Name: Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Lernen Sie Lichtblattmikroskopie für Langzeitbeobachtungen von Pflanzenwurzeln auf Geloberflächen. Diese schonende Methode ermöglicht dreidimensionale Bildgebung von Arabidopsis-Keimlingen ohne Beeinträchtigung des natürlichen Wachstums.

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Wir danken Matyáš Fendrych für das kritische Lesen / Betrachten und Stephan Stadlbauer für die Audiogeräte. Dank der Miba Machine Shop bei IST Österreich für ihren Beitrag zur OpenSPIM. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben Mittel aus dem Programm Menschen (Marie-Curie-Maßnahmen) der Europäischen Union des Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter REA Finanzhilfevereinbarung Nr [291734] und European Research Council (ERC-Projekt-2011 erhalten -StG-20101109-PSDP).

1. Arabidopsis Anzucht vor der Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie ½ MS - Medium (halbkonzentriertem Murashige und Skoog - Medium) durch Zusatz von 2,15 g MS-Medium, 10 g Saccharose, 0,97 g MES (2- (N - Morpholino) ethansulfonsäure) und 1 l ddH 2 O (doppelt destilliertem Wasser ) in einen 1-l-Flasche. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH. </li><li> Werden 15 g / l Gellan gum zum ½ MS Medium autoklaviert und für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Gießen 30 ml des heißen Mediums in quadratische Petrischalen (245 x 245 x 25 mm), um eine Gelschicht mit einer Dicke von etwa 2 mm zu schaffen. Lassen Sie die Gerichte auf Raumtemperatur abkühlen, um das Medium lassen sich zu verfestigen. </li><li> Setzen Sie sterilisierten Arabidopsis Samen in ein 1,5 - ml - Reaktionsröhrchen mit 1 ml sterilem H 2 O , die Samen mit einer Glaspipette Pick - up oder eine 1000 ul Pipettenspitze und säen sie auf die Oberfläche des Gels. Legen Sie die Samen getrennt ca. 10 mm auseinander. Verschließen Sie die Platte mit Klebeband. </li><li> Inkubiere die Platte für 24 h bei 4° C (Schichtung). </li><li> Pflegen Sie die Platte in einem Wachstums Inkubator, zB bei 22 ° C in einem 16/8 h Tag / Nacht - Zyklus mit 120-140 &amp; mgr; mol / m² / s Lichtmenge für 6 Tage. Bis zu 10 Tage alten Pflanzen eingesetzt werden. </li></ol> 2. Pflanzenprobenvorbereitung Hinweis: Der Probenhalter kann entweder 3D - Druck oder die Hand in eine Maschine Werkstatt hergestellt unter Verwendung der dargestellten Dimensionen in 2C. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Siehe den Link in der Materialliste der 3D-Druck zu bestellen. <ol><li> 5 g niedrigschmelzende Agarose in einen 50 ml-Flasche mit 50 ml MS-Medium ½ und autoklaviert für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Aliquot der 1% niedrigschmelzende Agarose-Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Lagerung bei 4 ° C (für mindestens zwei Monate verwendet werden). </li><li> Schmelzen Sie eine aliquote Menge von 1 %% niedrigschmelzende Agarose bei 80 ° C und lassen Sie es abkühlen33 ° C. </li><li> Reinigen Sie den Probenhalter in einem Ultraschallgerät. Sterilisieren Sie den Probenhalter mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Schneiden Sie das Gel um die Pflanze mit einem Skalpell. </li><li> Heben Sie den Block mit einem flachen Spatel und schieben Sie sie vorsichtig auf den Probenhalter eine zweite Spachtel. </li><li> Kleben das Gel auf den Probenhalter mit 1% Agarose (bei 33 ° C) unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Kleben Sie die Anlage auf dem Gel mit 1% Agarose unter Verwendung einer 10 &amp; mgr; l-Pipette. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um zu überprüfen, dass die Blätter nicht mit Gel bedeckt sind. Sie nicht das Gel direkt auf die interessierende Region zu positionieren. </li><li> Um zu verhindern, die Pflanze vor dem Austrocknen, ohne Unterbrechung arbeiten. Setzen Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Verwenden Sie die Pipettenspitze als eine Kappe und schieben Sie sie vorsichtig über ein Ende des Probenhalters in dem die Anlage steht. </li><li> Setzen Sie den Probenhalter in einer Pipettenspitze Feld und bereiten mehr Pflanzen, wenn nötig. Pflanzen können Richtungen seintly abgebildet oder im Wachstums Inkubator zurückgestellt. </li></ol> 3. Das Mikroskop einrichten HINWEIS: Die LED-Beleuchtungssystem ist ein custom-built-Lampe. Die technischen Details erforderlich , um die LED-Ring zu bauen ist in Abbildung 3 und der Materialliste zu finden. Siehe die zusätzliche Materialdatei (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) für das Board-Design. <ol><li> Schrauben oder Kleber (zB doppelseitiges Klebeband) der LED - Ring an der unteren Seite des OpenSPIM x / y / z / θ-Stufe Arm. </li><li> Schließen Sie den LED-Ring mit einer einstellbaren Stromversorgung (0-30 V, max 2 A). </li><li> Einzustellen , die Spannung auf die gewünschte Lichtstärke (für Arabidopsis, 120-140 &amp; mgr; mol / m 2 / s, 3D). </li><li> Sterilisieren Sie die Probenkammer mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Reinigen Sie das Objektiv mit Benzin und einem Objektivreinigungstuch. Sterilisieren der Objektivlinse mit 70% Ethanol. </li><li> Schließen Sie die perfusian Rohren zur Probenkammer in einer Einweganordnung. Setzen Sie einen 1-l-Flasche mit frischem ½ MS-Medium und eine weitere leere Flasche neben der peristaltische Perfusionspumpe. Schließen Sie die Flasche mit Medium, das mit dem unteren Einlass der Probenkammer ein Perfusions-Rohr. Schließen Sie den oberen Ausgang der Probenkammer mit der leeren Flasche, die die verwendete Medium unter Verwendung eines anderen Perfusion Rohr in den Papierkorb. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf 1 ml / min. ANMERKUNG: Um nicht die Probenkammer Überlaufen ist es wichtig, eine höhere Ausfluss als der Zufluß zu haben. Entweder die Pumprate zu erhöhen oder ein Rohr mit einem größeren Innendurchmesser für das Ausströmen verwenden. </li><li> Schneiden Sie eine schwarze Kunststofffolie in 3 mm kleine Quadrate, Waschen mit 70% Ethanol und trocknen lassen, bevor sie in der Probenkammer auf der Wasseroberfläche platzieren. </li><li> Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Probenhalter und legen Sie den Probenhalter in der Probenkammer. Wenn der neu hergestellten Probenhalter nicht in die Stufe Arm passt, mit einem feinen SandPapier es dünner zu machen oder einen O-Ring (∅ 6 mm) verwenden, falls sie zu dünn ist. </li><li> Um die Deckel schaffen, schneiden Sie die schwarzen Aluminiumfolie in zwei 50 x 25 mm große Stücke. Machen Sie ein 5 mm geschnitten in der Mitte einer Seite jedes Stück. Fold ein Dreieck Einbuchtung (Figur 1D) zu erzeugen. Schließen Sie die Probenkammer mit den beiden Deckeln durch den Deckel auf der Oberseite der Probenkammer mit dem Dreieck Vertiefungen setzen den Probenhalter gegenüber. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenblätter nicht im Schatten der Lider und empfangen Licht von dem Beleuchtungssystem. </li><li> Finden Sie die Region von Interesse mit der x / y / z und Rotationsstufe eine neu auftretende Seitenwurzel im Blickfeld zu positionieren. </li><li> Vor der Aufnahme kann das System für mindestens 15 min äquilibrieren. </li><li> Richten Sie die Bildaufnahme. <ol><li> Legen Sie einen Stapel von 217 Bilder mit 3 &amp; mgr; m z-Abstand (650 &amp; mgr; m) und stellen Sie den Zeitablauf mit 15 min Abbildungsintervall für einen Zeitraum von insgesamt 17 Stunden. HINWEIS: Eine ausführliche Dokumentation zuwie die OpenSPIM Software bedienen kann auch gefunden werden (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Starte die Aufnahme. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie hat den großen Vorteil niedrige Phototoxizität und ultraschnelle Aufnahmegeschwindigkeit zu kombinieren, die verwendet werden können, ein großes Volumen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen, während die Probe in einem physiologischen Zustand zu halten. Die Auflösung eines Lichtblatt - Mikroskop kann mit dem von einem konfokalen Mikroskop 9 verglichen werden. Jedoch tritt Lichtstreuung und Absorption entlang der Anregungs- und Emissionspfad individuell und die Gesamtbildqualität kann innerhalb opaken Gewebe im Vergleich zu der Oberfläche deutlich geringer sein. Um diese Komplikation zu umgehen kann man die Möglichkeit verwenden, um die Probe entlang der vertikalen Achse zu drehen, und das gleiche Volumen aus verschiedenen Richtungen beobachten. Aber dies ist nicht immer von Vorteil, zB Seitenwurzeln entstehen auf der einen Seite der Wurzel und Bildgebung von hinten führt zu einer niedrigen Bildqualität ohne weitere Informationen zu gewinnen. Jedoch kann die Drehung hauptsächlich die samp Positionierung verwendet werden,le in der besten Weise. Die klassische horizontale Anordnung der Objektive ermöglicht neue Wege der Probenmontage. Pflanzen profitieren von einer vertikalen Position. Hier vorgestellte, die &quot;auf der Oberfläche des Gels&quot; Montageverfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Befestigungsarten , wie beispielsweise die Wurzel innerhalb eines Gels 24,25 einzubetten. 1) Das Wurzelsystem ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium. Die Probenkammer ist mit einem Perfusionssystem verbunden, die kontinuierlich frisches Medium zur Verfügung stellt. Es kann auch schnell verwendet werden, um das gesamte Volumen der Probenkammer auszutauschen, um verschiedene Medien oder Medikamente anwenden. 2) Vor der Probenvorbereitung Pflanzen wachsen, wie sie in Laboratorien verwendet werden, um zu wachsen. Die Pflanzen können müssen die gewünschten Pflanzen vorbereitet werden unter einem Fluoreszenzmikroskop und nur dann ausgewählt werden. 3) Die Anlage ist aus der Petrischale an den Probenhalter übertragen, ohne berührt zu werden. Dadurch kann die Anlage weiter zu entwickeln auf dem gleichen Gel wurde in der Wachstums incubato wachsen aufr und mechanische Beanspruchung auf ein Minimum reduziert. 4) Die Ansicht auf der Probe ist frei und optische Aberrationen minimiert werden, da der Raum zwischen der Probe und dem Erfassungsziel nur mit Medium und keine anderen Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gefüllt ist. Um eine langfristige Bildgebung, die Anlage Beleuchtungssystem zur Durchführung notwendig photosynthetische Aktivität der Anlage zu gewährleisten. In den meisten Laboratorien Pflanzen wachsen auf einem transparenten Gel, dh die Wurzeln Licht ausgesetzt werden. Dies kann unterschiedliche Reaktionen auf ihre Umwelt verursachen und induziert Veränderungen in ihrer Biochemie und Entwicklung 26,27. Um zu reduzieren, wurde die Menge des Lichts auf das Wurzelsystem, schwarze Plastikfolie verwendet, um die Wasseroberfläche sowie einen Deckel aus schwarzem Aluminiumfolie zu bedecken bedeckt die Probenkammer. Licht kann die Anlage verlässt durch das zentrale Loch im Deckel erreichen. In dieser Konfiguration wurde kein Anstieg der Hintergrundlicht beobachtet, suggesting, die die Menge an Streulicht von den roten und blauen LEDs wesentlich durch die GFP-Filter und die Abschattung Ansätze reduziert wurde. Dies erlaubt das Licht während der Bildaufnahme gedreht zu halten, ohne die Kamera Hintergrundrauschen zu erhöhen. Der Probenhalter ist für den 3D-Druck entwickelt. Jedoch ist die Auswahl des Materials wichtig, da einige Kunststoffe, die nicht zu 100% stabil getestet wurden, waren, in einer Drift der Probe resultiert. Daher wird empfohlen, Harze stattdessen zu verwenden oder den Probenhalter aufzubauen, indem ein Polyethylen (PEP) Stange Fräsen. Wenn ein Lichtbogen Mikroskopaufbau mit einem doppelseitigen Beleuchtungssystem unter Verwendung der Halter Probe könnte mit einer der Licht Blätter stören auf dem Drehwinkel abhängig. während Schöpfen die Pflanze von der Platte, mit einem flachen Winkel der Spachtel, um mechanische Belastung zu reduzieren. Die Anlage kann schnell austrocknen und Erfahrung Luftstrom zum ersten Mal. Versuchen Sie, jede Zugluft zu vermeiden (schnelle Bewegungen, Klimaanlage Fluss), work ohne Unterbrechung und schieben Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Im Inneren des Mikroskops ist es entscheidend, die ganze Pflanze in Flüssigkeit nicht tauchen und die Blätter trocken halten. Die Technik ist ideal für frühe Stadien der Seitenwurzelbildung Bildgebung. Wenn langfristige Darstellung von reifen Wurzelspitzen durchführt, muss man bedenken, dass Arabidopsis Wurzeln mit 100-300 &amp; mgr; m / h wachsen schnell aus dem Blickfeld. Eine sehr nützliche zukünftige Implementierung könnte ein automatisiertes Tracking-Algorithmus sein, der folgende Wurzelspitze Wachstum über längere Zeiträume ermöglichen würde. Die Fähigkeit, Umgebungsbedingungen zu steuern, wie Licht und Nährstoffzusammensetzung des Mediums während des Akquisitionsprozesses ermöglicht es zu untersuchen, wie Pflanzen an Veränderungen anpassen. Die Wurzel ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, die verwendet werden können Medikamente anwenden , um chemisch - Genexpression, beispielsweise unter Verwendung des Dexamethason induzierbar 28 oder die β-estr aktivierenAdiol induzierbares System 29. Allerdings dauert es Zeit, um das gesamte Volumen der Probenkammer zum Austausch eines Arzneimittels auszuwaschen. Das Setup kann durch Minimieren des Volumens der Probenkammer verbessert werden Mediumaustausch zu beschleunigen. Dennoch hat diese Technik ein großes Potenzial. Die Kombination von Montageverfahren, standardisierte Anbaubedingungen und die sanfte Bildaufnahme mit Hilfe von Licht-Blatt-Mikroskopie ermöglicht Langzeitstudien der Pflanzenentwicklung mit hoher Auflösung auf physiologischer Ebene. Dies wird den Forschern helfen, grundlegende Mechanismen der pflanzlichen Entwicklung zu erforschen.

Eine der wichtigsten Fragen für das Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie einzelne Zellen während der Organ Differenzierung und das Wachstum verhalten. Idealerweise können zelluläre Ereignisse, wie Genexpressionsmustern und intrazelluläre Proteinlokalisation, in dem Licht einer größeren Kontext des Gewebes gesehen werden. Dieses Ziel stellt technische Herausforderungen und erfordert ganze Organ Beobachtung mit einer hohen räumlichen sowie zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, die phototoxische Effekte verursachen können. Da Pflanzen auf Umweltveränderungen schnell anzupassen, sind die Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Um mit dem physiologischen Zustand der Anlage ohne störende Langzeit-Bildgebung zu tun, müssen drei Dinge sichergestellt, 1) Wachstumsbedingungen in der Probenkammer sein, 2) stabile Probe über lange Zeiträume Montage und 3) die Abbildungs mit geringen Lichtintensitäten Foto-Schäden und nicht-physiologischen Bedingungen zu vermeiden. Physiologische wachsenden conditions in der Kammer Mikroskop Probe sind von entscheidender Bedeutung für die langfristige Experimente. Es gibt eine Reihe von Protokollen zur Verfügung , die Abbildungswachstumskammern für konfokale Mikroskope 1 beschreiben - 3. Jedoch führt der konfokalen Mikroskopie eine hohe Lichtintensität auf die Anlage, die 4 Antworten Stress und in der Regel hemmt das Wachstum führen kann. Darüber hinaus erlauben die meisten herkömmlichen Mikroskopen nur horizontale Positionierung der Probe, die für die Pflanzen nicht optimal ist, da sie versuchen, sich neu zu orientieren und zu dem Vektor der Schwerkraft wachsen. In den letzten zehn Jahren hat sich Lichtbogen - Mikroskopie als ein mächtiges Werkzeug entstand die Entwicklung von großen Proben bei zellulärer Auflösung für Zeiträume von bis zu mehreren Tagen 5 zu erfassen - 9. Lichtbogen - Mikroskopie ermöglicht es, die Probe vertikal positioniert und wird zunehmend in der Pflanzenforschung verwendet Wurzelentwicklung studieren 10-21, kürzlich rezensiert von Berthet und Maizel 22. Viele der genannten Studien 10,13 - 18,21 wurden im Labor von Ernst HK Stelzer optimiert und führten eine besondere Art der Probe unter Verwendung Halterung 17 durch Züchten der Wurzel auf der Oberfläche eines Gels gekennzeichnet. In diesen Studien wurde eine maßgefertigte Mikroskop verwendet wird, in dem die Pflanze aus dem Boden gehalten wird. Im Gegensatz dazu halten die Mehrheit der breit verfügbaren Lichtbogen Mikroskope die Probe von der Spitze. Somit ist diese besondere Herstellungsverfahren nicht ohne weiteres angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode liefert ein Protokoll für die gut etablierte auf Oberflächenmontageverfahren anwendbar für die OpenSPIM 23, einem Open - Access - Plattform für die Anwendung und Verbesserung der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es langfristige Bildgebung von Arabidopsis Wurzeln in der OpenSPIM Lichtbogen Mikroskop zu ermöglichen. Dies wird durch das Züchten einer Pflanze aufrecht auf den s erreichturface eines Gels mit den Wurzeln in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze, eine maßgeschneiderte Beleuchtungssystem , um sicherzustellen , beleuchtet die Blätter , aber nicht die Wurzeln (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>Agarose, niedrigschmelzend</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Schwarze Aluminiumfolie</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Schwarze Kunststofffolie</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blau (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&nbsp; CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED rot (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED Board - PCB Design Software</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES Monohydrat</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Probenhalter 3D-Druck</td><td>i.materialise</td><td><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Petrischalen (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

lichtblatt fluoreszenzmikroskopie von pflanzenwurzeln wachsen auf der oberfläche eines gel

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Eine der Schlüsselfragen zum Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie sich einzelne Zellen in einem größeren Kontext des Gewebes verhalten. Daher erfordert es die Beobachtung des gesamten Organs mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, was zu phototoxischen Effekten führen kann. Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Vorbereitung von Pflanzenproben für die Lichtblattmikroskopie, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Pflanze vertikal auf der Oberfläche eines Gels montiert wird. Die Pflanze ist so montiert, dass die Wurzeln in ein flüssiges Medium getaucht werden, während die Blätter an der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze zu gewährleisten, beleuchtet ein speziell angefertigtes Beleuchtungssystem die Blätter. Um die Wurzeln in der Dunkelheit zu halten, wird die Wasseroberfläche mit schwarzen Plastikfolien abgedeckt. Diese Methode ermöglicht die Langzeitdarstellung der Entwicklung pflanzlicher Organe unter standardisierten Bedingungen.

Dieses Probenherstellungsverfahren ermöglicht den Anbau der Pflanze in der Kammer Mikroskop Probe , während das Wurzelsystem mit einem Lichtbogen Mikroskop (Abbildung 1) zu beobachten. Die Pflanze wächst auf der Oberfläche einer Schicht aus Gel (½ MS Medium , 1,5% Gellangummi enthielt) auf einem kundenspezifischen Probenhalter montiert ist (Abbildung 2). Der Probenhalter ist 3D mit einem transparenten Harz als Material gedruckt. Eine künstlich hergestellte Version die Dimensionen hervorzuheben ist in 2C dargestellt. Die Wurzeln werden in Flüssigkeit (½ MS-Medium) eingetaucht, die kontinuierlich von einem Perfusionssystem aktualisiert wird. Die Blätter bleiben in der Luft und werden kontinuierlich mit einer Lichtintensität von 130 &amp; mgr; Mol / m² / s Herkunft aus blauen und roten LEDs beleuchtet , die über der Anlage (1A, B und 3A-C) in einem Ring angeordnet sind. Der LED-Ring ist in unserer Maschine Werkstatt gefertigt undWir bieten technische Details, wie die LED-Ring in der Abbildung 3 und der Materialliste zu bauen. Die Lichtintensität kann kontinuierlich im Bereich angepasst 30-250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (3D). Das Wurzelsystem wird durch kleine Platten aus einer schwarzen Kunststofffolie Abdecken der Wasseroberfläche (Abbildung 1) schattiert. Jede Streulicht von der Beleuchtung, die durch die Erfassungslinse gesammelt wird , wird durch das GFP - Filter (3E) filtriert. Mit diesem Aufbau wurde 17 h ein Zeitraffer einer wachsenden Arabidopsis Seitenwurzel verzeichnete einen 20X / 0,5 Objektiv (Abbildung 4) verwendet wird . Die seitliche Wurzel hat seinen Ursprung in der Perizykel Zellschicht, die sich innerhalb der primären Wurzel tief liegt. Um die Abbildungseigenschaften noch tiefer im Inneren eines Gewebes für längere Zeitperioden eine höhere Vergrößerung (40x / 0,75) wurde zu demonstrieren, verwendet, um die Bildung eines seitlichen ro einzufangenot von der ersten Stufe bis primordium die Entstehung aus der primären Wurzel innerhalb einer Zeitdauer von 38 h (Figur 5). Eine beispielhafte 2D - Schicht des Datensatzes ist in Fig. 5B. Diese Aufnahme erlaubt es uns , die Dynamik der Seitenwurzelbildung in 3D mit einem zellulärer Auflösung (5A) zu folgen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Anbaubedingungen im Inneren des OpenSPIM Probenkammer. A) Skizze der Imaging - Kammer. Die Pflanze wächst aufrecht auf der Oberfläche eines Gels, montiert auf einem kundenspezifischen Probenhalter eingebaut (siehe auch 2). Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, die kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ausgetauscht wird. Die Blätter der Pflanze in der Luft wachsen und werden von roten und blauen LEDs beleuchtet (siehe auch Abbildung 3). Das Wurzelsystem ist wit schattiert<html> h kleine Blätter eines schwarzen Plastikfolie bedeckt die Wasseroberfläche. Ein Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie verringert weiter die Menge an Licht, unter der Wasseroberfläche und hält Feuchtigkeit in der Probenkammer. Das vergrößerte Panel auf der rechten hebt die Pflanze auf der Oberfläche eines Blocks von Gel in das flüssige Medium eingetaucht wächst. Ein Tropfen Agarose ersteigt die Wurzel auf das Gel. Die gestrichelten Kästchen zeigt die Region von Interesse durch das Mikroskop beobachtet. B) Fotografie der Abbildungskammer (ohne Deckel). Numbers (1) - (10) in A und B: (1): x / y / z / θ-Stufe mit LED - Ring, (2): Probenhalter, (3): Deckel (4): Arabidopsis thaliana (5): Blätter aus schwarzem Kunststoff-Folie, (6): Perfusionssystem, (7): Erkennung Objektivlinse (8): flüssiges Medium, (9): Probenkammer (10): Beleuchtungsobjektivlinse. C) wird der Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie hergestellt.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Probenhalter. A) 3D - Modell. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial zur Verfügung gestellt. B) Fotografie von 3D - Drucke mit unterschiedlichen Materialien (1) - (3): transparentem Acryl Kunststoff, (4) und (5): Harz, (6): transparentes Harz. C) Technische Zeichnung des Probenhalters, Zahlen repräsentieren Millimeter. D) Foto des hergestellten Probenhalter mit einer Anlage montiert. Die gestrichelten Bereich kann durch das Mikroskop beobachtet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> laden / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Pflanzenbeleuchtung Setup. A) Schemaschaltbild der Lampe. Paare von LEDs für die Richtungs Blitz ein- / ausgeschaltet einzeln. LED: Leuchtdiode, R: Widerstand, T: Transistor, JP: Stecknadelkopf. Leiterplatte): B) Das endgültige Design der Beleuchtungslampe wurde mit einer PCB-Software (PCB gezogen. Wir stellen die Board-Design-Datei in dem Zusatzmaterial. Die Platte wurde dann hergestellt und in unserem Institut der MIBA Maschinenhalle zusammengebaut. C) Fotografie des LED - Ring eingeschaltet. Vier Paare von einer roten und einer blauen LED sind in einem Ring angeordnet. D) Der Spannungsbereich zwischen 3,5 V und 14,0 V. Die Widerstände eingestellt werden verwendet , um die Lichtmenge von 30 bis 250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (R1-8 bis hin zu erreichen: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) Das Emissionsspektrum der Lampe, und GFP YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Abbildung 4: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Die 5-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 217 Bilder (3 &amp; mgr; m z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 17 h Aufnahme mit Hilfe einer Linse 20X / 0.5 erfasst. A) Vier Zeitpunkte von 69 sind in einer maximalen Intensitätsprojektion gezeigt. B) Sechs von 217 einzelnen Scheiben eines z-Stapel von einem Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken in A und B 100 um.Last / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Abbildung 5: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Der 6-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 200 Bildern (1,5 um z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 38 h Aufnahme unter Verwendung einer Linse 40x / 0,75 erfasst. A) 3D - Rendering von vier Zeitpunkten stellen die Zahlen in der Tabelle um, B) einzelne Scheibe durch die zentrale Ebene der Hauptwurzel. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Bitte</a>hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Das 3D-Modell-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Datei LED Ring Board.brd. Die Board-Design-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Vorbereitung von Pflanzenproben für die Lichtblattmikroskopie. Der Aufbau zeichnet sich dadurch aus, dass die Pflanze vertikal auf der Oberfläche eines Gels montiert und unter kontrollierten hellen Bedingungen wachsen gelassen wird. Dies ermöglicht eine langfristige Beobachtung der Entwicklung pflanzlicher Organe unter standardisierten Bedingungen.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Langzeitbeobachtungen eines Pflanzenwurzelsystems mithilfe der Lichtblattmikroskopie durchzuführen. Dazu ist es entscheidend, eine schonende Probenvorbereitung, kontrollierte Wachstumsbedingungen und eine Bildgebungstechnik zu verwenden, die die Pflanzenentwicklung nicht beeinträchtigt, beispielsweise die Lichtblattmikroskopie. Zunächst werden Pflanzen auf der Oberfläche einer zwei Millimeter dünnen Gelschicht kultiviert.Das Gel mit dem Aribidopsis-Keimling wird anschließend ausgeschnitten, herausgeschöpft und auf den Mikroskopprobenträger übertragen. Im Inneren des Mikroskops wächst die Pflanze in ihrer natürlichen aufrechten Position. Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft verbleiben.Ein Beleuchtungssystem beleuchtet ausschließlich die Blätter. Die Wasseroberfläche ist abgedeckt, um die Wurzeln im Dunkeln zu halten. Einer der Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie beispielsweise dem Einbetten der Wurzel in ein Gel, besteht darin, dass wir daran gewöhnt sind, Pflanzen auf der Oberfläche eines Gels zu kultivieren.Daher können wir die gleiche Kultivierungsprotokoll wie zuvor beibehalten. Zweitens steht die Wurzel in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, das beispielsweise für Wirkstoffbehandlungen ausgetauscht werden kann. Geben Sie 30 Milliliter frisch autoklaviertes MS-Medium der halben Konzentration, das 1,5 Prozent Phytogel enthält, in eine rechteckige Petrischale, um eine Schicht von etwa 2 Millimetern zu erzeugen.Säen Sie sterile Samen nebeneinander mit einem Abstand von mindestens einem Zentimeter. Wickeln Sie die Platte anschließend mit Mikroporenband ein. Kultivieren Sie die Platte bis zu 10 Tage lang senkrecht im Wachstumsinkubator.In diesem Experiment verwenden wir sechs Tage alte Pflanzen, um die Entwicklung von Seitenwurzeln zu beobachten. Wir stellen ein Modell zum 3D-Druck der Probenträger bereit. Wir haben verschiedene Materialien getestet.Die transparenten Harze eigneten sich am besten hinsichtlich Steifheit und Wasserbeständigkeit. Eine detaillierte Beschreibung der Abmessungen zur Herstellung eines Probenträgers aus festem Material ist in der Arbeit enthalten. Schneiden Sie das Gel um die Pflanze mit einem Skalpell herum aus.Danach den Gelblock, auf dem die Pflanze wächst, vorsichtig aufnehmen und behutsam in den Probenträger überführen. 1 Prozent Agarose bei 80 Grad Celsius schmelzen und auf 33 Grad Celsius abkühlen lassen. Den Gelblock auf dem Probenträger fixieren und die Pflanze vorsichtig auf dem Gel befestigen.Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Position der Pflanze zu überprüfen, und stellen Sie sicher, dass der interessierende Bereich nicht von einem Gel bedeckt ist. Um zu verhindern, dass die Pflanze austrocknet, schieben Sie den Probenträger nach Möglichkeit auf eine Pipettenspitze mit einem Volumen von 1.000 µL. Stellen Sie den Träger auf eine Pipettenspitzenbox und bereiten Sie bei Bedarf weitere Proben vor.Unser Mikroskop ist ein klassisches Open-Spin-Modell ohne wesentliche Modifikationen. Wir haben ein Beleuchtungssystem implementiert, um Pflanzen innerhalb des Mikroskops kultivieren zu können. Rote und blaue LEDs sind ringförmig angeordnet.LED-Paare können einzeln ein- und ausgeschaltet werden, um eine gezielte Beleuchtung zu ermöglichen. Das Spektrum des Beleuchtungssystems entspricht dem unserer Wachstumskammern. Fast das gesamte von den LEDs ausgehende Licht wird durch einen Emissionsfilter für GFP blockiert.Wir konnten kein Streulicht nachweisen, das die Kamera erreicht. Daher kann das Licht während der Aufnahme eingeschaltet bleiben. Die Lichtintensität kann zwischen 30 und 250 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde eingestellt werden.Schrauben oder kleben Sie den LED-Ring an die Unterseite des offenen Spin-Stage-Arms. Bringen Sie ihn wieder am Mikroskop an und schließen Sie die Kabel an. Bauen Sie das Perfusionsystem zusammen.Verbinden Sie die Schläuche mit der Probenkammer in einer Einweg-Anordnung. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf einen Milliliter pro Minute ein. Geben Sie drei Millimeter große Quadrate aus sterilem schwarzem Kunststofffolie hinzu und verteilen Sie sie auf der Wasseroberfläche.Fügen Sie die Probe in das Mikroskop ein. Stellen Sie sicher, dass keine Kunststofffolien am Probenhalter haften. Schließen Sie die Kammer mit zwei Deckeln aus schwarzem Aluminiumfolie.Schalten Sie das Licht ein und stellen Sie die Lichtintensität ein. Schalten Sie das Raumlicht aus und beginnen Sie mit der Aufnahme. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung des Wurzelwachstums über mehrere Stunden bis hin zu Tagen, hier dargestellt am Wachstum einer Seitenwurzel.Bilder eines Z-Stapels eines einzelnen Zeitpunkts zeigen gute optische Schnitteigenschaften. Wir haben den gesamten Prozess der Seitenwurzelbildung in 3D erfasst, was es uns ermöglicht, die Dynamik dieses Vorgangs zu untersuchen. Die Betrachtung einer einzelnen Ebene dieser Aufnahme zeigt eine gute Auflösung, selbst tief im Inneren der Wurzel.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie die Methode zur Probenvorbereitung von Pflanzen für die Lichtblattmikroskopie klar verstehen. Mithilfe dieses Protokolls können wir nun die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen oder Muster der Genexpression während der Organogenese, bei Pflanzentropismen oder der Pflanzenanpassung untersuchen. Dies wird uns helfen, die räumlich-zeitliche Regulation der Pflanzenentwicklung zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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