Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die räumliche Verteilung von Metallen in Gewebeschnitten mittels Laserablation mit gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie zu quantifizieren. Diese Methode kann zentrale Fragen der Grundlagenforschung und der Krankheitsforschung beantworten, insbesondere bei Erkrankungen, bei denen die Metallbiochemie in die Krankheitspathologie involviert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie räumliche Informationen über Metalle erhält, die bei traditionellen Gesamtmetall-Analyseverfahren normalerweise verloren gehen.

Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie und Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, da sie es uns ermöglicht, zu überwachen, wie sich Metalle in Hirnregionen verändern, die Zelltod aufweisen. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, wenn sie diese langen und komplexen Experimente aufbauen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Planung des Experiments und die Analyse der Daten herausfordernd sein können, weil jeder Schritt in einer bestimmten Reihenfolge ausgeführt werden muss.

Platzieren Sie zuerst eine Gehirngewebeprobe und alle matrixangepassten Gewebestandards in der Laserablationskammer. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben innerhalb der Schärfentiefe der LACCD-Kamera befinden. Schließen Sie die Kammertür und ziehen Sie die Schrauben mit den Fingern fest.

Dann im ICPMS-Software das Tragasventil öffnen und die Durchflussrate auf 1,2 Liter pro Minute einstellen. In der LA-Software eine 30-minütige Spülung der Ablationszelle mit dem Tragas durchführen. Bei einer Ablationszelle mit zwei Volumina alle zehn Minuten den Probenhalter in jede Ecke der Kammer bewegen, um die Menge an restlicher Luft in der Zelle zu verringern.

Schalten Sie das ICPMS ein und lassen Sie das Gerät zwei Stunden lang aufwärmen. Während das Gerät aufwärmt, zeichnen Sie in der Lasersablations-Software eine etwa drei Millimeter lange Ablationslinie über die Oberfläche des ersten Gewebestandards. Klicken Sie die Ablationslinie an und stellen Sie den Standard-Strahldurchmesser, die Scan-Geschwindigkeit und die Strahlungsfluenz ein.

Wiederholen Sie die Linie sechs Mal, wobei der Abstand zwischen den Linien dem Strahldurchmesser entspricht. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard. Verwenden Sie dann das Linienwerkzeug, um den Ablationsbereich über die Probe vom oberen linken Eckpunkt entlang des breitesten Punkts der Probe mit denselben Parametern wie bei den Standards zu zeichnen.

Vervielfachen Sie die Linie nach Bedarf, um eine vollständige Abdeckung der Probe mit dem gleichen Abstand wie bei den Standards zu erreichen. Zeichnen Sie anschließend einen Satz von Linien für die intermittierende Abtastung der Standards spätestens nach 20 Stunden Abtastung der Probe oder zwischen jeder Probe. Fügen Sie am Ende des Experiments eine Abtastung der Standards hinzu.

Bestimmen Sie anhand der Linienlänge und der Abtastgeschwindigkeit die Analysezeit für die Proben- und Standardlinien. Erstellen Sie anschließend eine neue Charge in der ICP-MS-Software und wählen Sie die zeitlich aufgelöste Analyse aus. Wählen Sie die gewünschten Werte für das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis aus und legen Sie die Integrationszeiten für jedes Verhältnis so fest, dass die gesamte Integrationszeit für einen Zyklus 0,25 Sekunden beträgt.

Speichern Sie den Batch. Füllen Sie bei einem Standard-Batch die Analysezeit für jede Linie unter Hinzufügung eines zusätzlichen Puffers von 15 Sekunden aus, um die Aufwärm- und Spülzeiten des Lasers zu berücksichtigen. Legen Sie eine Probelaufliste mit einer Erfassung für jede Standardlinie fest.

Verdoppeln Sie für die Probencharge die Standardcharge und passen Sie die Zeiten und die Anzahl der Akquisitionen entsprechend dem Abtragungsmuster der Probe an. Sobald das ICPMS aufgewärmt ist, fügen Sie die erste Charge der Warteschlange hinzu und stellen Sie sicher, dass die Software auf ein Signal vom LA-Gerät wartet. Schalten Sie anschließend in der LA-Software die Laserstromversorgung ein und stellen Sie die Laser-Aufwärm- und Spülzeiten ein.

Starten Sie die Lasersequenz, und überprüfen Sie, ob das ICP-MS nach der Ablation korrekt mit der Datensammlung beginnt. Sobald die Daten gesammelt wurden, extrahieren Sie die Daten für die Standards aus den CSV-Dateien. Führen Sie die Baseline-Korrektur für die Zugkräfte durch, und schließen Sie das Hintergrundsignal aus.

Identifizieren Sie Signalabfälle, die durch Löcher in den Gewebestandards verursacht werden. Maskieren Sie diese Bereiche mit niedrigem Signal und exportieren Sie anschließend die Daten als Tabellenkalkulation. Berechnen Sie einen Umrechnungsfaktor von CPS in PPM für jedes identifizierte Element.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard. Öffnen Sie anschließend die Software zur quantitativen Bildkonstruktion und importieren Sie die Probendaten aus den CSV-Dateien. Wählen Sie mehrere Bereiche des Hintergrunds aus, um eine Hintergrundkorrektur anzuwenden.

Wählen Sie das Diagrammbearbeitungswerkzeug aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie „Bild Darstellung ändern“. Ändern Sie die erste Farbe bei Z auf einen großen negativen Wert und klicken Sie auf Fertig, um das Hintergrundsignal zu verstärken. Geben Sie dann im Reiter „Standards“ die CPS-PPM-Korrekturfaktoren für jeden Standard ein und klicken Sie auf Los.

Öffnen Sie den Datenbrowser im Daten-Tab, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine korrigierte Bilddatei und wählen Sie „neues Bild“. Öffnen Sie das Fenster zur Bildanzeige bearbeiten und stellen Sie die Farbtabelle und Skala ein. Verwenden Sie das Hilfsprogramm „Anmerkung hinzufügen“, um eine Farbskala auf das Bild zu setzen.

Passen Sie die Farbskala im Farbskalafenster an. Sobald das Bild eingefärbt und annotiert wurde, kopieren und fügen Sie das Bild entweder in ein anderes Programm ein oder exportieren Sie das Bild aus der Bildverarbeitungssoftware. Um die ROI-Werkzeuge zu aktivieren, wählen Sie Bildverarbeitung aus den Analysepaketen und wählen Sie ein Bild aus.

Klicken Sie im Bild-Tab auf ROI und beginnen Sie mit der ROI-Zeichnung. Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und klicken Sie dann auf ROI abschließen. Klicken Sie im Bild-Tab auf Statistiken, um die ROI-Daten zu erhalten.

Kopieren und fügen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation ein, wobei sichergestellt werden muss, dass jeder ROI beim Hinzufügen gespeichert wird. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf. Der Metallgehalt und die Verteilung im Gehirn einer Wildtyp-Maus wurden mit dieser Technik untersucht.

Hier werden die Verteilungen von Kohlenstoff, Magnesium und Phosphor in Zählraten pro Sekunde dargestellt. Quantitative Bilder werden für Mangan, Kupfer, Eisen und Zink gezeigt. Die Verteilung von Kohlenstoff wurde als interner Standard verwendet.

Eisen war im Mittelhirn und im Gyrus dentatus am häufigsten vorhanden. Zink war in den kortikalen Bereichen am häufigsten vorhanden. Die Informationen aus diesen Bildern können dann verwendet werden, um die Expression und Funktionalität von Metallbindungsproteinen zu verfolgen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann ein über mehrere Tage andauerndes Experiment, wenn es richtig durchgeführt wird, innerhalb einer Stunde eingerichtet werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Ihre Ablationslinien und Ihre Datendateien mit dem ICP-MS zu synchronisieren. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie histologische Färbungen an benachbarten Schnitten durchgeführt werden, um weitere Informationen zu erhalten, beispielsweise zur Kolokalisation von Metallen mit spezifischen Proteinen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir untersuchen wollten, wie sich Metallspiegel in Labor-Modellen der Parkinson-Krankheit verändern.

Obwohl diese Methode zur Erforschung von Neurodegeneration genutzt werden kann, eignet sie sich auch für verschiedene Gewebetypen und Krankheitszustände, einschließlich menschlichen Gewebes und einer Vielzahl biologischer Matrizes. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Neurowissenschaften untersuchen konnten, wie sich Metallkonzentrationen sowohl in menschlichen Proben als auch in tierischen Krankheitsmodellen veränderten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man ein Laserablations-ICPMS-Experiment aufbaut.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischem Material äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen, beispielsweise durch das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.