIV-Infektion erforschen oder einem Risiko für eine HIV-Infektion. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, neue immunologische Ereignisse in endocervical intraepitheliale Raum zu entdecken und zu evaluate GD T-Zell-Antworten als Marker mit einer HIV-Infektion bei Frauen Anfälligkeit der Schleimhaut. Die erheblichen Lücken im Wissen um FGT Immunität sind teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der erfolgreichen Erfassung und Verarbeitung Schleimhautproben. Darüber hinaus ist die komplexe Heterogenität der Schleimhautimmunzellen und deren Vernetzung untereinander, sind große Herausforderungen zu klinisch relevanten Messungen zu identifizieren, die den Zustand und die Fähigkeit des Immunsystems widerspiegeln. Wir entwickelten eine Methode, hochgereinigtes intraepitheliale GD-T-Zellen zu erhalten, die weiter analysiert werden können hoch Multiplex, Single-Cell-Technologien, die für die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen von FRT Immunität von entscheidender Bedeutung sein kann.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 12440061</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter automatisierter Zellzähler (Der Zellviabilitätsanalysator der Vi-CELL-Serie</td><td>Beckman Coulter</td><td>496178</td> DMSO, <td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, fötales</td><td>Rinderserum-Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares gelbes Fleckenset für tote Zellen&nbsp;</td><td>Life Technologies,</td> <td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Durchflusszytometer&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC Amin Reaktive Kompensationsperlen (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR Gamma/Delta MicroBead Kit&nbsp;</td><td>Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>MS-Säule</td><td></td><td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS-Abscheider</td><td></td><td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und analyse über durchflusszytometrie der menschen endozervikale gamma-delta-t-zellen

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Die weiblichen Fortpflanzungstrakt (FRT) Schleimhaut-Immunsystem dient als erste Verteidigungslinie. Bessere Kenntnis der Genitalschleimhaut ist daher wesentlich für das Verständnis der Pathogenität von verschiedenen Krankheitserregern wie HIV. Gamma delta (GD) T-Zellen sind der Prototyp &quot;unkonventionelle&quot; T-Zellen und eine relativ kleine Teilmenge von T-Zellen durch ihre Expression von heterodimeren T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die aus gamma und delta-Ketten definiert darstellen. Das unterscheidet sie von den klassischen und viel besser CD4 + T - Helferzellen und CD8 + zytotoxischen T - Zellen bekannt , die durch Alpha-Beta - TZR definiert sind. GD-T-Zellen zeigen häufig gewebespezifische Lokalisation und in Epithel angereichert. GD T-Zellen dirigieren Immunreaktionen bei der Entzündung, Tumorüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen. Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbar zu isolieren und die menschliche endocervical intraepitheliale GD T-Lymphozyten zu analysieren. Wir have verwendet endocervical Zytobürste Proben von Frauen in der Frauen-Vermittlungs-HIV-Infektion Study (WIHS) teilnehmen. Das Wissen über GD-T-Zellen-Wechselwirkungen bei Bedingungen, in denen es eine Beleidigung für die vaginale Schleimhaut ist, könnte zu einer klinischen Studie angewendet werden, bei denen der Schleimhaut Anfälligkeit gerichtet ist, einschließlich der Entwicklung von vaginalen microbicides.In hinaus sind Kenntnisse über Schleimhaut GD T-Zell-Reaktionen hat Potenzial für die Anwendung der GD T-Zell-basierte Immuntherapie bei der Behandlung von Infektionskrankheiten.

Vor kurzem haben wir analysiert , endocervical intraepitheliale GD - T - Zellen , und wir waren die ersten, über den Verlust von endocervical Gamma - Delta - T - Zellen in HIV - infizierten Frauen 9, 11 zu melden. Hier beschreiben wir das Protokoll zu isolieren und die Teilmenge von endozervikalen gamma delta T-Zellen zu analysieren. Wie in Figur gezeigt ist, kann 1, GD T - Zellen leicht in die m...

Wir beschreiben hier eine Isolierungsmethode zur Gewinnung humaner endozervikaler intraepithelialer Lymphozyten für die Analyse von intraepithelialen gamma delta T-Zellen. Dieses Protokoll kann für die Aufreinigung von endozervikalen Gamma-Delta-T-Zellen durch magnetische Beads oder durch Zellsortierung erweitert werden.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, eine unkonventionelle intraepitheliale Zellpopulation, die aus Gamma-Delta-T-Zellen, aus einer humanen Endozervixabstrichprobe zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum Verständnis der immunologischen Vorgänge im intraepithelialen Kompartiment der Endozervix zu beantworten und somit bei der Entwicklung effektiver Strategien zur Prävention von Infektionen unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug zur Untersuchung endozervikaler intraepithelialer Gamma-Delta-T-Lymphozyten in vitro bietet.Den Vorgang wird Laura Romero, eine leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren. Unmittelbar nach der Sammlung das Röhrchen mit dem Zytobürstchen auf Eis stellen. Innerhalb einer Stunde nach der Sammlung das Röhrchen mit dem Zytobürstchen viermal für jeweils 10 Sekunden vortexen.Anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen vorsichtig den Bürstenaufsatz, ohne die Palette zu stören. Geben Sie danach ein Milliliter IMDM-Medium zu den Zellen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Legen Sie die Zellbürste auf einen 100-Millimeter-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konusröhrchen und spülen Sie die Bürste mit 20 Milliliter frischem IMDM aus.Zentrifugieren Sie die Waschflüssigkeit. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem IMDM und vereinigen Sie die Waschflüssigkeit mit den Zellen im ursprünglichen Zytobürsten-Sammelröhrchen. Um die endozervikalen Zellen per Durchflusszytometrie zu analysieren, pipettieren Sie jeweils ein- bis dreimal 10 hoch 5 Zellen in 100 Mikroliter FACS-Puffer pro Fünf-Milliliter-Röhrchen und markieren Sie die Zellen mit den gewünschten Antikörpern und einer Vitalitätsfarbe 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Am Ende der Inkubation die Zellen in einem Milliliter Puffer des Kits waschen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen das Überstand vollständig entfernen. Verwenden Sie die Kügelchen und die entsprechenden IgG-Kontrollantikörper, um die Kompensationskontrollen einzurichten.Danach die erste Röhre laden und das Tor auf die gesamte Endozervixzellpopulation in einem Vorwärts- durch Seitenstreuplot setzen, gefolgt von der Ausschließung von Zell-Doubletten. Ausschluss der toten Zellen entsprechend ihrer Expression des Vitalitätsfarbstoffs, wobei auf lebende CD45-positive und CD3-positive Zellen getor wird. Die gamma-delta-1- und gamma-delta-2-positiven Zellen werden als Teilpopulationen der CD3-positiven Zellen definiert, die den gamma-delta-TCR exprimieren.Um die Gamma-Delta-T-Zellen mittels magnetischer Bead-Isolierung zu gewinnen, resuspendieren Sie bis zu 1 × 10⁷ frisch gewonnene endozervikale Zellen in 40 µl Puffer des TCR-gamma-delta-MicroBead-Kits. Laut Herstelleranleitung für das zweistufige Färbeprotokoll werden die Zellen zunächst mit einem anti-TCR-gamma-delta-Hapten-Antikörper und anschließend mit FITC-konjugierten anti-Hapten-MicroBeads für 15 Minuten bei 4 bis 8 °C markiert. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 1 ml des Kit-Puffers und dekantieren das Überstand vollständig.Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter Kit-Puffer und geben Sie die Zellsuspension direkt auf eine magnetische Säule, die in dem entsprechenden Trennmagneten befestigt ist. Sammeln Sie den Durchlauf in einem neuen Röhrchen. Nachdem alle Zellen durch die Säule gelaufen sind, waschen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikroliter frischem Puffer und vereinigen Sie die Waschfraktionen mit den gesammelten Zellen. Um die Gamma-Delta-T-Zellen zu gewinnen, überführen Sie die Säule in ein kegelförmiges Röhrchen und spülen Sie die T-Zellen mithilfe des Säulenstößels mit einem Milliliter frischem Puffer aus der Säule. Um die Gamma-Delta-T-Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren, markieren Sie die Zellen mit einem Vitalitätsfarbstoff, wie im zuvor gezeigten Antikörpanel. Anschließend sortieren Sie die Zellen entsprechend ihrer Vitalitätsfärbung sowie ihres CD45-, CD3- und Gamma-Delta-Positivität. Eine einzigartige Population von Gamma-Delta-V1-exprimierenden T-Zellen kann in menschlichen Endozervix-Zellproben leicht nachgewiesen werden.Eine detaillierte phänotypische Analyse der selektierten CD3-positiven, Gamma-Delta-1-positiven Zellen zeigt, dass der Großteil dieser Zellen negativ für CD4 und CD8 ist. Die Trennung der endozervikalen Zellen mittels magnetischer Sphären, wie gerade gezeigt, führt zur Anreicherung einer nahezu 98 % reinen Population dieser T-Zell-Rezeptor-Gamma-Delta-Zellen. Dieser Reinheitsgrad kann ebenfalls mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung erreicht werden, wodurch die Verwendbarkeit beider Methoden zur Isolierung endozervikaler Gamma-Delta-T-Zellen bestätigt wird.Interessanterweise zeigt die Analyse von endozervikalen intraepithelialen Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, die von HIV-infizierten weiblichen Patientinnen und gesunden Spenderkontrollen gewonnen wurden, eine leichte Verringerung der Anzahl und Vitalität dieser wichtigen Zellen bei HIV-infizierten Individuen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe schnell zu verarbeiten und die Zellen während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten, um eine gute Zellvitalität zu gewährleisten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Einzelzellselektion in Kombination mit einer hochsensitiven, durchflussbasierten Multiplex-PCR angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu den entzündlichen und Signalwegen im endozervikalen intraepithelialen Kompartiment zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet von HIV und Infektionskrankheiten den Weg, um neuartige Zellmarker für die Schleimhautanfälligkeit zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intraepitheliale Lymphozyten aus einer humanen endozervikalen Abstrichprobe präpariert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur magnetischen Markierung einer niedrig konzentrierten Population von CD4+Vδ1+γδ T-Zellen aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs). Mit einer Kombination aus FITC-konjugierten Anti-Vδ1-Antikörpern, magnetischen Anti-FITC-Mikrokügelchen und mit Anti-CD4-Antikörpern beschichteten superparamagnetischen Kügelchen können die CD4+Vδ1+ T-Zellen erfolgreich aus der PBMC-Population aufgereinigt werden.

Selektive Isolierung von CD4+ Vδ1+ γδ T-Zellen aus mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes

Die Verwendung von Zytobürstenproben zur Entnahme von Lymphozyten und Monozyten aus dem Endozervix ist eine minimalinvasive Technik, die Proben für die Analyse der Immunität des weiblichen Genitaltrakts liefert. In diesem Protokoll beschreiben wir die Entnahme von Zytobürstenproben und die Isolierung von Immunzellen für Durchflusszytometrie-Assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Klonierung der seltenen T-Zell-Einheit von peripheren Vδ1+CD4+ T-Zellen zur Verfügung, die, wie wir kürzlich gezeigt haben, ein extrathymer αβ T-Zell-Vorläufer ist. Diese Technik ermöglicht es, diese Zellen in ex vivo-Kulturen quantitativ zu isolieren, zu klonen und effizient zu expandieren.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Hier, ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von CD4+ T-Zelle Teilmengen aus menschlichen peripheren Blut wird beschrieben. CD4 gereinigt+ T-Zellen werden analysiert, indem Durchflusszytometrie Proportionen des follikulären T Helfer-Zelle Teilmengen zu bestimmen.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Die klonale Expansion ist ein Schlüsselmerkmal der antigenspezifischen T-Zell-Antwort. Der Zellzyklus von Antigen-reagierenden T-Zellen wurde jedoch schlecht untersucht, teilweise aufgrund technischer Einschränkungen. Wir beschreiben eine durchflusszytometrische Methode zur Analyse klonal expandierender Antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten geimpfter Mäuse.

Ein DNA/Ki67-basierter Durchflusszytometrie-Assay zur Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen bei geimpften Mäusen

Dies ist eine Methode, um uteruslymphoide Zellen sowohl von schwangeren als auch von nicht schwangeren Mäusen zu isolieren. Diese Methode kann für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, Zellsortierung, funktionelle Assays, RNA-seq und Proteomik verwendet werden. Das Protokoll hier zeigt, wie man angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 1 durch Durchflusszytometrie phänotypisiert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Erfahren Sie die Isolierung humaner endozervikaler Gamma-Delta-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die effiziente Charakterisierung intraepithelialer Lymphozyten für immunologische Forschung.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

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