Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, schnell mehrere Behandlungsbedingungen zu bewerten, die die perineurale Invasion bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich beeinflussen, mit sehr hohen Assay-Erfolgsraten und Reproduzierbarkeit. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kopf- und Halsonkologie zu beantworten, z. B. welche Faktoren die perineurale Invasion von Kopf- und Halskrebszellen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Assays schnell und reproduzierbar an einer Maus in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann.

Bevor Sie mit der Dissektion des Spinalganglions (DRG) beginnen, geben Sie frisches Medium bei Raumtemperatur in mindestens 40 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden. Machen Sie dann mit einer feinen Schere einen Längsschnitt entlang der Wirbelsäule von der Schwanzwurzel bis zum Kopf der Maus. Und teilen Sie das Gewebe unterhalb der Sakralwirbelsäule quer, indem Sie beide Seiten der Wirbelsäule bis zur Schädelbasis präparieren.

Übertragen Sie die Probe unter das Mikroskop und beobachten Sie das zervikale Ende der Wirbelsäule bei geringer Leistung. Das weiße Rückenmark ist in der Mitte eines knöchernen Rings sichtbar, der von unterschiedlichen Anteilen an perispinalen Muskeln und Weichteilen umgeben ist. Spalten Sie mit einer mikroskopisch kleinen Federschere den dorsalen oder oberen Aspekt der ersten zwei bis drei Wirbelkörper.

Verwenden Sie dann die Federwirkung der Schere, um diesen anfänglichen knöchernen Schnitt zu öffnen, um sicherzustellen, dass die Dissektion des Wirbelkörpers an der Mittellinie erfolgt. Fahren Sie in kleinen Schritten in Richtung der Sakralwirbelsäule fort und halbieren Sie die Wirbelsäule mit identischen Schnitten an der ventralen oder unteren Seite der Wirbelkörper. Legen Sie eine Hemispiden beiseite und übertragen Sie die andere Hälfte der Wirbelsäule mit der Vorderseite nach unten auf eine sterile Platte, wobei das Rückenmark an Ort und

Und verwenden Sie zwei 18-Gauge-Nadeln, um beide Enden des Hemipins auf der Polystyrol-Präparierplattform zu befestigen. Beginnend am schmaleren, zervikalen Ende, schälen Sie das Rückenmark vorsichtig von etwa vier Wirbelebenen zurück. Fassen Sie in dem Bereich, in dem die sensorischen Nerven in das DRG eintreten, vorsichtig mit einer mikroskopisch kleinen Pinzette die umgebende Faszie und schneiden Sie mit einer mikroskopisch kleinen Federschere diese Faszie und anderes Nervengewebe ab, um das DRG zu befreien.

Bei erhöhter Vergrößerung den peripheren Nerv mit der Federschere so nah wie möglich am DRG durchtrennen, um das Gewebe freizusetzen, und die proximalen Äste abschneiden. Schneiden Sie dann das DRG von verirrten Nervenfasern oder faszialen Ansätzen ab und platzieren Sie das isolierte Gewebe in einer Vertiefung der 96-Well-V-Bodenplatte. Um die halbfesten Matrixtröpfchen herzustellen, wird eine Glasvertiefungsbodenplatte aus dem Eis auf einen Eisblock unter dem Operationsmikroskop übertragen.

Setzen Sie die Spitze einer Pipette mit einem Fassungsvermögen von nicht mehr als 10 Mikrolitern in einem Winkel von 45 Grad direkt auf das Glas und geben Sie vorsichtig einen 1,5-Mikroliter-Tropfen Matrix auf das Glas. Bewegen Sie die Pipettenspitze langsam vom Glas weg, während die Matrize in die Platte einrastet. Geben Sie je einen Tropfen Matrix auf jede der vier Ecken der Platte und stellen Sie die Platte für etwa eine Minute auf eine Oberfläche mit Raumtemperatur.

Wenn die Matrize leicht steif geworden ist, legen Sie die Platte wieder in den Eisblock und schöpfen Sie das DRG mit einer geschlossenen mikroskopischen Pinzette vorsichtig mit der linken Hand auf. Übertragen Sie mit der rechten Hand vorsichtig das Nervengewebe auf die Spitze einer 21-Gauge-Nadel und führen Sie mit der Nadel das DRG vorsichtig in die Mitte des Matrixtröpfchens ein. Der DRG sollte sich leicht in die Matrize lösen lassen, um mit der Nadel zentral positioniert zu werden.

Nachdem Sie ein DRG-Stück in jeden der vier Tropfen eingesetzt haben, legen Sie die Platte für drei Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Wenn alle DRG eingebettet sind, halten Sie die Platten nacheinander in einem leichten Winkel und geben Sie langsam vier Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, auf die Platten, so dass das Medium nur allmählich mit den Matrix-DRG-Einheiten in Kontakt kommt. Stellen Sie die Platten für weitere 48 bis 72 Stunden in den Inkubator.

Wenn die Neuriten mindestens 75 % des Weges bis zum Rand der Matrix erreicht haben, saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen an, ohne die DRG-Einheiten der Matrix zu entfernen. Geben Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette und einem glatten Auslöser zwei Tropfen mit drei mal 10 Zellen pro Milliliter Medium auf jeden Matrix-DRG-Assay. Und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator.

Geben Sie nach einer Stunde vorsichtig vier Milliliter DMEM mit 10 % FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte hinzu und stellen Sie die Platten bis zur nächsten mikroskopischen Auswertung wieder in den Inkubator. Nach ihrer Dissektion und Platzierung in den Matrixtröpfchen sollte das Erscheinungsbild des Assays dem hier gezeigten matrixeingebetteten DRG ähneln. Beachten Sie, dass der DRG nicht perfekt rund ist, sondern innerhalb des Matrixtröpfchens zentriert ist, was das Auswachsen von Neuriten in 360 Grad ermöglicht.

Unmittelbar nach der Plattierung bilden die Plattenepithelzellen des Kopfes und Halses einen umlaufenden Ring um die Matrix, der sich in den nächsten zwei bis drei Tagen entlang der Neuriten ausdehnt. Zellen, die auf leere Kontrolltröpfchen plattiert sind, die nur die Matrix enthalten, teilen sich aktiv um die Matrizen, treten aber nicht in die Matrizen ein oder erstrecken sich nicht über die Oberseite. Zur Quantifizierung der perineuralen Invasion der Krebszellen werden die Bilder der Assays über eine vertikale und eine horizontale Linie in vier Quadranten unterteilt.

Für jede in jedem Quadranten beobachtete perineurale Invasionserweiterung wird dann eine Reihe von Punkten vergeben, die einen Vergleich der Einwüchsungen von Krebszellen entlang der Neuriten zwischen verschiedenen Krebszelllinien ermöglichen. Einmal gemeistert, kann die Technik zur Isolierung der Spinalganglien in weniger als zwei Stunden abgeschlossen sein, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die übermäßige Handhabung der Spinalganglien zu minimieren, da Quetschverletzungen der häufigste Grund für das Versagen des Assays sind.

Nach diesem Verfahren können die Mechanismen der perineuralen Invasion untersucht werden, was möglicherweise zur Entwicklung gezielter Therapien gegen diese Art der Weichteilinvasion führt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dorsale Wurzelganglien von einer Maus präpariert und einen Assay zur Untersuchung der perineuralen Invasion einrichtet.