In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Nanopartikel werden aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften zunehmend in Industrie und Medizin eingesetzt. Die Besorgnis über die menschliche Gesundheit im Zusammenhang mit einer längeren Exposition gegenüber Nanopartikeln besteht jedoch weiterhin. Diese Risiken können quantifiziert werden, indem das Verhalten von Nanopartikeln in Zellen und die induzierten Stoffwechselreaktionen von Zellen auf Nanopartikel untersucht werden.

Dies ist zum Teil auf den Mangel an Methoden zurückzuführen, die den Nachweis und die Quantifizierung von internalisierten Nanopartikeln in einer kleinen Zelle ermöglichen. Zwar lassen sich zahlreiche Analysewerkzeuge, darunter Mikroskopie und Massenspektrometrie, nutzen, um die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln abzuschätzen, diese liefern aber nur auf mikroskopischer Ebene qualitative Informationen. Im Gegenteil, In-situ-Methoden, die auf Atomspektroskopie basieren, können die Menge der bildgebenden Artefakte, die bei der Probenvorbereitung entstehen, reduzieren und eine direkte Beobachtung von Nanopartikeln ermöglichen.

Um dies zu nutzen, stellen wir einen korrelativen Ansatz vor, der es uns ermöglicht, Nanopartikel entweder im nativen Zustand oder im Laborbett mit einem Fluoreszenz-Tag zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf der Kombination von Fluoreszenzmikroskopie und Kernmikrosondenanalyse basiert. Dies liefert Bilder der zellulären Dichte, der speziellen Verteilung chemischer Elemente und der Menge an Nanopartikeln pro Zelle.

Zur Demonstration werden wir an Zellen forschen, die 24 Stunden lang Titandioxid-Nanopartikeln ausgesetzt waren, sowohl mit Fluoreszenzmikroskopie als auch mit Kernmikrosondenanalyse. Für dieses Protokoll wird ein kundenspezifischer Probenhalter aus dem Polymer PEEK benötigt. Es muss für die Zellkultivierung und In-vitro-Beobachtungen geeignet sein.

Decken Sie den Halter mit zwei Mikron dicker Polycarbonatfolie ab. Die Polycarbonatfolie wird mit einer dünnen Schicht Formvar-Lösung auf die PEEK-Schale geklebt. Nach der Montage muss der Probenhalter sterilisiert werden.

Mehrere sterile Probenhalter, einer pro Well, können in einer sterilen Zwölf-Well-Platte gelagert werden, bis sie für die Verwendung benötigt werden. Zellen, die mit Matrixreihen-GFP-Plasmiden transfiziert wurden, werden durch Fluoreszenzmikroskopie überprüft, um sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich stattgefunden hat und dass sie das fluoreszierende Protein exprimieren. Ernten Sie die Zellen mit Trypsin und inkubieren Sie sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie frisches Nährmedium hinzufügen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie eine angemessene Menge frischen Nährbodens hinzu.

Zählen Sie die Zellen und führen Sie eine Verdünnung mit frischem und thermostatisiertem Vollkulturmedium durch, um eine Zellsuspension von 500 Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Plattieren Sie einen 40-Mikroliter-Tropfen in der Mitte der Polycarbonatfolie. Legen Sie die Probe vorsichtig für zwei Stunden in den Zellinkubator.

Fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter frisches Nährmedium hinzu und lassen Sie es 24 Stunden lang stehen. Fluoreszierende dimodifizierte Titanoxid-Nanopartikel wurden entwickelt, synthetisiert und mit häufig verwendeten Fluorophoren gepfropft, um Nanopartikel in vitro zu detektieren, zu verfolgen und zu lokalisieren. Für diesen Schritt sollte bereits eine Titandioxid-Nanopartikel-Suspension in Reinstwasser mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hergestellt worden sein.

Dispergieren Sie die Nanopartikel mit einminütigen intensiven Ultraschallimpulsen bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Nanopartikel in einem geeigneten Nährmedium, um eine Expositionssuspension von vier Mikrogramm pro Quadratzentimeter zu erhalten. Schalten Sie das bisherige Zellkulturmedium auf dieses neue nanopartikelhaltige Medium um und mischen Sie es schonend, um eine homogene Nanopartikelverteilung zu erreichen.

Bereiten Sie einen Satz Kontrollzellen auf die gleiche Weise ohne Zusatz von Titandioxid-Nanopartikeln vor. Inkubieren Sie die Zellpopulationen für 24 Stunden. Unter Verwendung von Paraformaldehyd können diese Proben fixiert und für die In-situ- und Einzelzellbildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie bearbeitet werden.

Die kryogene physikalische Fixierung hingegen bewahrt die Ultrastruktur und die biochemische Integrität der Zelle. Die Plunge Freezing Fixierung stoppt die zelluläre Aktivität innerhalb von Millisekunden und vermeidet die Verwendung von Fixiermitteln. Um die Zellen kryogenisch zu fixieren, führen wir folgende Schritte durch.

Bereiten Sie eine Aluminium-Transferplatte vor, indem Sie sie in flüssigem Stickstoff abkühlen. Lagern Sie die Platte in einer mit flüssigem Stickstoff gefüllten Box und halten Sie die Plattenoberfläche über der Flüssigkeit im kalten Stickstoffdampf. Eine ausreichende Menge 2-Methylbutan auf 150 Grad Celsius abkühlen lassen.

Bereiten Sie einen 50 Milliliter Falcon mit Nährmedium und zwei Falcons mit Reinstwasser vor. Stellen Sie sicher, dass sich saugfähiges Papier in der Nähe befindet, um die Probe vor dem Einfrieren zu trocknen. Spülen Sie die Zellen einmal in Kulturmedium und dann zwei weitere Male in sterilem, ultrareinem Wasser, um überschüssige Salze zu entfernen, die im Kulturmedium verbleiben.

Trocknen Sie die Probe schnell auf dem saugfähigen Papier. Frieren Sie die Zellen 30 Sekunden lang in das gekühlte 2-Methylbutan ein und legen Sie sie auf die gekühlte Aluminium-Transferplatte. Es ist wichtig, dass die Box so weit wie möglich geschlossen bleibt, um zu verhindern, dass Wasserdampf auf der Oberfläche der Kühlplatte kondensiert.

Nach dem Einfrieren aller Proben wird die Gefriertrocknung mit der folgenden Methode durchgeführt, um jegliches Wasser zu sublimieren. Führen Sie zunächst eine primäre Trocknung für 12 bis 24 Stunden bei niedrigem Druck und niedriger Temperatur durch. Halten Sie anschließend den Druck niedrig und führen Sie eine zweite Trocknungsphase für mindestens 24 Stunden durch, in der die Plattentemperatur auf 40 Grad Celsius erhöht wird.

Nach der Kryofixierung können die Proben mehrere Tage lang bei Raumtemperatur steril und trocken gelagert werden, geschützt vor Staub und Feuchtigkeit. Die Analyse der nuklearen Mikrosonde wurde am Ifera-Standort in Bordeaux, Frankreich, durchgeführt. Ein 3,5-Megavolt-Singletron-Teilchenbeschleuniger liefert einen Lichtionenstrahl im Megaelektronenvolt-Energiebereich.

Die Bildgebung chemischer Elemente wurde an der Mikrosonden-Beamline unter Verwendung komplementärer Ionenstrahl-Analysetechniken durchgeführt. Die verwendeten Techniken verwenden eine Mikro-PIXE, partikelinduzierte Röntgenemission, STIM, Rastertransmissions-Ionenmikroskopie und Mikro-RBS, Rutherford-Rückstreuspektrometrie. Die Proben werden in der Analysekammer positioniert und unter Vakuum mit verschiedenen Partikeln bestrahlt, um verschiedene Ionenstrahlanalysen durchzuführen.

STIM wird verwendet, um Luftdichtekarten von Zellen aufzuzeichnen, die auf den Energieteilchen basieren, die durch Zellregionen mit unterschiedlicher Dichte gelangen. Die Mikro-PIXE- und Mikro-RBS-Analyse ermöglicht die räumliche Verteilung und Quantifizierung chemischer Elemente auf Einzelzellebene. Ein Protonenmikrostrahl mit 1,5 Megaelektronenvolt wird auf einen Durchmesser von etwa 1 Mikrometer fokussiert und über die interessierenden Zellen abgetastet, die mit STIM identifiziert wurden.

Röntgenstrahlen, die von den in der Probe vorhandenen Atomen emittiert werden, die von Natrium bis Titan reichen, ermöglichen die Bestimmung der Elementkonzentrationen. Rückgestreute Protonen werden gesammelt, um die Gesamtzahl der einfallenden Teilchen zu messen, die zur Normalisierung der Röntgenintensität erforderlich ist. Es ist von entscheidender Bedeutung, über zertifizierte Kalibrierstandards für die Quantifizierung von Elementkonzentrationen zu verfügen, um die Reaktion des Röntgendetektors zu kalibrieren.

Um die Ionenstrahldaten analysieren zu können, haben wir ein neues Plugin für ImageJ entwickelt. Zunächst wurden STIM-Dichtekarten berechnet. Der Kontrast in den Rastertransmissions-Eisenmikroskopie-Bildern ist auf lokale Dichteunterschiede zurückzuführen und ermöglicht die Detektion von Zellstrukturen wie dem Zellkern und dem Zytoplasma.

Es können mehrere Maps gleichzeitig bearbeitet werden. Jedes Kennfeld entspricht der von den einfallenden Teilchen übertragenen Energie des Mediums. Der zweite Schritt der Datenanalyse besteht in der Berechnung einzelner Zellspektren.

partikelinduzierte Röntgenemissionsanalyse liefert sowohl die chemische Zusammensetzung der Probe als auch die Elementkarten der chemischen Elemente. Karten chemischer Elemente werden berechnet, nachdem die Photonen nach der Strahlposition zum Zeitpunkt der Aufzeichnung sortiert und ein Energiefenster ausgewählt wurde, das um ein bestimmtes Element zentriert ist. Karten stellen in der Regel die Anzahl der detektierten Ereignisse an der Strahlposition dar und enthalten quantitative Daten.

Es wird ein Stapel chemischer Maps berechnet, eine für jedes ausgewählte Element. Die für jede Zelle interessanten Regionen werden anhand der PIXE-Daten für Phosphor gefunden. Die Spektren, die jeder ganzen Zelle entsprechen, werden dann berechnet, indem die einzelnen Spektren über den interessierenden Bereich jeder Zelle summiert werden.

Von hier aus können quantitative Daten über die chemischen Häufigkeiten in jeder Zelle mit einer speziellen PIXE- und IBS-Analysesoftware extrahiert werden. Hier zeigen wir Fluoreszenzbilder von Zellen nach der Paraformaldehyd-Fixierung. Die obere Reihe zeigt Zellen, die keinen Titandioxid-Nanopartikeln ausgesetzt waren, während die untere Reihe dies war.

Der blaue Kanal zeigt den Zellkern, der grüne Kanal die Mitochondrien und der rote Kanal Titan. Es ist deutlich zu erkennen, dass in den Kontrollen kein Titandioxid vorhanden ist. Aus dem verschmolzenen Kanal rechts ist zu erkennen, dass Nanopartikel ausschließlich im Zytoplasma vorkommen und von den Mitochondrien ausgeschlossen sind.

Was dieser Methode jedoch fehlt, sind quantitative Informationen über die Nanopartikelkonzentration. Die nukleare Mikrosondenanalyse kann darauf hoffen, dies zu liefern. Diese Bilder wurden alle mit verschiedenen Mikrosonden-Analysetechniken aufgenommen.

Auch hier zeigt die obere Reihe die Kontrollzellen und die untere Reihe die Zellen, die Titan-Nanopartikel enthalten. Das Bild ganz links zeigt STIM-Messungen der Dichte der kryogenisch fixierten Zellen. Die folgenden drei Felder zeigen die Häufigkeit von Kalium, Phosphor und Titan in den mit PIXE gewonnenen Zellen.

Auch hier ist weder in den Kontrollen noch in den Zellkernen Titan vorhanden. Um die Aufnahme von Titan Zelle für Zelle zu quantifizieren, definieren wir auf der Grundlage der im Panel ganz rechts gezeigten Zellgrenzen die interessierenden Regionen und messen die Elementhäufigkeiten in diesen Regionen. Aus diesen PIXE-Messungen haben wir die Verteilung der Elementhäufigkeiten auf Einzelzellebene für die Kontroll- und die exponierten Populationen aufgetragen.

Die Kontrollpopulation ist weiß und die exponierte Grundgesamtheit gelb dargestellt. Der hier vorliegende mediane Gehalt an Titan ist im Vergleich zu der Expositionsdosis von vier Mikrogramm pro Quadratzentimeter recht gering. Die Bandbreite der Titanaufnahme zeigt eine große Variation in der Bevölkerung, von 0,2 Mikrogramm pro Quadratzentimeter bis zu 1,8 Mikrogramm pro Quadratzentimeter.

Wir stellten auch eine Zunahme von freien intrazellulären Ionen wie Kalium und Kalzium in Nanopartikel-exponierten Proben fest, was auf eine Veränderung der zellulären Homöostase hindeutet, die durch das Vorhandensein von Titandioxid-Nanopartikeln induziert wird. Die Analyse von Kernmikrosonden kann nützliche Informationen auf subzellulärer Ebene liefern und ermöglicht eine Quantifizierung der chemischen Elemente, aus denen eine biologische Probe besteht. Diese Techniken bieten viele Vorteile.

Erstens, in der Probenvorbereitung, die keine chemische Fixierung erfordert. Zweitens, die Möglichkeit, größere Gebiete zu untersuchen, mit der Möglichkeit, sich auf zusätzliche interessante Regionen zu konzentrieren. Drittens, die Quantifizierung chemischer Elemente mit einer Empfindlichkeit von wenigen Mikrogramm pro Gramm.

Und viertens, die Identifizierung von Zellkompartimenten wie Zellkern, Nukleolus und Zytoplasma. Die genaue Bestimmung dieser Partikel bei der Untersuchung der Internalisierung von Nanopartikeln in einzelnen Zellen ist für die quantitative Nanopartikel-Toxikologie unerlässlich. Wie in den hier untersuchten Fällen gezeigt, ermöglicht uns die Fähigkeit, Nanopartikel innerhalb einzelner Zellen zu beobachten und zu quantifizieren, ein besseres Verständnis der Wertakkumulation von endogenen und exogenen chemischen Elementen, wie z. B. Metalloxid-Nanopartikeln.

Dieses Protokoll unterstreicht die Eignung der nuklearen Mikrosondenanalyse für zukünftige Studien der Wechselwirkung von Nanopartikeln mit lebenden Zellen. Der quantitative Ansatz gibt Aufschluss über die Auswirkungen dieser Nanopartikel in Bezug auf Detektion, Identifizierung, Lokalisierung und Quantifizierung sowie auf Einzelzellebene sowohl für native als auch für chemisch modifizierte Nanopartikel.