Name: Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung perineuraler Invasion bei Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals mit dorsalen Wurzelganglien von Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Assays zur Erforschung invasiver Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde vollständig durch die Finanzierung des NIH durch den R21-Zuschuss "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" und den NCI T32 Training Grant "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)" unterstützt. Vielen Dank an Richard Steiman, MD, PhD und die Mitarbeiter des Labors.

1. Herstellung von Kulturmedium und Geschirr (10 min) <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in die Vertiefungen einer 96-Well-V-Bodenplatte. </li><li> Entfernen Sie eine pre-aliquotiert-Fläschchen von etwa 100 &amp; mgr; l halbfest Matrix aus dem 20 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie direkt auf dem Eis. HINWEIS: Führen Sie diese vor dem Dorsalwurzelganglion (DRG) Ernte, weil die halbfeste Matrix etwa 30 min nimmt flüssigen Zustand auf Eis zu erreichen, die für die nachfolgenden Schritte erforderlich ist. Wird der halbfest Matrix auf Eis zu allen Zeiten zu halten, wird eine schlechte Qualität der Matrix Tröpfchen führen. </li><li> Label-Glasbodenkulturen Platten mit dauerhafter Tinte, eine eindeutige Kennzeichnung in jeder der vier Ecken auf der Unterseite der Platte. Legen Sie die Platten der rechten Seite nach oben auf Eis, um die Plattenoberfläche zu kühlen. HINWEIS: Jede Maus Erträge 32 - 40 DRG, so beschriften von 1 bis 40. Es ist nicht notwendig pi vorab ChillHaustier-Tipps, wie gekühlt Tipps, um den Verlauf der Platzierung der Matrix Tröpfchen aufwärmen wird, möglicherweise Unterschiede in der Matrix Konsistenz einzuführen. </li></ol> 2. Dissection von Murine DRG (45 min) <ol><li> Euthanize eine athymische Nacktmaus gemäß spezifischen Laborprotokolle, wie beispielsweise durch die Verwendung eines CO 2 Kammer und eine Thorakotomie. </li><li> Stellen Sie die Dissektion Bereich und Mikroskop auf. Verwenden Sie die saubere, sterilisiert und flache Unterseite der Styroporbehältern für 15- oder 50-ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Darüber hinaus sind sie für die Verwendung als Sezieren Oberfläche geeignet, da sie kostengünstig sind, Einweg und ermöglichen eine Fixierung der Wirbelsäule unter Verwendung von Stiften oder Nadeln. Verwenden Sie nur sterilisierten Instrumente und Nadeln. </li><li> entlang der Wirbelsäule von der Wurzel des Schwanzes auf den Kopf der Maus mit einem Paar von geraden oder gebogenen feinen Schere Unter natürlichen Vision, einen Längsschnitt machen. </li><li> Verwenden Sie die gleiche Schere quer Kluft unter dem sacral Wirbelsäule. Präparieren Sie beide Seiten der Wirbelsäule den ganzen Weg bis zur Schädelbasis mit der Schere. An dieser Stelle dafür sorgen, dass die Halswirbelsäule kranial so weit wie möglich mit einer Schere durchtrennt wird. </li><li> Beobachten zervikalen Ende der Wirbelsäule unter dem Operationsmikroskop bei niedriger Leistung. Der weiße Rückenmark ist offensichtlich in der Mitte eines knöchernen Ring, der durch variable Mengen von paraspinalen Muskeln und Weichgewebe umgeben ist. </li><li> Teilen Sie die dorsale oder überlegen Aspekt der ersten 2 - 3 Wirbelkörper mit mikroskopisch kleinen Feder Schere. Mit Hilfe der Federwirkung der Schere, öffnen Sie diese anfängliche Knochen geschnitten, um sicherzustellen, dass die Wirbelkörper Dissektion an der Mittellinie aufgetreten. Weiterhin in kleinen Schritten in Richtung der sakralen Wirbelsäule und dann die Wirbelsäule bisect durch die identische Einschnitte auf der ventralen oder inferior Aspekt der Wirbelkörper vervollständigt. HINWEIS: Wenn der Mittellinie Präparation der knöchernen Wirbelsäule, um sicherzustellen, in einer niedrigeren DRG Ausbeute führen. </li><li> Bei this Punkt wird die Wirbelsäule in zwei Hälften geteilt. Legen Sie ein Hemi-Wirbelsäule zur Seite, mit dem Rückenmark an Ort und Stelle und nach unten auf eine sterile Platte. HINWEIS: das Rückenmark an Ort und Stelle lassen, wird die DRGs nicht austrocknen, da die DRGs tief in das Rückenmark sind. </li><li> Befestigen jedes Ende des anderen hemi-spine mit zwei 18-gauge-Nadeln auf der Polystyrol Sezieren Plattform. Beginnend am zervikalen Ende (was offensichtlich ist, weil die Wirbelsäule enger ist, sind die DRG näher aneinander, und es gibt rib Einfügungen), sanft in das Rückenmark abziehen von etwa 4 vertebralen Ebenen. </li><li> Beachten Sie die sensorischen Nerven (in der Regel zwei), die die DRG. In dem Bereich, wo die Nerven an den DRG einsetzen, greifen Sie sanft die umgebende Faszie mit mikroskopisch kleinen Zange. Präparieren und schneiden Sie diese Faszie und andere Nervengewebe mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere, um die DRG freizugeben. Sanfte Rückzug wird die DRG aus seiner Position innerhalb der knöchernen Wirbelsäule bringen. HINWEIS: Eine Erhöhung derMikroskop Leistung bei diesem Schritt ist von Vorteil. Quetschverletzung zum DRG wird signifikant das Wachstum von Neuriten begrenzen. Dies wird vermieden, indem man nie direkt auf die DRG ergreifend, sondern durch die umgebende Faszie zu erfassen. </li><li> Schneiden Sie den peripheren Nerven (der DRG hat in der Regel einen peripheren Nerven, die tief in Bezug auf die Sezieren Ansicht ist) mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere, um die DRG zu lösen. HINWEIS: Am einfachsten ist es, um festzustellen, wo die Nervenenden und die DRG beginnt, während auf Spannung, um so nah wie möglich an der DRG diesen Schnitt zu machen an dieser Stelle ideal ist. Sobald dieser distale Zweig geschnitten wird, werden die proximalen Zweige als auch getrimmt. </li><li> Schneiden Sie die DRG, jede streunNervenFasern oder Faszien Attachments mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere. Nach ausreichender Isolierung, legen Sie die DRG in die Raumtemperaturmedium innerhalb der 96-Well-V-Bodenplatte. HINWEIS: Platzieren eines dunklen Hintergrund unter die Platte die sub-mm weiß DRGs erleichtert die Visualisierung. Platz nur eine DRG in each gut; Auf diese Weise können sie leichter in den nachfolgenden Schritten berücksichtigt werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang den ganzen Weg nach unten ein Hemi-Wirbelsäule und dann die andere. Jede Seite liefert 16-20 DRGs in Höhe von insgesamt 32 - 40. HINWEIS: Wenn es weniger DRGs als dies sind, ist die Präparation der Wirbelsäule muss durchgeführt weiter kranial und / oder kaudal werden. Die DRGs werden immer weniger gut definiert als ein kaudal geht. </li></ol> 3. Herstellung von halbfesten Matrix-Tröpfchen (&lt;1 min pro Platte) <ol><li> Entfernen Sie ein Glas gut Bodenplatte aus Eis und legen Sie es auf einem Eisblock unter dem Operationsmikroskop. Sicherstellen, dass das Aliquot von Matrix bleibt auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Legen Sie eine 1,5 &amp; mgr; l Tröpfchen der Matrix in jeder der vier Ecken der Glasbodenplatte mit einer 2 &amp; mgr; l oder 10 &amp; mgr; l micropipetter, eine Entfernung zumindest so groß wie die Tröpfchen sich von der Kante des Glases gut bleibt. <ol><li> Setzen Sie die Spitze der Pipette direkt aufdas Glas in einem 45-Grad-Winkel. Pipettieren Sie langsam die Matrix. Langsam bewegen aus dem Glasboden entfernt, nachdem die Matrix auf der Platte in Eingriff ist. HINWEIS: Die Oberflächenspannung zwischen der Matrix und Glas eine perfekte Hemisphäre jedes Mal schaffen sollte. </li><li> Pipettieren stoppen, kurz bevor die Spitze leer ist, weil eine unbeabsichtigte Injektion von Luft in die Matrix Tröpfchens den Durchmesser des Tröpfchens Matrix macht viel größer und ist schwer zu entfernen. HINWEIS: eine zweite Hand Mit dem Pipettieren Hand zu stabilisieren mehr und genauere Platzierung. </li></ol></li></ol> 4. Insertion von DRG in halbharter Matrix Droplets (&lt;2 min pro Platte) <ol><li> Lassen Sie die Platte mit den Matrixtröpfchen kurz bei Raumtemperatur (~ 1 min). Dies versteift die Matrix leicht, wodurch es einfacher für die präzise Platzierung des DRG machen. </li><li> Scoop (nicht begreifen) der DRG sanft mit geschlossenen mikroskopische Pinzette in der linken Hand. Wieder ein dunkler Hintergrund, vor dem kleinen, weißenDRG erleichtert die Visualisierung. Übertragen die DRG auf die Spitze einer 21-Gauge-Nadel in der rechten Hand. Dieser Transfer wird Rest Medien an der Zange lassen. </li><li> Gehen Sie vorsichtig mit der DRG in der Mitte der Matrix Tröpfchen die 21-Gauge - Nadel (Abbildung 1). Die meiste Zeit wird der DRG leicht in der Matrix lösen und kann dann mittig mit der Nadel positioniert werden. <ol><li> Wenn die DRG an der Nadel klebt, verwenden Sie die mikroskopisch kleinen Zange die DRG abstoßen der Nadel und in die Matrix Tröpfchen. Wick entfernt überschüssige Medien aus den mikroskopischen Zange mit einem Labor wischen. HINWEIS: wird der Durchmesser, Volumen und Konsistenz des Assays verändern Medien auf die Matrix eingeführt wird. Ein Eisblock mit Farbe oder farbiger Schrift liefert Hintergrund-Kontrast, die Visualisierung dieser heiklen Prozess erleichtert. </li></ol></li><li> Nachdem die Platte alle vier DRGs hat, abschließende Inspektion durchführen, um sicherzustellen, dass die DRG in der Mitte der Matrix Tröpfchen ist. Nehmen Sie die Einstellungnach Bedarf mit der Nadel 21-thon. </li><li> Übertragen Sie die fertige Platte auf einem 37 ° C Inkubator. Dadurch wird die halbfeste Matrix und fixieren Sie die DRG in Position zu festigen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle der DRGs. Legen Sie leere Matrix Tröpfchen ohne DRG als negative Kontrolle. </li><li> In 4 ml DMEM mit 10% FBS Medien auf jede Glasbodenplatte nach dem alle Platten zu vervollständigen und sie auf die 37 ° C-Inkubator für mindestens 3 min auszusetzen. Die Platte wird in einem leichten Winkel und fügen Sie langsam das Medium, so dass sie nach und nach in Kontakt mit den Matrix-DRG-Einheiten. HINWEIS: Wenn das Medium zu schnell hinzugefügt oder kräftig, die Matrix und / oder DRG kann sich lösen. </li><li> Lagern Sie die Tests in dem 37 ° C Inkubator für die nächsten 48 bis 72 h. HINWEIS: Eine regelmäßige Prüfung der Assays zeigen Umfangs Auswuchs von Neuriten in Richtung der Matrix Kante (Abbildung 2). Wenn die Neuriten größer als drei Viertel des Weges zu der Matrix es,geeignet ist, die Zellen zu plattieren. </li></ol> 5. Herstellung des Kopf-Hals-Krebszellen HINWEIS: Die Zelllinien außer Kopf und Hals Plattenepithel-Zellen Zellkarzinom kann in diesem experimentellen Design verwendet werden. <ol><li> Pflegen Plattenepithelkarzinom-Zelllinien in DMEM mit 10% FBS in bevorzugten Kolben oder Kulturschalen in einem 37 ° C Inkubator. Um Zellen für Experimente, Absaugen alle das Medium von der Kulturflasche oder einen Teller und waschen Sie es zweimal mit PBS vorzubereiten. Suspendieren der Zellen durch eine entsprechende Menge von 0,025% Trypsin für 5 min Zugabe, gefolgt von DMEM mit 10% FBS. Pipette 4 ml der Zell und Mediengemisch in 6-ml-Kulturschalen. HINWEIS: Ein 6-ml-Kulturplatte mehr als genug Zellen liefert, auch wenn weniger als 50% konfluent. </li><li> Setzen Sie die HNSCC Zelllinien zu unterschiedlichen Bedingungen 24 h vor dem Färben und Beschichten auf dem DRG-Test. Re-Dosis den Zustand, wenn die Zellen plattiert sind eine konsistente environme zu haltennt. HINWEIS: In-Antikörper, Wachstumsfaktoren, Zytokine oder andere Moleküle an die Zellkulturschalen 1 bis 2 Tage nach der Maus Dissektion und Implantation der DRG in die Matrix. </li><li> Hinzufügen fluoreszierenden Zell Flecken 1 h vor dem Ausplattieren der Zellen (2 - 3 Tage nach der Ernte und DRG Implantation in der Matrix). HINWEIS: Die besonderen Flecken hier verwendeten frei durch die Zellmembran passieren; Nachdem jedoch mit intrazellulären Thiolgruppen reagieren, bleibt der Fleck innerhalb der Zelle und wird an Tochterzellen weitergegeben. Die Färbung erleichtert die Visualisierung innerhalb der Assays. Diese temporären Flecken sind ideal für diese Tests, da die Fluoreszenz für 2 vorhanden ist - vor 3 Tagen, die der zeitliche Rahmen dieser Experimente ist. Es ermöglicht auch die Verwendung von vielen verschiedenen Farben und vermeidet die Notwendigkeit für fluoreszierendes Protein-transfizierten Zelllinien zu schaffen. <ol><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; M Farbstofflösung durch Mischen von 2 &amp; mgr; l von 10 mM Stammzell Flecken in 2 ml serumfreiem DMEMfür jede Zelle Zustand. Erwärmen diese auf 37 ° C, bevor sie zu den Zellen hinzugefügt wird. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium innerhalb der 6-ml-Platte, die anhaftenden HNSCC Zellen auf der Platte zu verlassen. 2 mL Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen 2 ml der 10 uM Zell Fleck / serumfreies DMEM hinzugefügt zu jeder Platte </li><li> Bringen Sie die 6-ml-Kulturplatte mit der Zelle Fleck auf dem 37 ° C Inkubator für 40 min. </li><li> Nach 40 min absaugen Medium. In 2 ml PBS und dann absaugen. 1 ml 0,025% Trypsin zu jeder Platte und ersetzen Sie sie in der 37 ° C-Inkubator. </li><li> In 2 ml DMEM mit 10% FBS nach 3-5 min und übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein 15-ml konischen Röhrchen. Dreh die Zellen und resuspendiert sie in 1 ml DMEM mit 10% FBS. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler, und fügen Sie dann DMEM mit 10% FBS eine endgültige Zellkonzentration von 300.000 Zellen pro ml zu erstellen. </li></ol></li></ol> 6. Galvanokopfes und Neck Krebszellen <ol><li> Entfernen Sie die Glasbodenplatten mit den Matrix-DRG-Assays aus dem Inkubator. HINWEIS: Auch hier sind sie geeignet, wenn Neuriten sind mindestens 75% der an dem Rand der Matrix, die nach 2 tritt in der Regel - 3 Tage. Dies wird am besten gesehen zumindest ein 10X-Objektiv verwendet wird. </li><li> Saugen Sie das Medium innerhalb der Glasbodenplatte. aspirieren vollständig das Medium innerhalb des Glases gut, ohne dass die Matrix-DRG-Einheiten zu entfernen. </li><li> Zeichnen Sie bis zu 200 &amp; mgr; l der 300.000 Zellen / ml Medium, das eine 200-ul-Pipette. Legen Sie zwei Tropfen der Zellen über jede Matrix-DRG-Test. Führen Sie diesen Schritt für jede Matrix Tröpfchen, wodurch vier Wiederholungen jeder Zelle Zustand auf einer Platte. HINWEIS: Die hemisphärische Form der Matrix können die Zellen in einem Ring entlang dem Umfang des Assays (3a, 3b) zu regeln. Die Suche nach einer Pipette mit einem glatten Auslöser macht die Platzierung der Uniform fällt viel leichter. </li><li> Bestätigen Sie ähnliche Zellzahlen und Distribution der verschiedenen Zell Bedingungen, unter 4X Mikroskopie. </li><li> Legen Sie die Glasbodenplatten in den 37 ° C-Inkubator für etwa 60 min. Hinweis: Obwohl es nur ein kleines Volumen von Zellen und Medien (~ 150 &amp; mgr; l) ist, die Tests nicht austrocknen, bis mehrere Stunden Inkubator Zeit vergangen sind. </li><li> Nach 60 min, fügen Sie vorsichtig 4 ml DMEM mit 10% FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte. HINWEIS: Über einen Zeitraum haften die Zellen teilweise an dem Plattenboden und die Methode der Zugabe des Mediums der Zellen nicht stören. Verschiedene Zelltypen machen mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen zu beginnen, um die Glasbodenplatte zu kleben. </li><li> Ersetzen Sie alle exogenen Drogen oder Wachstumsfaktoren zu diesem Zeitpunkt die bisherigen Konzentration aufrechtzuerhalten. </li><li> Bringen Sie die Tests auf die 37 ° C-Inkubator, außer wenn sie mikroskopisch untersucht werden. Quantifizieren Sie die Ergebnisse dieses Tests durch mikroskopische Bildgebung. Kurz gesagt, die Stränge von perineuralen Invasion zählen mitin vier Quadranten mit einem 4X mikroskopischen Bild. HINWEIS: Ein Mikroskop mit einem 4-fach Objektiv und Fluoreszenz-Fähigkeiten ist ausreichend für die Foto-Dokumentation der Tests. Die Größe der Assays passt gut im Bereich eines 4X Ziel, das detailliert genug ist, um die einzelnen Bereiche der perineural Invasion zu erfassen. Perineuralen invasion wird innerhalb von 24 h offensichtlich, aber über 48 h beginnt die Integrität der Assays zu schwächen, da die Tumorzellen entlang der Peripherie der Matrix unterteilen und einzufallen. Darüber hinaus 48 h gibt es auch erhebliche Abfluss von Fibroblasten aus der DRG, die Visualisierung mit Hellfeldmikroskopie verschleiert. Daher ist es ratsam, Foto-Dokument die Ergebnisse mit 4X - Mikroskopie mindestens zweimal in diesem Fenster ( zum Beispiel bei 24 und 48 Stunden nach der Tumorzellen Plating). Denken Sie, dass diese 3-dimensionale Assays sind, und es ist der gesamte Test vollständig Bild schwierig. Die meisten perineuralen Invasion tritt in einer Ebene von der Unterseite der Platte, wobei ter Zellen in der Matrix etwas oberhalb der Unterseite der Platte eingebettet. Da diese Ebene der Nähe von horizontal ist, sind die überwiegende Mehrheit der Neuriten mit Tumorzellen in einem Single-Level-Bild bei 4X erfasst. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die genaue Präparation und Extraktion der Dorsalwurzelganglien. Proper transection der Wirbelsäule und einer Mittellinie-Längsunterteilung in zwei hemi-Stacheln sind kritisch für den Erhalt einer großen Anzahl von DRG. Während der Präparation von Einzel DRGs sollte das Ganglion nie direkt gehandhabt werden, sondern die umgebende Faszie sollten mit den mikroskopischen Zange gegriffen...

Das Plattenepithelkarzinom im Kopf- und Halsbereich (HNSCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung in den USA, mit 10.000 Todesfällen pro Jahr landesweit und 300.000 Todesfällenpro Jahr weltweit1. Die Gesamtprognose für HNSCC ist in den letzten Jahrzehnten unverändert bei 50 % geblieben. Die perineurale Invasion (PNI) ist eines der auffälligsten pathologischen Merkmale, die auf eine schlechte Prognose bei Patienten mit HNSCC hindeuten. Leider tritt PNI bei HNSCC häufig auf und kann bei bis zu 40 % der HNSCC-Patienten gefunden werden2,3. 
PNI ist der Prozess, durch den bösartige Zellen entlang von Nerven zu benachbarten Geweben gelangen, was eine höhere Rate der lokalen und entfernten Ausbreitung ermöglicht. Dementsprechend weisen PNI-positive HNSCC-Tumoren höhere Raten an lokoregionären Rezidiven und Fernmetastasen auf, was zu einem geringeren Gesamtüberleben im Vergleich zu HNSCC-Patienten ohne PNI4-8 führt.
Obwohl die Behandlung von Patienten mit PNI typischerweise durch den Einsatz von Operation, Bestrahlung und Chemotherapie maximiert wird, sind die Gesamtüberlebensraten dieser Patienten im Vergleich zu Patienten ohne PNI9-11 immer noch um bis zu 40% verringert. Somit ist klar, dass die derzeitigen Behandlungsmodalitäten für HNSCC unwirksam sind, um die mit PNI verbundene ungünstige Prognose zu verbessern. Der Ansatz, eine zielgerichtete Therapie gegen PNI bei HNSCC zu entwickeln, wurde durch das unzureichende Verständnis der Faktoren, die diesen Prozess regulieren, behindert. Dies ist zum Teil eine Folge des Fehlens eines konsistenten In-vitro-Modells für die Untersuchung von PNI bei HNSCC. 
In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen ein In-vitro-Modell zur Untersuchung von PNI bei überwiegend Bauchspeicheldrüsen- und Prostatakrebs verwendet12-19. Dieses Modell verwendet die Neuriten, die aus Spinalganglien erzeugt werden, die von Mäusen oder Ratten isoliert wurden, als Surrogat für die Invasion großer Nerven. Die Spinalganglien sind in einer faktorarmen, halbfesten Matrix fixiert, bei der es sich um ein lösliches Basalmembranproteingemisch handelt, das von Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen sezerniert wird. Diese Matrix ermöglicht das Auswachsen der Neuriten und die Verfolgung einzelner Krebszellen entlang dieser Neuriten. Hier wird die Adaption dieses Modells für die Untersuchung von PNI bei HNSCC beschrieben.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 Mix mit L-Glutamin & 15 mM HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Flowery Branch, GA</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>Gammabestrahlte 35-mm-Kulturschalen mit Glasboden</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8 Operationsmikroskop</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>495015-0021-000&nbsp;</td><td>Thornwood, Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Schott ACE I Lichtquelle</td><td>Schott</td><td>A20500</td><td>Deutschland</td></tr><tr><td>CellTracker&nbsp;</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>C2925</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel 18 g und 21 g</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Premium Mikrodisparierpinzette</td><td>Harvard Apparatus</td><td>60-3851</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Premium Feinbedienungs-Standardschere</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2789</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Premium Federschere</td><td>Harvard Apparatur</td><td>60-3923</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Verbandszange</td><td>Harvard Apparatur</td><td>72-8949</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Athyme Nacktmäuse (002019)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002019</td><td>Bar Harbor, ME</td></tr></tbody></table>

ein modell für perineurale invasion in kopf- und hals-plattenepithelkarzinom

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineurale Invasion (PNI) findet sich bei etwa 40% der Plattenepithelkarzinome (HNSCC) im Kopf- und Halsbereich. Trotz multimodaler Behandlung mit Operation, Bestrahlung und Chemotherapie treten lokoregionäre Rezidive und Fernmetastasen häufiger auf, und das Gesamtüberleben ist im Vergleich zu HNSCC ohne PNI um 40% verkürzt. In-vitro-Studien der Signalwege der HNSCC-PNI waren in der Vergangenheit eine Herausforderung, da es an einem konsistenten, reproduzierbaren Assay mangelte. Beschrieben wird hier die Adaption des dorsalen Ganglion (DRG) Assays für die Untersuchung der PNI bei HNSCC. In diesem Modell werden DRG aus der Wirbelsäule einer geopferten Nacktmaus entnommen und in einer halbfesten Matrix platziert. In den folgenden Tagen werden Neuriten gebildet und wachsen in einem radialen Muster aus den Zellkörpern des DRG. HNSCC-Zelllinien werden dann peripher um die Matrix herum platziert und dringen bevorzugt entlang der Neuriten in Richtung DRG ein. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung mehrerer Behandlungsbedingungen mit sehr hohen Assay-Erfolgsraten und Reproduzierbarkeit.

Nach der Präparation des DRG und die Platzierung innerhalb der Matrix Tröpfchens, sollte das Aussehen des Assays Abbildung 1. Note ähneln , dass der DRG nicht perfekt rund ist, aber es ist innerhalb der Matrix Tröpfchens zentriert. Dies ermöglicht das Auswachsen von Neuriten in 360 Grad, 2 teilweise dargestellt ist . Beachten Sie, dass bestimmte Teile des DRG schneller Neuriten aussenden und in größerer Zahl als andere, in der Regel ents...

Die perineurale Invasion (PNI) ist ein häufiges Merkmal des Plattenepithelkarzinoms im Kopf- und Halsbereich (HNSCC) und führt zu niedrigeren Überlebensraten. Seine Mechanismen sind nur unzureichend verstanden. Unter Verwendung von Neuriten, die aus murinen Spinalganglien erzeugt werden, die auf eine halbfeste Matrix beschränkt sind, können die Signalwege untersucht werden, die an der PNI von HNSCC-Zelllinien beteiligt sind.

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, schnell mehrere Behandlungsbedingungen zu bewerten, die die perineurale Invasion bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich beeinflussen, mit sehr hohen Assay-Erfolgsraten und Reproduzierbarkeit. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kopf- und Halsonkologie zu beantworten, z. B. welche Faktoren die perineurale Invasion von Kopf- und Halskrebszellen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Assays schnell und reproduzierbar an einer Maus in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann.Bevor Sie mit der Dissektion des Spinalganglions (DRG) beginnen, geben Sie frisches Medium bei Raumtemperatur in mindestens 40 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden. Machen Sie dann mit einer feinen Schere einen Längsschnitt entlang der Wirbelsäule von der Schwanzwurzel bis zum Kopf der Maus. Und teilen Sie das Gewebe unterhalb der Sakralwirbelsäule quer, indem Sie beide Seiten der Wirbelsäule bis zur Schädelbasis präparieren.Übertragen Sie die Probe unter das Mikroskop und beobachten Sie das zervikale Ende der Wirbelsäule bei geringer Leistung. Das weiße Rückenmark ist in der Mitte eines knöchernen Rings sichtbar, der von unterschiedlichen Anteilen an perispinalen Muskeln und Weichteilen umgeben ist. Spalten Sie mit einer mikroskopisch kleinen Federschere den dorsalen oder oberen Aspekt der ersten zwei bis drei Wirbelkörper.Verwenden Sie dann die Federwirkung der Schere, um diesen anfänglichen knöchernen Schnitt zu öffnen, um sicherzustellen, dass die Dissektion des Wirbelkörpers an der Mittellinie erfolgt. Fahren Sie in kleinen Schritten in Richtung der Sakralwirbelsäule fort und halbieren Sie die Wirbelsäule mit identischen Schnitten an der ventralen oder unteren Seite der Wirbelkörper. Legen Sie eine Hemispiden beiseite und übertragen Sie die andere Hälfte der Wirbelsäule mit der Vorderseite nach unten auf eine sterile Platte, wobei das Rückenmark an Ort und Stelle ist.Und verwenden Sie zwei 18-Gauge-Nadeln, um beide Enden des Hemipins auf der Polystyrol-Präparierplattform zu befestigen. Beginnend am schmaleren, zervikalen Ende, schälen Sie das Rückenmark vorsichtig von etwa vier Wirbelebenen zurück. Fassen Sie in dem Bereich, in dem die sensorischen Nerven in das DRG eintreten, vorsichtig mit einer mikroskopisch kleinen Pinzette die umgebende Faszie und schneiden Sie mit einer mikroskopisch kleinen Federschere diese Faszie und anderes Nervengewebe ab, um das DRG zu befreien.Bei erhöhter Vergrößerung den peripheren Nerv mit der Federschere so nah wie möglich am DRG durchtrennen, um das Gewebe freizusetzen, und die proximalen Äste abschneiden. Schneiden Sie dann das DRG von verirrten Nervenfasern oder faszialen Ansätzen ab und platzieren Sie das isolierte Gewebe in einer Vertiefung der 96-Well-V-Bodenplatte. Um die halbfesten Matrixtröpfchen herzustellen, wird eine Glasvertiefungsbodenplatte aus dem Eis auf einen Eisblock unter dem Operationsmikroskop übertragen.Setzen Sie die Spitze einer Pipette mit einem Fassungsvermögen von nicht mehr als 10 Mikrolitern in einem Winkel von 45 Grad direkt auf das Glas und geben Sie vorsichtig einen 1,5-Mikroliter-Tropfen Matrix auf das Glas. Bewegen Sie die Pipettenspitze langsam vom Glas weg, während die Matrize in die Platte einrastet. Geben Sie je einen Tropfen Matrix auf jede der vier Ecken der Platte und stellen Sie die Platte für etwa eine Minute auf eine Oberfläche mit Raumtemperatur.Wenn die Matrize leicht steif geworden ist, legen Sie die Platte wieder in den Eisblock und schöpfen Sie das DRG mit einer geschlossenen mikroskopischen Pinzette vorsichtig mit der linken Hand auf. Übertragen Sie mit der rechten Hand vorsichtig das Nervengewebe auf die Spitze einer 21-Gauge-Nadel und führen Sie mit der Nadel das DRG vorsichtig in die Mitte des Matrixtröpfchens ein. Der DRG sollte sich leicht in die Matrize lösen lassen, um mit der Nadel zentral positioniert zu werden.Nachdem Sie ein DRG-Stück in jeden der vier Tropfen eingesetzt haben, legen Sie die Platte für drei Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Wenn alle DRG eingebettet sind, halten Sie die Platten nacheinander in einem leichten Winkel und geben Sie langsam vier Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, auf die Platten, so dass das Medium nur allmählich mit den Matrix-DRG-Einheiten in Kontakt kommt. Stellen Sie die Platten für weitere 48 bis 72 Stunden in den Inkubator.Wenn die Neuriten mindestens 75 % des Weges bis zum Rand der Matrix erreicht haben, saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen an, ohne die DRG-Einheiten der Matrix zu entfernen. Geben Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette und einem glatten Auslöser zwei Tropfen mit drei mal 10 Zellen pro Milliliter Medium auf jeden Matrix-DRG-Assay. Und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator.Geben Sie nach einer Stunde vorsichtig vier Milliliter DMEM mit 10 % FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte hinzu und stellen Sie die Platten bis zur nächsten mikroskopischen Auswertung wieder in den Inkubator. Nach ihrer Dissektion und Platzierung in den Matrixtröpfchen sollte das Erscheinungsbild des Assays dem hier gezeigten matrixeingebetteten DRG ähneln. Beachten Sie, dass der DRG nicht perfekt rund ist, sondern innerhalb des Matrixtröpfchens zentriert ist, was das Auswachsen von Neuriten in 360 Grad ermöglicht.Unmittelbar nach der Plattierung bilden die Plattenepithelzellen des Kopfes und Halses einen umlaufenden Ring um die Matrix, der sich in den nächsten zwei bis drei Tagen entlang der Neuriten ausdehnt. Zellen, die auf leere Kontrolltröpfchen plattiert sind, die nur die Matrix enthalten, teilen sich aktiv um die Matrizen, treten aber nicht in die Matrizen ein oder erstrecken sich nicht über die Oberseite. Zur Quantifizierung der perineuralen Invasion der Krebszellen werden die Bilder der Assays über eine vertikale und eine horizontale Linie in vier Quadranten unterteilt.Für jede in jedem Quadranten beobachtete perineurale Invasionserweiterung wird dann eine Reihe von Punkten vergeben, die einen Vergleich der Einwüchsungen von Krebszellen entlang der Neuriten zwischen verschiedenen Krebszelllinien ermöglichen. Einmal gemeistert, kann die Technik zur Isolierung der Spinalganglien in weniger als zwei Stunden abgeschlossen sein, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die übermäßige Handhabung der Spinalganglien zu minimieren, da Quetschverletzungen der häufigste Grund für das Versagen des Assays sind.Nach diesem Verfahren können die Mechanismen der perineuralen Invasion untersucht werden, was möglicherweise zur Entwicklung gezielter Therapien gegen diese Art der Weichteilinvasion führt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dorsale Wurzelganglien von einer Maus präpariert und einen Assay zur Untersuchung der perineuralen Invasion einrichtet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

In diesem Video beschreiben wir die Methode zur Co-Kultur von dorsalen Wurzelganglien und Krebszellen auf der chorioallantoischen Membran oder CAM von Küken, um die perineurale Invasion zu untersuchen.

Chorioallantoische Membran des Kükens oder CAM-Tumormodell: Eine In-Ovo-Methode zur Simulation der perineuralen Invasion von Tumorzellen

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Entwicklung eines in vitro perineuralen Krebszellinvasionsmodells durch Co-Kultivierung von Maus-Spinalganglion und neurotropen Krebszellen. Das Modell kann zur Durchführung von Krebstests verwendet werden, die schnelle und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Etablierung eines dreidimensionalen Co-Kulturmodells von murinen Spinalganglien und Krebszellen: Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der perineuralen Invasion von Krebszellen

In diesem Video entwickeln wir ein in vivo Mausmodell für die perineurale Invasion, indem wir Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in den Ischiasnerv injizieren. Dieses Modell hilft, das Ausmaß der Invasion zu quantifizieren und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Nerven zu untersuchen.

Maus-Perineurales Invasionsmodell: Generierung eines In-vivo-Modells zur Simulation einer perineuralen Invasion im Ischiasnerv der Maus

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Etablierung eines Mausmodells der perineuralen Invasion durch Injektion von Krebszellen in den Ischiasnerv. Das Modell kann helfen, das Ausmaß der Nerveninvasion für die spätere Bewertung von Krebsmedikamenten zu verstehen.

Mausisches Ischiasnerv-Modell der perineuralen Invasion oder PNI: Extraktion und Verarbeitung des Ischiasnervs zum Verständnis der Invasion durch Krebszellen

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Dieser Videoartikel zeigt die Verwendung des Modells der dorsalen Wurzelganglien (DRG)/Krebszellen beim duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

Wir beschreiben eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion durch Einspritzen von Phänomen pankreatischen Krebszellen in den Ischiasnerv. Das Modell ermöglicht eine Quantifizierung des Ausmaßes der Nerv Invasion und Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Perineural Invasion unterstützt.

Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Perineurale Invasion ist ein aggressiver Phänotyp für Kopf- und Halsplattenkarzinome und andere Tumoren. Das Küken-Chorioallanto-Membranmodell wurde zur Untersuchung von Angiogenese, Krebsinvasion und Metastasierung verwendet. Hier zeigen wir, wie dieses Modell genutzt werden kann, um die perineurale Invasion in vivo zu bewerten.

Das Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Modell zur Beurteilung der perineuralen Invasion bei Kopf- und Halskrebs

Erfahren Sie die Untersuchung perineuraler Invasion bei Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals mit dorsalen Wurzelganglien von Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Assays zur Erforschung invasiver Mechanismen.

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

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