Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Langzeitbeobachtungen eines pflanzlichen Wurzelsystems mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie zu erfassen. Um dies zu erreichen, ist eine schonende Probenvorbereitungsmethode, kontrollierte Wachstumsbedingungen und ein bildgebendes Verfahren, das die Pflanzenentwicklung nicht verändert, wie z. B. die Lichtblattmikroskopie, unerlässlich. Zu Beginn werden die Pflanzen auf der Oberfläche einer zwei Millimeter dünnen Schicht Gel gezüchtet.

Das Gel mit einem Aribidopsis-Keimling wird dann ausgeschnitten, geschöpft und auf den Probenhalter des Mikroskops übertragen. Im Mikroskop wächst die Pflanze in ihrer natürlichen aufrechten Position. Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, während die Blätter an der Luft bleiben.

Ein Beleuchtungssystem beleuchtet nur die Blätter. Die Wasseroberfläche ist abgedeckt, um die Wurzeln im Dunkeln zu halten. Einer der Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. dem Einbetten der Wurzel in das Gel, besteht darin, dass wir es gewohnt sind, Pflanzen auf der Oberfläche eines Gels zu züchten.

Daher können wir uns an das gleiche Anbauprotokoll wie zuvor halten. Und zweitens steht die Wurzel in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, das zum Beispiel für medikamentöse Behandlungen ausgetauscht werden kann. Gießen Sie 30 Milliliter frisch autoklaviertes halbstarkes MS-Medium mit 1,5 Prozent Phytogel in eine quadratische Petrischale, um eine Schicht von etwa 2 Millimetern zu erhalten.

Säen Sie sterile Samen nebeneinander mit mindestens einem Zentimeter Abstand dazwischen. Wickeln Sie die Platte dann mit einem mikroporigen Klebeband ein. Kultivieren Sie die Platte in Ihrem Wachstumsinkubator bis zu 10 Tage lang vertikal.

In diesem Experiment verwenden wir sechs Tage alte Pflanzen, um die Entwicklung der Seitenwurzeln zu beobachten. Wir stellen ein Modell für den 3D-Druck des Probenhalters zur Verfügung. Wir haben verschiedene Materialien getestet.

Die transparenten Harze waren in Bezug auf Steifigkeit und Wasserbeständigkeit am besten geeignet. Eine detaillierte Beschreibung der Abmessungen zur Bearbeitung eines Probenhalters aus Vollmaterial ist in der Handschrift beschrieben. Schneiden Sie das Gel mit einem Skalpell um die Pflanze herum.

Nimm dann den Gelblock, auf dem die Pflanze wächst, und gib ihn vorsichtig in den Probenhalter. 1 Prozent Aggros bei 80 Grad Celsius schmelzen und auf 33 Grad Celsius abkühlen lassen. Kleben Sie den Gelblock auf den Probenhalter und kleben Sie die Pflanze vorsichtig auf das Gel.

Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Position der Pflanze zu überprüfen, und stellen Sie sicher, dass der interessierende Bereich nicht von einem Gel bedeckt ist. Um ein Austrocknen der Pflanze zu verhindern, schieben Sie den Probenhalter nach Möglichkeit auf eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze. Setzen Sie den Halter auf einen Pipettenkasten und bereiten Sie bei Bedarf weitere Proben vor.

Unser Mikroskop ist ein klassisches Open-Spin-Mikroskop ohne größere Modifikationen. Wir implementierten ein Beleuchtungssystem für die Kultivierung von Pflanzen im Mikroskop. Rote und blaue LEDs sind in einem Ring angeordnet.

LED-Paare können für eine gerichtete Beleuchtung individuell ein- und ausgeschaltet werden. Das Spektrum des Beleuchtungssystems entspricht dem in unseren Wachstumskammern. Fast die gesamte Beleuchtung, die von den LEDs kommt, wird durch einen Emissionsfilter für GFP blockiert.

Wir konnten kein Streulicht feststellen, das die Kamera erreichte. So kann das Licht während der Bildgebung eingeschaltet bleiben. Die Lichtintensität kann eingestellt werden und reicht von 30 bis 250 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde.

Schrauben oder kleben Sie den LED-Ring an der Unterseite des offenen Spin-Stage-Arms. Montieren Sie es wieder am Mikroskop und schließen Sie die Drähte an. Montieren Sie das Profusion-System.

Verbinden Sie die Röhrchen in einer Einweganordnung mit der Probenkammer. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf einen Milliliter pro Minute ein. Geben Sie drei Millimeter große Quadrate einer sterilen schwarzen Plastikfolie hinzu und verteilen Sie sie auf der Wasseroberfläche.

Führen Sie die Probe in das Mikroskop ein. Vergewissern Sie sich, dass keine Plastikfolien am Probenhalter kleben. Verschließen Sie die Kammer mit zwei Deckeln aus schwarzer Aluminiumfolie.

Schalten Sie das Licht ein und stellen Sie die Lichtintensität ein. Schalten Sie das Raumlicht aus und starten Sie die Aufnahme. Diese Methode ermöglicht es, das Wurzelwachstum über mehrere Stunden bis hin zu Tagen zu erfassen, hier dargestellt durch das Wachstum einer Seitenwurzel.

Bilder eines Z-Stapels eines einzelnen Zeitpunkts zeigen gute optische Schnitteigenschaften. Wir haben den gesamten Prozess der lateralen Wurzelbildung in 3D erfasst, was es uns ermöglicht, die Dynamik dieses Prozesses zu untersuchen. Wenn man sich eine einzelne Scheibe dieser Aufnahme ansieht, zeigt sich eine gute Auflösung, sogar tief in der Wurzel.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis von der Methode zur Vorbereitung von Pflanzenproben für die Lichtblattmikroskopie haben. Nach diesem Protokoll sind wir nun in der Lage, die intrazelluläre Proteinlokalisierung oder Genexpressionsmuster während der Organogenese, pflanzlicher Tropismen oder pflanzlicher Anpassung zu untersuchen. Dies wird uns helfen, die räumlich-zeitliche Regulation der Pflanzenentwicklung zu verstehen.