Name: Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Kartierung von Metallen im Mausehirngewebe mittels LA-ICP-MS. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Eisen- und Zinkverteilung für neurodegenerative Forschung.

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DJH und PAD werden von einem Australian Research Council Linkage Project (LP120200081) mit Agilent Technologies und ESI GmbH Der Beitrag von BK unterstützt von der Ruhr University Research School PLUS, finanziert durch Deutschland Exzellenzinitiative [DFG GSC 98/3] unterstützt wurde. DJH wurde von der Ramaciotti Stiftung teilweise unterstützt. KK wird von der Sigrid Juselius Foundation unterstützt.

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RWH und COC sind bezahlte Mitarbeiter von ESI Ltd. FF und TPH sind bezahlte Mitarbeiter von Agilent Technologies Australia.

Bildgebungs Metalle in neurologischem Gewebe ist nur ein Beispiel dafür, wie dieses Protokoll nützliche Informationen über die Verteilung und die Mengen an Metallen in jeder biologischen Matrix zur Verfügung stellen kann. Obwohl Herstellung von Standardreferenzmaterialien beschwerlich sein kann, es ist ein Experiment, das einmal durchgeführt werden kann und für die spätere Verwendung archiviert. LA-ICP-MS hat bestimmte Vorteile gegenüber alternativen Methoden, wie Synchrotron-Röntgenfluoreszenzmikroskopie, hauptsächlich in Bezug auf Zugänglichkeit und Sensitivität. Es gibt jedoch gewisse Nachteile , die berücksichtigt werden sollten , wenn ein Experiment vorbereitet LA-ICP-MS, und als solche ist sie oft eine nützliche ergänzende Technik zur chemischen Bildgebung , die alternative Metallanalysetechniken umfasst, sowie vergleichende histochemistry 5. Die Angleichung an den bekannten anatomischen Merkmalen des Mäusegehirns können nützliche Informationen über die mögliche funktionelle relati bietenterschaft zwischen Metallebenen und die räumliche Verteilung. Bisher haben wir die Allen - Gehirn - Atlas Online - Ressource verwendet wird , 29, ist ein Open-Access - Repository beider anatomischen und Genexpressionsdaten in der C57BL / 6 - Maus Gehirn räumliche Korrelation der beiden Metall-abhängige Enzym - Expression 14 und Neuroanatomie 27 zu prüfen, 30. Andere Mittel, wie die Gehirn von Nagetieren Workbench 31 sind auch mit der Registrierung und Ausrichtung von Metallbildern zur Unterstützung in oft kleinen anatomischen Regionen in der korrekten Identifizierung der Metallverteilung zu unterstützen. Anwendungen dieser Technik sind bei der Beurteilung , wie Metallebenen und Verteilung Wechsel an der mikroskaligen in ganz normale Lebensereignisse (zB Alterung) und bei Krankheitszuständen nützlich; sowie die Untersuchung der Wirkungen der beiden metallhaltigen Verbindungen und Medikamente entwickelt me ​​Zieltal Stoffwechsel. Die aktuellen Hauptbeschränkungen von LA-ICP-MS als Technik-Bildgebung für die Metalldistribution sind Durchsatz und Empfindlichkeit räumlich zu beurteilen. Es gibt einen Kompromiss zwischen der Geschwindigkeit der Analyse und die räumliche Auflösung 5, 12, mit einer höheren Auflösung Bilder längere Analysezeiten erfordern. Die Technik ist gut geeignet, um biologische Elemente bei höheren Konzentrationen, aber Elemente wie Mangan, Kobalt und Selen aufgrund ihrer geringen Abundanz in normalem Gewebe beschränkt sind und / oder Einschränkungen in ihrer Detektion durch herkömmliche ICP-MS. Neue Fortschritte in ICP-MS - Technologie, wie die Einführung von Triple-Quadrupol - Massenanalysatoren, 33 zur gezielten Erfassung schwierig Analyten, wie Selen 32 bei höheren Empfindlichkeiten ermöglichen. Als technologieorientiertes Verfahren, Fortschritte in der Laser- und Massenspektrometrie-Design wird dieses Bildgebungstechnik sehen sich weiter entwickeln, zu erhöhendie Geschwindigkeit der Analyse und der Empfindlichkeit 34.

Die einzigartige Redoxchemie von Metallen erleichtert eine Reihe von neurologischen Funktionen, einschließlich Signaltransduktion, Energieerzeugung und Neurotransmittersynthese. In einer Reihe von wichtigen neurodegenerativen Erkrankungen, dyshomeostasis dieser Metalle sind sowohl als potentielle neue Targets in Pathogenese der Erkrankung und identifiziert impliziert worden für die therapeutische Intervention 1. Um besser zu verstehen, wie Metalle unter Bedingungen beteiligt sind, wie Alzheimer und Parkinson-Krankheit (AD und PD bezeichnet), ist es zwingend notwendig, der Lage sein, zu messen, wie Metallverteilung und Ebenen innerhalb der Regionen ändern negativ beeinflusst durch den Krankheitsprozess. Diese Veränderungen sind oft Anzeichen für subtile Verschiebungen in den biochemischen Reaktionen , die zu den Prozessen verknüpft werden innig kann, die den Zelltod einleiten, wie unsere kürzlich vorgeschlagene Mechanismus der Eisen - und Dopamin - Neurotoxizität in PD 2. Traditionell metal Ebenen innerhalb der definierten anatomischen Regionen wurde durch eine sorgfältige Exzision, Verdauung und Analyse erreicht 3 eine Reihe von analytischen Techniken. Aber ein solcher Ansatz verliert räumlichen Informationen, die entscheidend sein kann, wenn Krankheitszuständen untersucht beinhalten kleine, gut definierte Bereiche oder spezifischen Zelltypen. Eine Reihe von analytischen Methoden sind für Metalle in biologischen Systemen, von intakten Proben Gewebeschnitten und in zwei und drei Dimensionen unter Verwendung von Emissionsspektroskopie, Fluoreszenzsonden und Massenspektrometrie 4 visualisieren. Jede Technik hat Vorteile und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, Selektivität der chemischen Spezies, und die räumliche Auflösung, die erreicht werden kann. Für einen umfassenden Überblick über die Palette von Techniken zur Verfügung, siehe die Übersicht von Hare et al. 5. Die Massenspektrometrie (MS) -basierte Methoden der empfindlichste dieser Techniken sind, Lage , die meisten biologisch relevanten Metalle in ihrer nativen Konzentration 6 zu messen. Laser-Ablation - induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) Bildgebung verwendet einen fokussierten UV-Laserstrahl in einer Größe von 1 bis&gt; 100 &amp; mgr; m im Durchmesser (oder Breite, wenn ein Viereck Strahlform verwendet wird), unter denen die Probe 7 bestanden. Quantitative Informationen können über die repräsentative Ablation von Standardreferenzmaterialien erreicht werden, die 8 mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Ansätzen hergestellt werden können, die jeweils mit unterschiedlichem Grad der technischen Schwierigkeiten und analytische Funktionalität. Die am häufigsten verwendete Ansatz verwendet Matrix-Matching, wo ein Standard mit einer vorherrschenden chemischen Zusammensetzung vergleichbar mit der von der Probe durch Spicken mit dem Ziel - Analyten hergestellt wird und für die Homogenität und absolute Metallkonzentration durch unabhängige analytische Mittel genau beurteilt 9, </sup&gt; 10. Ablation der zubereiteten Standards können dann für die externe Kalibrierungszwecke verwendet werden, Konzentrationsdaten aus der erhaltenen Probenbildes ermöglicht pro Pixel extrahiert werden. Die Bildauflösung wird sowohl durch die Strahlgröße und die Geschwindigkeit, mit der die Probe abgetastet wird, bestimmt. Die Standard - Quadrupol-Design ICP-MS (die mehr als 90% aller Systeme ICP-MS installiert Konto weltweit 11) ist eine sequentielle Massenanalysator ist , daß der Massendetektor Zyklen durch alle ausgewählten Masse-Ladungs - Verhältnis (m / z ) und nicht gleichzeitig Daten sammeln. Somit muß die Erfassungszeit für jeden Zyklus der Massen auf die Zeit für die Probe entnommen gleichsetzen eine Breite des Laserstrahls zu durchqueren ein Pixel repräsentativ für die gewünschte Auflösung zu gewährleisten 12 erfasst. Laserstrahlgrößenauswahl ist ein wichtiger Parameter, der auf beide erhebliche Auswirkungen hat Empfindlichkeit und Gesamtanalysezeit. Als physi Laserablationmatisch entfernt Material, das die Menge der Materie der ICP-MS von einem Argonträgergas transportiert wird, die von dem Massenanalysator folgt dem inversen quadratischen Gesetz physikalisch nachgewiesen werden kann. Beispielsweise die Verringerung der Laserstrahldurchmesser von 50 bis 25 &amp; mgr; m führt zu einer Verringerung des abgetragenen Materials um einen Faktor von vier. Zusätzlich als Scanverfahren, erhöhen kleinere Strahldurchmesser die Gesamtzeit, einen ausgewählten Bereich abzutragen erforderlich. Daher ist experimentelles Design unerlässlich, um die notwendige räumliche Auflösung mit Empfindlichkeit Bedürfnisse und Zeitvorgaben zu balancieren. Imaging von LA-ICP-MS wurde auf eine Reihe von Proben, Matrizen und Krankheitszuständen angewendet, einschließlich Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 13, 14, Schädel - Hirn - Verletzung 15, die Verteilung von metallhaltigen Krebsmedikamente 16, toxicant Exposition in der Plazenta 17 und Metall distribution in Zähne als Biomarker der frühen Lebensnahrungsübergänge. 18 In diesem Protokoll beschreiben wir ein allgemeines Verfahren zum Abbilden Eisen, Kupfer und Zink in der WT Mausgehirn bei einer Auflösung von 30 &amp; mgr; m, obwohl es leicht zu einer Reihe von Probentypen und experimentelle Ergebnisse angepasst werden kann, basierend auf den Bedürfnissen des Analytiker.

<table><tbody><tr><td>Sodaglas-Objektträger</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Typische Objektträger eignen sich für alle Experimente</td></tr><tr><td>PTFE-beschichtete Mikrotomklingen</td><td>C.L. Stuckey</td><td>DT315R50</td><td>Die Klingengröße hängt vom Kryostat-Klingenhalter ab. Überprüfen Sie vor der Bestellung.</td></tr><tr><td>Parafomaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Jeder Lieferant geeignet</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Kommerzieller Weißzucker ist geeignet</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Vorgemischte Beutel aufgeführt, kann nach normalen Laborprotokollen hergestellt werden</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247624</td><td>Jeder Lieferant geeignet</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Jeder Lieferant geeignet</td></tr><tr><td>Lammhirn</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Erhältlich bei den meisten lokalen Metzgern</td></tr><tr><td>Metallsalze</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Verwenden Sie wasserlösliche Metallsalze, die die gewünschten Analyten enthalten</td></tr><tr><td>Omni TH Tissue Homogenisator</td><td>Omni Inc</td><td>THP115</td><td>Alternative Homogenisatoren sind geeignet</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Homgenizer-Sonden</td><td>Omni Inc</td><td>TH115-PCRH</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenaufschlussgerät</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Optional. Siehe Abschnitt 2</td></tr>: <tr><td>1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen</td><td>TechnoPlas</td><td>P4010</td><td>Metallfreie Polypropylen-Röhrchen. Säuregewaschene Röhrchen sind auch geeignet</td></tr><tr><td>65% Salpetersäure</td><td>Merk Millipore</td><td>100441</td><td>Spurenanalytik Klasse</td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95321</td><td>Spurenanalytik Klasse</td></tr><tr><td>10 x 10 mm Einweg-Kryoformen</td><td>Ted Pella</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76871</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Verwendung lokaler Lieferant</td></tr><tr><td>NWR213 Laser Ablation system</td><td>ESI Ltd</td><td>n/a</td><td>Wird in diesen Experimenten verwendet. Andere Hersteller sind geeignet, können Änderungen am Protokoll erfordern</td></tr><tr><td>Agilent 8800 Serie ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>n/a</td><td>In diesen Experimenten verwendet. Andere Hersteller sind geeignet, können Änderungen am Protokoll verlangen</td></tr><tr><td>Iolite</td><td>Iolite Software</td><td>n/a</td><td>Verfügbar ab http://iolite-software.com/. Andere Methoden stehen zur Verfügung, siehe Protokoll</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wave Metrics</td><td>n/a</td><td>Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm</td></tr></tbody></table>

imaging metals im hirngewebe durch laserablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (la-icp-ms)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metalle sind ubiquitär im gesamten Organismus, mit ihrer biologischen Rolle diktiert durch beide ihre chemische Reaktivität und Fülle innerhalb eines bestimmten anatomischen Region gefunden. Im Gehirn haben Metalle eine hoch compartmentalized Verteilung in Abhängigkeit von der primären Funktion, die sie innerhalb des zentralen Nervensystems spielen. Abbilden der räumlichen Verteilung von Metallen ist vorgesehen einzigartigen Einblick in die biochemische Architektur des Gehirns, die eine direkte Korrelation zwischen neuroanatomischen Regionen und ihre bekannte Funktion im Hinblick auf metallabhängigen Prozessen. Darüber hinaus verfügen einige altersbedingte neurologische Erkrankungen Metall Homöostase gestört, was oft zu kleine Bereiche des Gehirns beschränkt ist, die sonst nur schwer zu analysieren. Hier beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur quantitativen Metalle in der Maus Bildgebung des Gehirns, Laser-Ablation unter Verwendung von - induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) und speziell für die BildverarbeitungSoftware. Die Konzentration auf Eisen, Kupfer und Zink, die im Gehirn drei der am häufigsten vorkommenden und krankheitsrelevanten Metalle sind, beschreiben wir die wesentlichen Schritte bei der Probenvorbereitung, Analyse, quantitative Messungen und Bildverarbeitung zur Herstellung von Karten der Metallverteilung innerhalb des niedrigen Mikrometer Auflösungsbereich. Diese Technik, die für jeden Abschnitt geschnittenen Gewebes der Lage ist, die hoch variable Verteilung der Metalle in einem Organ oder System zeigt, und kann verwendet werden, um die Veränderungen der Metall Homöostase und absolute Ebenen innerhalb feinen anatomischen Strukturen.

Um die Möglichkeiten dieser LA-ICP-MS-Bildgebung Ansatz demonstrieren, ein einfaches Experiment, einen Abschnitt eines WT C57BL / 6-Maus Gehirn, halbierten im Corpus callosum und geschnitten in der koronalen Ebene verwendet wird, wird vorgestellt. Ein Workflow für die Analyse von Daten Biolite (Abbildung 1), wie zum Bereitstellen ein repräsentatives Bild von Metallverteilung im Abschnitt analysiert (Abbildung 2) auch in den Abschnitten 6 und 7 als gut beschrieben. Wie gesehen werden kann, Metallverteilung im Gehirn der Maus ist variabel entsprechend anatomischen Region. Dies kann auf die variable Rollen Metalle zugeschrieben werden, und insbesondere die Proteine , an die sie gebunden sind, 27 in jeder Region des Gehirns spielen. Zum Beispiel neigt Eisen höheren Konzentrationen in der Mittelhirns zu haben und entlang des Gyrus dentatus, während Zink am häufigsten in der Cortical Bereiche. Carbon, die eine häufig verwendete interne Standard - 8 ist, ist homogen verteilt. Elementar Karten (Figur 2) kann besonders nützlich sein , wenn sie in Verbindung mit vorhandenen anatomischen und funktionellen Referenz Atlanten 29 verwendet, wobei Informationen über die Kolokalisation von Metallen kann die Expression spezifischer metallbindenden Proteinen Einblick in die Funktion von Metallen in einem Gehirn liefern kann Region oder Änderungen der Metallebenen im Einklang mit einer krankheitsbedingten Biomolekül identifiziert. Unter Verwendung der Vorgehensweise beschrieben, die für ein breiteres Spektrum von Analyten optimiert ist, hat die Empfindlichkeit für niedrige entgegen Überfluß Elemente wie Mangan, und Verfahren angepasst werden kann, in erster Linie auf dieses Analyten zu konzentrieren, indem auf Kosten der anderen gemessenen Massen Verweilzeiten erhöhen. Der große Vorteil bei der Verwendung von Imaging-LA-ICP-MS beobachtet relativen Unterschiede in Metall concentration und Verteilung zwischen den Versuchsgruppen. Wir haben früher eine solche Technik zu demonstrieren erhöhten Eisen nach einem Neurotoxin Insult nachahmt PD 2, 10, und Veränderungen in cortical Eisenspiegel in menschlichen Alzheimer-Krankheit Gewebe 21 verwendet. Ein solches Protokoll, wie hier beschrieben werden, können auf andere Gewebetyp mit minimalen Änderungen an den aufgeführten Verfahren leicht angepasst werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow für die Bildverarbeitung. Workflow-komplementär zu den Abschnitten 6 und 7, der Darstellung Umwandlung von Roh-zeitaufgelöste Daten von der ICP-MS auf quantitative Bilder von Metallverteilung im Gehirn der Maus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig2.jpg" /> Abbildung 2: Typische Elementverteilung von Biometalle innerhalb eines Mäusegehirns. Repräsentative Element Karten eines 30 um dicken koronalen Abschnitt einer einzelnen Maus Gehirnhemisphäre analysiert mit LA-ICP-MS. Bilder für Kohlenstoff-13 (C13), Magnesium-24 (MG24) und Phosphor-31 (S31) angezeigt in Gold-Farbskalen (Zählungen pro Sekunde; CPS) (obere Reihe). Quantitative Bilder (untere Reihe) für Mangan-55 (MN55), Kupfer-63 (Cu63), Eisen-56 (Fe56) und Zink-66 (Zn66) angezeigt mit entsprechenden BlueHot Farbskalen (ug g -1). Gesamtanalysezeit für das Gehirn Schnitt betrug etwa 5 h. Maßstabsbalken = 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <strong&gt; Zusatzcode 1. Open Source Python - Code - Datei in 6.1 beschrieben, die einen entsprechenden Python - Editor nach ICP-MS Hersteller Methode der Datenausgabe kann geändert werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/CopyFilesFromSubDirs_3.txt" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/CopyFilesFromSubDirs_3.txt" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Quantitativ Metalle in Gewebe durch Laserablation Kartierung - induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) ist eine empfindliche analytische Technik, die in neue Erkenntnisse liefern kann, wie Metalle in normaler Funktion und Krankheitsprozessen teilzunehmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Metalle in dünnen Schnitten von Mausgewebe neurologischen Bildgebung.

Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die räumliche Verteilung von Metallen in Gewebeschnitten mittels Laserablation mit gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie zu quantifizieren. Diese Methode kann zentrale Fragen der Grundlagenforschung und der Krankheitsforschung beantworten, insbesondere bei Erkrankungen, bei denen die Metallbiochemie in die Krankheitspathologie involviert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie räumliche Informationen über Metalle erhält, die bei traditionellen Gesamtmetall-Analyseverfahren normalerweise verloren gehen.Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie und Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, da sie es uns ermöglicht, zu überwachen, wie sich Metalle in Hirnregionen verändern, die Zelltod aufweisen. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, wenn sie diese langen und komplexen Experimente aufbauen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Planung des Experiments und die Analyse der Daten herausfordernd sein können, weil jeder Schritt in einer bestimmten Reihenfolge ausgeführt werden muss.Platzieren Sie zuerst eine Gehirngewebeprobe und alle matrixangepassten Gewebestandards in der Laserablationskammer. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben innerhalb der Schärfentiefe der LACCD-Kamera befinden. Schließen Sie die Kammertür und ziehen Sie die Schrauben mit den Fingern fest. Dann im ICPMS-Software das Tragasventil öffnen und die Durchflussrate auf 1,2 Liter pro Minute einstellen. In der LA-Software eine 30-minütige Spülung der Ablationszelle mit dem Tragas durchführen. Bei einer Ablationszelle mit zwei Volumina alle zehn Minuten den Probenhalter in jede Ecke der Kammer bewegen, um die Menge an restlicher Luft in der Zelle zu verringern.Schalten Sie das ICPMS ein und lassen Sie das Gerät zwei Stunden lang aufwärmen. Während das Gerät aufwärmt, zeichnen Sie in der Lasersablations-Software eine etwa drei Millimeter lange Ablationslinie über die Oberfläche des ersten Gewebestandards. Klicken Sie die Ablationslinie an und stellen Sie den Standard-Strahldurchmesser, die Scan-Geschwindigkeit und die Strahlungsfluenz ein.Wiederholen Sie die Linie sechs Mal, wobei der Abstand zwischen den Linien dem Strahldurchmesser entspricht. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard. Verwenden Sie dann das Linienwerkzeug, um den Ablationsbereich über die Probe vom oberen linken Eckpunkt entlang des breitesten Punkts der Probe mit denselben Parametern wie bei den Standards zu zeichnen.Vervielfachen Sie die Linie nach Bedarf, um eine vollständige Abdeckung der Probe mit dem gleichen Abstand wie bei den Standards zu erreichen. Zeichnen Sie anschließend einen Satz von Linien für die intermittierende Abtastung der Standards spätestens nach 20 Stunden Abtastung der Probe oder zwischen jeder Probe. Fügen Sie am Ende des Experiments eine Abtastung der Standards hinzu.Bestimmen Sie anhand der Linienlänge und der Abtastgeschwindigkeit die Analysezeit für die Proben- und Standardlinien. Erstellen Sie anschließend eine neue Charge in der ICP-MS-Software und wählen Sie die zeitlich aufgelöste Analyse aus. Wählen Sie die gewünschten Werte für das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis aus und legen Sie die Integrationszeiten für jedes Verhältnis so fest, dass die gesamte Integrationszeit für einen Zyklus 0,25 Sekunden beträgt.Speichern Sie den Batch. Füllen Sie bei einem Standard-Batch die Analysezeit für jede Linie unter Hinzufügung eines zusätzlichen Puffers von 15 Sekunden aus, um die Aufwärm- und Spülzeiten des Lasers zu berücksichtigen. Legen Sie eine Probelaufliste mit einer Erfassung für jede Standardlinie fest.Verdoppeln Sie für die Probencharge die Standardcharge und passen Sie die Zeiten und die Anzahl der Akquisitionen entsprechend dem Abtragungsmuster der Probe an. Sobald das ICPMS aufgewärmt ist, fügen Sie die erste Charge der Warteschlange hinzu und stellen Sie sicher, dass die Software auf ein Signal vom LA-Gerät wartet. Schalten Sie anschließend in der LA-Software die Laserstromversorgung ein und stellen Sie die Laser-Aufwärm- und Spülzeiten ein.Starten Sie die Lasersequenz, und überprüfen Sie, ob das ICP-MS nach der Ablation korrekt mit der Datensammlung beginnt. Sobald die Daten gesammelt wurden, extrahieren Sie die Daten für die Standards aus den CSV-Dateien. Führen Sie die Baseline-Korrektur für die Zugkräfte durch, und schließen Sie das Hintergrundsignal aus.Identifizieren Sie Signalabfälle, die durch Löcher in den Gewebestandards verursacht werden. Maskieren Sie diese Bereiche mit niedrigem Signal und exportieren Sie anschließend die Daten als Tabellenkalkulation. Berechnen Sie einen Umrechnungsfaktor von CPS in PPM für jedes identifizierte Element.Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard. Öffnen Sie anschließend die Software zur quantitativen Bildkonstruktion und importieren Sie die Probendaten aus den CSV-Dateien. Wählen Sie mehrere Bereiche des Hintergrunds aus, um eine Hintergrundkorrektur anzuwenden.Wählen Sie das Diagrammbearbeitungswerkzeug aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie „Bild Darstellung ändern“. Ändern Sie die erste Farbe bei Z auf einen großen negativen Wert und klicken Sie auf Fertig, um das Hintergrundsignal zu verstärken. Geben Sie dann im Reiter „Standards“ die CPS-PPM-Korrekturfaktoren für jeden Standard ein und klicken Sie auf Los.Öffnen Sie den Datenbrowser im Daten-Tab, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine korrigierte Bilddatei und wählen Sie „neues Bild“. Öffnen Sie das Fenster zur Bildanzeige bearbeiten und stellen Sie die Farbtabelle und Skala ein. Verwenden Sie das Hilfsprogramm „Anmerkung hinzufügen“, um eine Farbskala auf das Bild zu setzen.Passen Sie die Farbskala im Farbskalafenster an. Sobald das Bild eingefärbt und annotiert wurde, kopieren und fügen Sie das Bild entweder in ein anderes Programm ein oder exportieren Sie das Bild aus der Bildverarbeitungssoftware. Um die ROI-Werkzeuge zu aktivieren, wählen Sie Bildverarbeitung aus den Analysepaketen und wählen Sie ein Bild aus.Klicken Sie im Bild-Tab auf ROI und beginnen Sie mit der ROI-Zeichnung. Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und klicken Sie dann auf ROI abschließen. Klicken Sie im Bild-Tab auf Statistiken, um die ROI-Daten zu erhalten.Kopieren und fügen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation ein, wobei sichergestellt werden muss, dass jeder ROI beim Hinzufügen gespeichert wird. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf. Der Metallgehalt und die Verteilung im Gehirn einer Wildtyp-Maus wurden mit dieser Technik untersucht.Hier werden die Verteilungen von Kohlenstoff, Magnesium und Phosphor in Zählraten pro Sekunde dargestellt. Quantitative Bilder werden für Mangan, Kupfer, Eisen und Zink gezeigt. Die Verteilung von Kohlenstoff wurde als interner Standard verwendet.Eisen war im Mittelhirn und im Gyrus dentatus am häufigsten vorhanden. Zink war in den kortikalen Bereichen am häufigsten vorhanden. Die Informationen aus diesen Bildern können dann verwendet werden, um die Expression und Funktionalität von Metallbindungsproteinen zu verfolgen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann ein über mehrere Tage andauerndes Experiment, wenn es richtig durchgeführt wird, innerhalb einer Stunde eingerichtet werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Ihre Ablationslinien und Ihre Datendateien mit dem ICP-MS zu synchronisieren. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie histologische Färbungen an benachbarten Schnitten durchgeführt werden, um weitere Informationen zu erhalten, beispielsweise zur Kolokalisation von Metallen mit spezifischen Proteinen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir untersuchen wollten, wie sich Metallspiegel in Labor-Modellen der Parkinson-Krankheit verändern.Obwohl diese Methode zur Erforschung von Neurodegeneration genutzt werden kann, eignet sie sich auch für verschiedene Gewebetypen und Krankheitszustände, einschließlich menschlichen Gewebes und einer Vielzahl biologischer Matrizes. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Neurowissenschaften untersuchen konnten, wie sich Metallkonzentrationen sowohl in menschlichen Proben als auch in tierischen Krankheitsmodellen veränderten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man ein Laserablations-ICPMS-Experiment aufbaut.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischem Material äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen, beispielsweise durch das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eines Atmosphärendruck-Ionenquelle für die Massenspektrometrie. Im Imaging-Modus, ein mittleres Infrarot-Laser-Sonden die Verteilung der Moleküle über einen Gewebeschnitt oder einen Biofilm. Diese Technik stellt einen neuen Ansatz für die unterschiedlichsten bioanalytische Untersuchungen unter nativen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Quelle: Hare, D. J., et.al.  Bildgebung von Metallen im Hirngewebe durch Laserablation - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Verwendung der Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) zur Visualisierung und Quantifizierung von Metallverteilungen im Hirngewebe von Mäusen. Das Protokoll umfasst die Laserablation zur Erzeugung eines Aerosols aus Probenpartikeln, die Ionisierung der...

Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie zur Visualisierung von Metallen im Hirngewebe von Mäusen

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Laser-Emissionsspektroskopie an dünnen Organ-und Tumorgewebe durchgeführt erfolgreich erkannt natürlichen Elemente und künstlich injiziert Gadolinium (Gd), von Gd-Nanopartikel auf der Basis ausgestellt. Bilder von chemischen Elementen erreicht eine Auflösung von 100 um und quantitative Unter mM Empfindlichkeit. Die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder von einer gleichen biologischen Gewebes bereitzustellen.

Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe

Die Größenausschlusschromatographie mit Bindestrich mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Veränderungen in der Häufigkeit von Metalloproteinen direkt aus biologischen Proben zu messen. Hier beschreiben wir eine Reihe von Metalloprotein-Standards, die zur Abschätzung der Molekülmasse und der Menge an Metall verwendet werden, die mit unbekannten Proteinen assoziiert ist.

Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Eine massenspektrometrische Bildgebungsquelle (MSI), die bei Atmosphärendruck betrieben wird, wurde durch Kopplung von Laserdesorption im mittleren Infrarot und Elektrospray-Nachionisation entwickelt. Als energieabsorbierende Matrix wurde eine exogene Eismatrix verwendet, um die resonante Desorption von gewebebezogenem Material zu erleichtern. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung der IR-MALDESI MSI bei einer Ganzkörper-Neugeborenenmaus.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

Dieses Protokoll stellt einen Workflow für die Sub-mm-2D-Visualisierung mehrerer lamitischer anorganischer Nährstoff- und Schadstoffspezies mit diffusiven Gradienten in Dünnschichten (DGT) in Kombination mit Massenspektrometrie-Bildgebung dar. Solute Probenahme und hochauflösende chemische Analyse werden detailliert für die quantitative Kartierung von Gelösten in der Rhizosphäre von terrestrischen Pflanzen beschrieben.

Zweidimensionale Visualisierung und Quantifizierung von labilen, anorganischen Pflanzennährstoffen und Verunreinigungen im Boden

Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie...

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

Das Ziel dieser Technik ist es, Serotonin (5-HT) Neurotransmitter-Funktion im Live-und frei atmenden Tier mit pharmakologische Kernspintomographie (phMRI) und einer intravenösen Herausforderung mit einem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), Fluoxetin zu beurteilen.

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Erfahren Sie die quantitative Kartierung von Metallen im Mausehirngewebe mittels LA-ICP-MS. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Eisen- und Zinkverteilung für neurodegenerative Forschung.

Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

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