Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)
22. Januar 2017
Quantitativ Metalle in Gewebe durch Laserablation Kartierung - induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) ist eine empfindliche analytische Technik, die in neue Erkenntnisse liefern kann, wie Metalle in normaler Funktion und Krankheitsprozessen teilzunehmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Metalle in dünnen Schnitten von Mausgewebe neurologischen Bildgebung.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die räumliche Verteilung von Metallen in Gewebeschnitten mittels Laserablation Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma zu quantifizieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen sowohl der Grundlagenbiologie als auch der Krankheitsforschung beantworten, insbesondere bei Erkrankungen, bei denen die Metallbiochemie an der Krankheitspathologie beteiligt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass räumliche Informationen über Metalle gespeichert werden, die traditionell bei der Analyse von Moormetallen verloren gehen.
Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, da sie es uns ermöglicht, zu überwachen, wie sich Metalle in Gehirnregionen verändern, die Zelltod aufweisen. Im Allgemeinen können Menschen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, diese langen und komplexen Experimente durchzuführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Gestaltung des Experiments und die Analyse der Daten eine Herausforderung darstellen können, da jeder Schritt in einer bestimmten Reihenfolge ausgeführt werden muss.
Legen Sie zunächst eine Gehirngewebeprobe und alle mit der Matrix übereinstimmenden Gewebestandards in die Laserablationskammer. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben innerhalb der Schärfentiefe der LACCD-Kamera befinden. Schließen Sie die Kammertür und ziehen Sie die Schrauben mit den Fingern fest.
Öffnen Sie dann in der ICPMS-Software das Trägergasventil und stellen Sie die Durchflussmenge auf 1,2 Liter pro Minute ein. Führen Sie in der LA-Software eine 30-minütige Spülung der Ablationszelle mit dem Trägergas durch. Bei einer Ablationszelle mit zwei Volumina wird der Probentisch alle zehn Minuten in jede Ecke der Kammer gebracht, um die Restluftmenge in der Zelle zu reduzieren.
Schalten Sie das ICPMS ein und lassen Sie das Gerät zwei Stunden lang aufwärmen. Während sich das Instrument aufwärmt, zeichnet die Laserablationssoftware eine etwa drei Millimeter lange Ablationslinie über die Oberfläche des ersten Gewebestandards. Klicken Sie auf die Ablationslinie und legen Sie den Standardstrahldurchmesser, die Scangeschwindigkeit und die Strahlungsfluenz fest.
Duplizieren Sie die Linie sechsmal, und halten Sie den Abstand zwischen den Linien um den Balkendurchmesser fest. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Norm. Verwenden Sie dann das Linienwerkzeug, um den Ablationsbereich über der Probe von der oberen linken Ecke über den breitesten Punkt der Probe zu zeichnen, wobei Sie die gleichen Parameter wie in den Standards verwenden.
Duplizieren Sie die Linie nach Bedarf, um eine vollständige Abdeckung der Probe mit dem gleichen Abstand wie in den Standards zu erzielen. Zeichnen Sie dann einen Satz Linien für das intermittierende Scannen der Standards spätestens 20 Stunden nach dem Scannen der Probe oder zwischen den einzelnen Proben. Fügen Sie am Ende des Experiments einen Scan der Standards hinzu.
Bestimmen Sie anhand der Zeilenlänge und der Scangeschwindigkeit die Analysezeit für die Proben- und Normleitungen. Erstellen Sie dann einen neuen Stapel in der ICPMS-Software und wählen Sie Zeitaufgelöste Analyse. Wählen Sie die interessierenden Werte für das Verhältnis von Masse zu Ladung aus, und legen Sie die Integrationszeiten für jedes Verhältnis fest, sodass die Gesamtintegrationszeit für einen Zyklus 0,25 Sekunden beträgt.
Speichern Sie den Stapel. Füllen Sie für eine Standardcharge die Analysezeit für jede Linie mit einem zusätzlichen Puffer von 15 Sekunden aus, um die Aufwärm- und Auswaschzeiten des Lasers zu berücksichtigen. Legen Sie eine Beispiellaufliste mit einer Erfassung für jede Normzeile fest.
Duplizieren Sie für die Beispielcharge die Standardcharge, und passen Sie die Zeiten und die Anzahl der Aufnahmen entsprechend für das Probenablationsmuster an. Sobald das ICPMS aufgewärmt ist, fügen Sie der Warteschlange die erste Charge hinzu und stellen Sie sicher, dass die Software auf einen Trigger vom LA-Instrument wartet. Schalten Sie dann in der LA-Software die Laserstromversorgung ein und stellen Sie die Aufwärm- und Auswaschzeiten des Lasers ein.
Starten Sie die Lasersequenz und überprüfen Sie, ob das ICPMS die Datenerfassung nach der Ablation korrekt startet. Nachdem die Daten gesammelt wurden, extrahieren Sie die Daten für die Standards aus den CSV-Dateien. Führen Sie Grundlinien der Traktion durch und schließen Sie das Hintergrundsignal aus.
Identifizieren Sie Signalverluste, die durch Löcher in den Gewebestandards verursacht werden. Maskieren Sie diese Bereiche mit niedrigem Signal, und exportieren Sie die Daten dann als Tabelle. Berechnen Sie für jedes identifizierte Element einen Umrechnungsfaktor von CPS in PPM.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Norm. Öffnen Sie als Nächstes die Software zur quantitativen Bildkonstruktion und importieren Sie die Beispieldaten aus den CSV-Dateien. Wählen Sie mehrere Bereiche des Hintergrunds aus, um die Hintergrundkorrektur anzuwenden.
Wählen Sie das Diagrammbearbeitungswerkzeug aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Bilddarstellung ändern. Ändern Sie die erste Farbe bei Z in einen großen negativen Wert und klicken Sie auf Fertig, um das Hintergrundsignal zu verbessern. Geben Sie dann auf der Registerkarte Standards die CPS PPM-Korrekturfaktoren für jeden Standard ein und klicken Sie auf Go.
Öffnen Sie den Datenbrowser auf der Registerkarte Daten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine korrigierte Bilddatei und klicken Sie auf Neues Bild. Öffnen Sie das Fenster zum Ändern des Bilderscheinungsbilds und legen Sie die Farbtabelle und den Maßstab fest. Verwenden Sie das Dienstprogramm zum Hinzufügen von Anmerkungen, um eine Farbskala auf dem Bild zu platzieren.
Passen Sie die Farbskala im Farbskalenfenster an. Nachdem das Bild koloriert und mit Anmerkungen versehen wurde, kopieren Sie das Bild entweder und fügen Sie es in ein anderes Programm ein oder exportieren Sie das Bild aus der Bildkonstruktionssoftware. Um die ROI-Tools zu aktivieren, wählen Sie die Bildverarbeitung aus den Analysepaketen aus und wählen Sie ein Bild aus.
Klicken Sie auf der Registerkarte "Bild" auf "ROI" und starten Sie die ROI-Zeichnung. Wählen Sie den gewünschten Bereich aus und klicken Sie dann auf ROI abschließen. Klicken Sie auf der Registerkarte "Bild" auf "Statistiken", um die ROI-Daten abzurufen.
Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass sie gespeichert werden, wenn jeder ROI hinzugefügt wird. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf. Der Metallgehalt und die Verteilung eines Wildtyp-Mausgehirns wurden mit dieser Technik untersucht.
Hier werden die Verteilungen von Kohlenstoff, Magnesium und Phosphor in Zählungen pro Sekunde dargestellt. Quantitative Bilder werden für Mangan, Kupfer, Eisen und Zink gezeigt. Als interner Standard wurde die Kohlenstoffverteilung verwendet.
Eisen war am häufigsten im Mittelhirn und im Gyrus dentatus vorhanden. Zink war in den kortikalen Bereichen am häufigsten vorhanden. Die Informationen aus diesen Bildern können dann verwendet werden, um die Expression und Funktionalität von metallbindenden Proteinen zu verfolgen. Sobald sie gemeistert sind, kann ein mehrtägiges Experiment innerhalb einer Stunde aufgebaut werden, wenn es richtig durchgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, Ihre Ablationslinien und Ihre Datendateien mit ICPMS zu synchronisieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie histologische Färbungen an benachbarten Schnitten durchgeführt werden, um zusätzliche Informationen wie die Kolokalisation von Metallen mit bestimmten Proteinen zu erhalten. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir untersuchen wollten, wie sich der Metallgehalt in Labormodellen bei der Parkinson-Krankheit verändert.
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Neurodegeneration zu gewinnen, kann sie auch für verschiedene Gewebetypen und Krankheitszustände verwendet werden, einschließlich menschlichem Gewebe und einer Reihe von biologischen Matrices. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um zu untersuchen, wie sich der Metallgehalt sowohl in menschlichen Proben als auch in Tiermodellen für Krankheiten veränderte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie Sie das ICPMS-Experiment mit Laserablation einrichten können.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischem Material äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur quantitativen Abbildung von Metallen in neurologischem Gewebe von Mäusen mittels Laserablation mit gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) vor. Diese empfindliche Methode liefert Einblicke in die Verteilung von Metallen im Zusammenhang mit normalen Funktionen und Krankheitsprozessen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Analysenchemie
- Metallomik
Hintergrund
- LA-ICP-MS bewahrt räumliche Informationen über Metalle, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden.
- Das Verständnis der Metallbiochemie ist entscheidend für die Krankheitsforschung.
- Diese Technik kann bei der Überwachung neurodegenerativer Erkrankungen helfen.
- Visuelle Demonstrationen sind entscheidend für die effektive Durchführung von Protokollen.
Zweck der Studie
- Die räumliche Verteilung von Metallen in Gewebeschnitten quantifizieren.
- Zentrale biologische Fragestellungen zum Einfluss von Metallen bei Erkrankungen beantworten.
- Das Verständnis von Metall-bindenden Proteinen im Gehirn vertiefen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Gehirngewebeproben und Standards in der Laserablationskammer.
- Einrichten der ICPMS-Software zur Datensammlung.
- Durchführung der Laserablation und Extraktion der Daten aus CSV-Dateien.
- Nutzung von Software zur Erstellung quantitativer Bilder für die Datenanalyse.
Hauptergebnisse
- Die Verteilung von Metallen wie Eisen und Zink wurde in Maushirnregionen abgebildet.
- Eisen war im Mittelhirn und im Gyrus dentatus am häufigsten vorhanden.
- Die Zinkkonzentration war in kortikalen Bereichen am höchsten.
- Quantitative Bilder lieferten Einblicke in die Funktionalität von Metallbindungsproteinen.
Schlussfolgerungen
- LA-ICP-MS ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Metallverteilung in neurologischem Gewebe.
- Mit etwas Übung kann der experimentelle Aufbau effizient durchgeführt werden.
- Diese Methode hat bedeutende Implikationen für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
LA-ICP-MS ermöglicht die ortsauflösende Metallquantifizierung in Hirngewebe und schließt damit eine wichtige Lücke in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen eine Störung der Metallhomöostase in anatomisch präzisen Regionen auftritt. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung, indem sie die Metallverteilung mit krankheitsrelevanten Signalwegen und der Proteinausprägung verknüpft und so das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen erhöht. Die Methode liefert quantitative, hochauflösende Daten, die zur mechanistischen Entwicklungsrisikominderung und zur Priorisierung von Wirkstoffportfolios für metallmodulierende Therapeutika beitragen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Verteilung von Metallen auf neuroanatomische Regionen, die mit der Krankheitspathologie assoziiert sind, abgebildet wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch Korrelation der Metallkonzentrationen mit der Expression und Aktivität metallbindender Proteine.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit, indem eine regionspezifische Metallregulationsstörung als Biomarker für frühe Krankheitsstadien identifiziert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem die Baseline-Verteilung von Metallen im Wildtyp-Gewebe etabliert wird.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare quantitative Ergebnisse (PPM), die für die Normalisierung von Assays und die Bereitschaft für die Wirkstoff-Screening unerlässlich sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen, indem Veränderungen in der Metallhomöostase erfasst werden, die auf eine gezielte Wirkmechanismus-Aktivierung hinweisen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die Übereinstimmung krankheitsrelevanter Systeme durch die Verfolgung von Metallveränderungen in Modellen der Neurodegeneration, wie beispielsweise der Parkinson-Krankheit.
- Operationaler Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente Quantifizierung von Metallen in Gewebeschnitten.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem metallerhaltige pathophysiologische Signaturmuster vor Wirksamkeitsstudien in vivo identifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie räumlich aufgelöste Metall-Daten bereitstellt, die Aufschluss über biologische Mechanismen und die Wirkungsweise von Verbindungen geben.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie eine Anreicherung von Metallen in bestimmten Regionen aufdeckt, beispielsweise Eisen im Mittelhirn und im Gyrus dentatus sowie Zink in kortikalen Arealen.
- Screening: Liefert quantifizierbare, analysenfertige Ergebnisse mit einer Auflösung im niedrigen Mikrometerbereich und ermöglicht somit reproduzierbare Abbildungen der Metallverteilung über verschiedene Probensätze hinweg.
- Analytik: Erzeugt zeitlich aufgelöste CPS-Daten, die mithilfe von Standardproben in ppm umgerechnet werden und statistische Auswertungen für den Vergleich zwischen Gruppen sowie die Bestimmung der Effektgröße ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sie eine lückenlose Verfolgung von Metallveränderungen in Krankheitsmodellen erlaubt und damit die Abstimmung von Biomarkern unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Metallabbildung in verschiedenen Gewebetypen und Krankheitszuständen und reduziert so redundante Methodenentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Mehrdeutigkeiten in metallabhängigen Wegen durch direkte räumliche Korrelation verringert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch matrixangepasste Standards und konsistente Laserablationsparameter.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine frühzeitige Erkennung von Störungen der Metallhomöostase ermöglicht wird, wodurch biologische Risiken in späten Stadien bei ZNS-Programmen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem die Zielbindung bei metallmodulierenden Strategien in krankheitsrelevanten Hirnregionen quantifiziert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Laserablationsparametern, ICP-MS-Optimierung und Interpretation von Metallomik-Daten.
- Setzt LA-ICP-MS-Geräte, Steuerung des Trägergases und Software zur Erstellung quantitativer Bilder für die Umrechnung von CPS in PPM voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Probenvorbereitung, Ablationsmustern und Hintergrundkorrekturprotokollen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Gewebedicken, elementare Zusammensetzung und Matrixeffekte zwischen Arten oder Krankheitszuständen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie Signalverlustmaskierung aufgrund der Gewebeheterogenität und die Notwendigkeit sequenzieller Ablationszyklen mit Standard-Probe-Standard, um die Genauigkeit der Quantifizierung aufrechtzuerhalten.
