Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein robustes, reproduzierbares und einfaches Verfahren zur Isolierung primärer Myoblasten von erwachsenen und älteren Menschen bereitzustellen. Dieses Protokoll schlägt einen optimierten Arbeitsablauf für die Isolierung primärer humaner Myoblasten als In-vitro-Modell für funktionelle Untersuchungen von Prozessen vor, die mit der Muskelhomöostase während des Alterns assoziiert sind. Durch die Vermeidung von Belastungsfaktoren wie der Zentrifugation erhält dieses Protokoll das natürliche Zellverhalten aufrecht und ermöglicht die Isolierung sowie die Langzeitkultur primärer Myoblasten zur Erhaltung des Phänotyps.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine 60-Milliliter-Petri-Schale oder zwei Vertiefungen einer sechs-Vertiefungs-Platte vorbereiten. Anschließend pipettieren Sie eine minimale Menge an Laminin-Lösung, um die Oberfläche der Schale vollständig zu bedecken. Danach inkubieren Sie die Kulturschale mindestens 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen ansäen.

Bereiten Sie anschließend die enzymatische Lösung in serumfreiem DMEM vor. Mischen Sie die enzymatische Lösung gründlich und filtrieren Sie sie zur Sterilisation durch eine 0,2-Mikrometer-Filtermembran. Nach der Probenentnahme bewahren Sie den Muskel bis zur Verdauung bei vier Grad Celsius in DPBS auf.

Bereiten Sie mindestens zwei Milliliter enzymatische Lösung für 18 bis 20 Milligramm Muskelgewebe vor und erwärmen Sie diese vor der Gewebe-Dissociation auf 37 Grad Celsius. Tauchen Sie die Muskelbiopsie anschließend kurz in 70 Prozentigen Ethanol ein. Waschen Sie sie mit frischem DPBS und danach erneut mit 70 Prozentigem Ethanol, und legen Sie das Gewebe dann in eine neue Petrischale mit ausreichend enzymatischer Lösung, um die Probe vollständig zu bedecken.

Entfernen Sie so viel fettiges und fibrotisches Gewebe wie möglich und zerreien Sie den Muskel vorsichtig in kleine, aber erkennbare Stücke. Danach überführen Sie die Probe in ein 50-Milliliter-Gefäß mit mindestens einem Milliliter enzymatischer Lösung. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius bis zu 30 oder 40 Minuten lang und bewegen Sie das Muskelgewebe, indem Sie das Gefäß alle fünf bis zehn Minuten vorsichtig schütteln.

Als Nächstes beschichten Sie die Pipetten mit Medium, um eine Adhäsion der freigesetzten Zellen an der Plastikwand der Pipetten zu vermeiden. Geben Sie dann vier Milliliter steriles Wachstumsmedium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Freisetzung der Zellen aus den Muskel­fasern zu unterstützen.

Filtern Sie anschließend die Muskelzelllösung durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Waschen Sie die verbleibenden Zellen mit zusätzlichem Medium und filtrieren Sie diese erneut durch den Sieb.

Zentrifugieren Sie die Probe anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Nach fünf Minuten das Überstandsvolumen vorsichtig entfernen. Danach das Pellet in F12-Wachstumsmedium auflösen.

In diesem Schritt nehmen Sie den zuvor mit Laminin beschichteten Kulturgefäßbehälter aus dem Inkubator. Entfernen Sie vorsichtig den Überschuss an Laminin aus der Kulturschale und vermeiden Sie es, die Oberfläche zu berühren. Anschließend spülen Sie die Kulturschale vorsichtig mit DPBS aus.

Als Nächstes die Zellen direkt auf das mit Laminin beschichtete Gefäß geben und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag die Zellen im Hellfeldmikroskop sichtbar machen.

Kleine runde Zellen heften sich an der Oberfläche an, und der verbleibende Zelltrümmer sollte im Kulturmedium sichtbar sein. Danach wechseln Sie das Medium auf frisches F12-Medium. Wechseln Sie in diesem Verfahren das Medium alle zwei bis drei Tage und passagieren Sie die Zellen, sobald Zellansammlungen unter dem Mikroskop sichtbar sind, um eine spontane Differenzierung zu vermeiden.

Entfernen Sie für das Passagieren der Zellen das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie die geringste Menge an 0,25 Prozent EDTA-Trypsin hinzu, die benötigt wird, um die Zellenoberfläche zu bedecken. Schwenken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Zellen von der Ablösungslösung benetzt sind, und inkubieren Sie dann 10 Sekunden bei Raumtemperatur, bevor Sie sie entfernen.

Anschließend die Zellen für drei bis fünf Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vorsichtig klopfen und unter dem hellen Mikroskop überprüfen, ob die Zellen aufgerundet, aber noch nicht vollständig von der Oberfläche gelöst sind. Danach fünf Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen, um die Zellen zu sammeln, gut vermischen und die Zellen mit dem neuen Medium in einen T75-Fläschchen überführen.

Anschließend die verbleibenden Zellen mit weiteren 5 Milliliter Wachstumsmedium waschen. Um im ersten Passagierschritt vorzuinkubieren, die Zellen 40 Minuten bis eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach das Überstand-Medium, das die nicht angehefteten Zellen enthält, sammeln und in einem neuen T75-Fläschchen inkubieren.

Dadurch sollte die Kultur und die Myoblasten angereichert werden, da sich die meisten Fibroblasten im ersten Kolben angeheftet haben sollten. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und teilen Sie die Zellen, sobald sie eine Konfluenz von 70 Prozent erreicht haben.

Für die Differenzierung wechseln Sie das Kulturmedium, sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, auf Differenzierungsmedium. Die Zellen sollten sich innerhalb von fünf bis sieben Tagen differenzieren, abhängig von der Qualität und Reinheit der Myoblastenkultur. Im Durchgang null und nach fünf Tagen nach der Aussaat sind die Zellen noch rund und klein, aber unter hellem Lichtmikroskop sichtbar.

Die Myoblasten nehmen dann eine längliche Form wie im Passagierungsprozess an. Wie hier gezeigt, wird MyoD in Myoblasten exprimiert, nicht jedoch in Fibroblasten. Menschliche primäre Myoblasten können mittels Färbung auf Zellviabilität, Ki67-Immunfärbung zur Bestimmung der Proliferation, MF20-Immunfärbung zur Bestimmung der Differenzierung und seneszenzassoziiierter Betagalactosidase-Färbung für Seneszenz-Assays charakterisiert werden.

Primäre Myoblasten können für Funktionsassays verwendet werden. In dieser Abbildung zeigen die MF20-Immunfärbungen differenzierter primärer Myotubuli von erwachsenen Menschen die Auswirkungen einer Überexpression oder Hemmung von miR-378 auf Größe und Anzahl der Myotubuli. QPCR-Analysen zeigen, dass die Transfektionen mit dem miR-378-Mimetikum und dem Anti-miR erfolgreich waren und zu Veränderungen in der relativen Expression von miR-378 und LGF1R, einem validierten Zielgen von miR-378, nach Überexpression oder Hemmung von miR-378 in humanen primären Myoblasten führten.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Dieses robuste und reproduzierbare Protokoll ist besonders nützlich, wenn andere, anspruchsvollere und teurere Methoden wie die Zellsortierung nicht möglich oder praktikabel sind. Diese vereinfachte Technik ist für Forscher auf dem Gebiet der Muskelforschung nützlich, um das Phänomen der Alterung in humanen in-vitro-Modellsystemen zu untersuchen.

Zusammenfassend ermöglicht diese vorgeschlagene Methode die Isolierung myogener Vorläuferzellen aus dem Muskelgewebe nicht nur erwachsener, sondern auch älterer Menschen für funktionelle Untersuchungen in vitro, die ebenfalls auf Tiermodelle angewendet werden können.