Name: Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur primärer Myoblasten aus Skelettmuskel adulter und alter Menschen. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen zur Untersuchung von Muskelhomöostase und Alterung.

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Diese Arbeit wird unterstützt vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), das MRC und Arthritis Research UK als Teil des MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) und der Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). Die Autoren danken Dr. Dada Pisconti (University of Liverpool) für ihre Expertise und Beratung bei der Isolierung von Muskelvorläuferzellen.

Alle Experimente beschrieben menschliches Gewebe beteiligt hier wurde im Vorfeld von der University of Liverpool, University Hospital Aintree Krankenhaus und South West Wales Forschungsethikkommission (Zulassungsnummer: 13 / WA / 0374) genehmigt und die Experimente wurden nach guter Praxis Führung durchgeführt. Die Universität Liverpool agierte als die Ethik für diese Studie sponsern. Alle Geber haben Einverständnis für die Einschreibung dieser Studie gegeben. Die Muskeln wurden aus Menschen isoliert (BMI &lt;25): Erwachsener: 30 ± 2,8 Jahre alt und im Alter von: 69 ± 5 Jahre alt. 1. Vorbereitung für die Kultur <ol><li> Beschichtung von Kulturflächen mit Laminin <ol><li> Bereiten einer Arbeitslösung von 10 ug / ml Laminin in 1x DPBS (Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline). </li><li> Pipette eine minimale Menge an Laminin Lösung die Oberfläche vollständig abdecken , auf die Zellen werden zu plattierenden (Tabelle 1). inkubieren ter Kulturschale mindestens 30 min in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator vor dem Ausplattieren der Zellen. Griff Laminin sorgfältig die Verwendung von Wirbel vermeiden. Die Arbeitslösung von 10 &amp; mgr; g / mL Laminin in DPBS verdünnt kann bei 4 ° C und wiederverwendet mehrmals gespeichert werden. </li><li> Verwenden Sie eine 60 mm (20 cm 2) Petrischale oder 2 Vertiefungen in einer 6-Well - Platte (2 x 10 cm 2) pro ~ 18 - 19 mg der Skelettmuskulatur auf die Platte , die Zellen (5,50 x 10 4 Zellen insgesamt). Durchführen zu allen Zeiten Zellzählung, wenn die Zellen für funktionelle Studien Plattieren. HINWEIS: Die Proben wurden ursprünglich von Fuß-Operationen (extensor digitorum brevis, tibialis anterior oder Entführers Zehen Muskeln) der weiblichen Patienten (Erwachsene: 30 ± 2,8 Jahre alt, im Alter von: 69 ± 5 Jahre alt, BMI &lt;25) erhalten. </li></ol></li><li> Herstellung von Enzymlösung <ol><li> Bereiten 250 mM CaCl 2 Arbeitslösung: 277 mg Lager CaCl 2 in 10 ml 1x DPBS. Filtern Sie die solution mit einer 0,2 &amp; mgr; m Filtermembran und lagern bei 4 ° C. </li><li> Bereiten einer Arbeitslösung von 1,5 U / ml Kollagenase D, 2,4 U / ml Dispase II und 2,5 mM CaCl 2 in serumfreiem DMEM (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium) (Tabelle 2). </li><li> Gut mischen und filtern die enzymatische Lösung durch einen 0,2 &amp; mgr; m Filtermembran für die Sterilisation. Bereiten Sie die enzymatische Lösung im Voraus und froren (-20 ° C) in Teilmengen für die zukünftige Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Die Gewebe Verdauung: Mechanische und enzymatische Dissoziation <ol><li> Im Anschluss an die Probenentnahme halten Muskel bei 4 ° C in DPBS, bis die Verdauung. Bereiten Sie ein Mindestvolumen von 2 ml Kollagenase-Dispase-CaCl 2 -Lösung pro 18 - 19 mg des Muskelgewebes und warm es auf 37 ° C vor Gewebedissoziation. </li><li> Tauchen Sie die Muskelbiopsie kurz in 70% Ethanol, waschen mit frischem DPBS und legen Sie das Gewebe auf eine neue Petrischale mit 1 ml EnzymLösung. </li><li> Entsorgen Sie so viel fibrotische und Fettgewebe wie möglich und reißen schnell den Muskel , aber vorsichtig in kleinen , aber unterscheidbare Stücke (etwa&gt; 0,5 mm 2) mit einer sterilen Schere oder einem chirurgischen Skalpell (Klinge No. 10). </li><li> Übertragung der Probe in ein 50 ml - Röhrchen mit den restlichen 1 ml der Kollagenase-Dispase-CaCl 2. </li><li> Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C bis zu 30 - 40 min. Bewegen Sie das Muskelgewebe durch sanft das Rohr Rühren alle 5 - 10 min. </li><li> Coat die Pipetten mit Medien, um die Haftung der freigesetzten Zellen an den Kunststoffwänden der Pipetten zu vermeiden. Hinzufügen 2 Volumina sterilem Wachstumsmedium, beispielsweise 4 ml DMEM 20% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% L-Glutamin und 1% P / S (Penicillin-Streptomycin), um die Verdauung zu stoppen. </li><li> Pipettieren nach oben und unten mehrmals mit einer 5-ml-Pipette die Freisetzung der Zellen aus den Muskelfasern zu helfen. HINWEIS: Die Probe wird in der Regel vollständig dissoziiert aufgrund seiner geringen Größe. However, wenn Fragmente von Muskel bleiben noch eine zweite Inkubation mit den verbleibenden Muskelstücke verwenden und mit frischer Enzymlösung. </li><li> Filtern Sie die Muskel-Lösung durch ein 70 &amp; mgr; m Zelle Sieb über einen 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die restlichen Zellen mit mehr Medien und Filter durch das Sieb. </li><li> Zentrifuge bei 443 × g für 5 min bei RT um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Auflösen des Pellets in F-12 Medium (Ham F-12 Nutrient Mix), 20% FBS, 10% HS (Pferdeserum), 1% P / S, 1% α-Glutamin und 2,5 ng / ml FGF-b ( rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor). Hier verwenden 4 ml Medium pro 60 mm Petrischale. </li></ol> 3. Seeding von Zellen <ol><li> Sammeln Sie die Kulturgefäß vorher mit 10 ug / ml Laminin aus dem Inkubator beschichtet (Abschnitt 1.1). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überschuss von Laminin aus der Kulturschale und berühren nicht die Oberfläche (oder es wird die Proteinstruktur stören). Waschendie Kulturschale mit DPBS (optional). </li><li> Platte , die Zellen direkt auf dem Laminin beschichteten Behälter und Inkubation für 24 Stunden in einem befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen unter dem Hellfeld-Mikroskop (100X Gesamtvergrößerung) am folgenden Tag. Rund kleinen Zellen an die Oberfläche gebunden und die verbleibenden Bruchstücke können in dem Kulturmedium zu sehen. </li><li> Ändern, um die Medien zu frischen F-12 Medium mit 20% FBS ergänzt, 10% HS, 1% P / S, 1% α-Glutamin und 2,5 ng / ml FGF-b. </li></ol> 4. Kultur und Passagierung der Zellen <ol><li> Ändern Sie die Medien jeden 2 - 3 d und teilen Sie die Zellen, sobald Gruppen von Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind (100X Gesamtvergrößerung, beispielsweise in 2 - Zellen von alten Menschen, Passage 0 nach 7 d) , um spontan zu vermeiden Differenzierung. </li><li> Bei der ersten Passage (P1), ändern die Medien mit hohem Glucose DMEM mit 20% FBS ergänzt, 10% HS, 1%P / S, 1% α-Glutamin. Vermeiden Sie FGF-b von diesem Punkt mit, wie FGF ein potentes Mitogen und wichtiger Faktor zu Beginn der Kultur ist, aber es kann Fibroblasten-Überwucherung zu fördern, wenn mehr in Kultur verwendet. </li><li> Für Zell Passagierbarkeit: <ol><li> Entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. </li><li> Fügen eine Mindestmenge an 0,25% EDTA-Trypsin die Oberfläche der Zellen zu bedecken. Schaukeln sanft, um sicherzustellen, alle Zellen durch die Entfernungslösung abgedeckt werden, Inkubation für 10 Sekunden bei Raumtemperatur, und entfernen Sie es. </li><li> Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für 3 bis 5 min. Tippen Sie sanft und überprüfen unter dem hellen Lichtmikroskop (100X Gesamtvergrößerung), dass die Zellen abgerundet sind aber nicht vollständig von der Oberfläche gelöst. Wenn keine Änderung in den Zellen beobachtet wird, für weitere 5 min inkubiert. </li><li> 5 ml Wachstumsmedium (High-Glucose-DMEM mit 20% FBS ergänzt, 10% HS, 1% P / S, 1% α-Glutamin), um die Zellen zu sammeln, mischengut und übertragen Sie die Zellen mit den neuen Medien in eine T75-Flasche. Waschen der verbleibenden Zellen diesen Schritt mit weiteren 5 ml Wachstumsmedium (10 ml insgesamt für einen T75-Kolben) zu wiederholen. </li><li> Zu Vorbeschichtungszyklus (bevorzugt am ersten Durchgang), inkubiere die Zellen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 40 min. Sammeln Sie den Überstand mit den Zellen, die nicht befestigen und brüten sie in einem neuen T75-Flasche. Dies sollte die Kultur in Myoblasten bereichern, da die meisten der Fibroblasten sollte in dem ersten Kolben angebracht sind. </li></ol></li><li> Ändern Sie die Medien jeden 2 - 3 d und spaltete sich die Zellen 1 bis 4, sobald sie 70% Konfluenz für eine maximale Ausbeute erreicht. </li><li> Zur Unterscheidung erreicht, sobald die Zellen 70-80% Konfluenz, ändern Sie das Kulturmedium zu Differenzierungsmedium (DM): High-Glucose-DMEM mit 2% HS ergänzt, 1% P / S, 1% α-Glutamin. 7 d abhängig von der Qualität und Reinheit der Myoblasten c - Die Zellen sollten innerhalb von 5 unterscheidenulture. </li></ol> 5. Transfektionen Protokoll <ol><li> Seed 50.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte für MF 20, Seneszenz und Lebensfähigkeitstests. Kultur-Zellen auf Deckgläser oder in einer Schale mit Laminin beschichtet. Für Ki67-Färbung, Samen 25.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte. </li><li> Für Transfektionen folgen Sie den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 5 ul Transfektionsreagenz, 100 nM von Steuer microRNA nachahmen oder Inhibitor, 100 nM von microRNA Mimik oder 100 nM von microRNA-Inhibitor pro Vertiefung, mit einem Gesamtvolumen von 1 ml. </li><li> Wechsel zur Differenzierung Medium 6 h nach der Transfektion (high-glucose DMEM ergänzt mit 2% HS, 1% P / S, 1% α-Glutamin). Für Proliferationsexperimente, färben die Zellen 2 d nach der Transfektion; für Seneszenz, 7 d nach der Transfektion; und für MF20-Färbung, sieben Tage nach der Transfektion. </li></ol> 6. Immunostaining der Zellen <ol><li> Ki67, MyoD und MF 20 Immunfärbung <ol><li> Bereiten Sie Block 1 (10% HS und 0,1% Triton-X in PBS) und Block 2 (10% HS und 0,05% Triton-X in PBS) -Lösungen. Verwenden Sie 500 ul Reagenz pro Vertiefung für eine 12-Well-Platte. HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte, um einen Schüttler für die Inkubation Schritten. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Zellen. </li><li> Spülen Sie die Zellen mit PBS. </li><li> Fixieren Sie die Zellen mit kaltem Methanol für 10 min auf einer Wippe. </li><li> Entfernen des Methanols aus den Zellen und Spülen mit PBS 3x für jeweils 5 min. </li><li> In Block 1-Lösung und Inkubation die Zellen auf einer Wippe bei RT für 1 h. </li><li> In primären Antikörperlösung: für Ki67-Färbung, verwenden Sie Kaninchen-mAb an Ki67 (1: 1000 Verdünnung in Block 2); für MyoD, MyoD1 (D8G3) XP Kaninchen mAb (1: 100 Verdünnung in Block 2) verwenden; für MF 20 Färbung Verwendung MYH1E (MF 20) primärer Antikörper (DSHB, 1: 1000 Verdünnung in Block 2). </li><li> Inkubieren der Zellen mit dem Primärantikörper für 1 h (RT) zu O / N (4 ° C) auf einer Wippe. </li><li> Sammeln Sie die primäre AB (es mehrmals wiederverwendet werden können, wenn storot bei 4 ° C). </li><li> Spülen Sie die Zellen 3x mit PBS, jeweils 5 min. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper: für Ki67 oder MyoD Färbung, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488-Konjugat (1: 1000 Verdünnung in PBS); für MF 20 Anfärbung, Ziege-anti-Maus IgG (H + L) sekundären Antikörper, Alexa Fluor 488-Konjugat (1: 1.000 Verdünnung in PBS). </li><li> Wickeln Sie die Platte mit den Zellen und Inkubation sekundärer Antikörper für 2 Stunden im Dunkeln auf einer Wippe bei RT. </li><li> Spülen Sie die Zellen für jeweils 5 min mit PBS 3x. </li><li> Hinzufügen DAPI-Lösung (1: 1000 Verdünnung in PBS) auf die Zellen und inkubiere an der Wippe bei RT während 5 - 10 min. </li><li> Spülen Sie die Zellen für jeweils 5 min mit PBS 3x. </li><li> 1 ml frischem PBS. </li><li> Montieren Sie die Zellen auf den Deckgläsern in Montagelösung oder versiegeln Sie die Platte, die die Zellen in PBS mit Parafilm enthält, um Verdunstung zu vermeiden. </li><li> Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen mitdas Fluoreszenzmikroskop so schnell wie möglich (spätestens 2 Wochen). </li></ol></li><li> Viability Assay <ol><li> Entfernen Sie die Medien aus den Zellen. </li><li> Spülen Sie die Zellen in PBS. </li><li> 1: 1000 Ethidiumbromid und 1: 1000 Acridinorange in PBS verdünnt. Vorsicht: Achten Sie darauf und arbeiten in Gesundheits- und Sicherheitsbestimmungen - Ethidiumbromid ist krebserregend. </li><li> Wickeln Sie die Platte, die die Zellen in Färbelösung enthält, und Inkubation bei RT auf der Wippe 5 min. </li><li> Nehmen Sie Bilder der Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop: grünen Kanal für Acridinorange; Rot-Kanal für Ethidiumbromid. </li></ol></li></ol>

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Es gibt nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir eine einfache, robuste, preiswerte, reproduzierbare und effiziente Methode der Muskelvorläuferzellen / primären Myoblasten von Erwachsenen und im Alter von Menschen aus Streck digitorium brevis zu isolieren, tibialis anterior oder Entführers Zehen Muskeln. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Studien mit humanen primären Myoblasten von Erwachsenen und im Alter von Menschen zu ermöglichen, vor allem, wenn anspruchsvollere Methoden, wie FACS- oder MACS-Sortierung, sind nicht möglich oder nicht praktikabel. Die Isolationsmethode in diesem Manuskript präsentiert dauert ca. 2 Stunden. Während der Muskel Isolierung wurde Muskel in 70% Ethanol gewaschen, um Verunreinigungen zu vermeiden. Stand der Dissoziation des Muskels zu enzymatisch, ist es wichtig, den Muskel in kleine aber sichtbare Stücke zu schneiden, und Zellschäden durch zu viel mincing vermeiden. Die Verdauung führt zur Dissoziation von Muskelfasern und die Freisetzung von Satellitenzellen und myogenen Vorläuferzellen. In unserem Fall für ~ 20 mg der Skelettmuskulatur, ein 60 mm(20 cm 2) Petrischale war die am besten geeignete Oberfläche der Zellen für die Ernte. Die Zellen auf eine größere Oberfläche plattiert zeigte reduzierte Proliferation, während Zellen ausplattiert zeigte eine kleinere Oberfläche Zelltod und Verklumpung erhöht. Nach der Isolierung wurden die Zellen kultiviert und erweitert auf Laminin-bedeckten Platten. Die Verwendung von nicht-beschichteten Oberflächen eher den Erfolg der Isolierung zu verringern. Aus diesem Grund können die Zellen vorzugsweise auf einer vorbeschichteten Oberfläche nach Isolierung direkt geerntet werden. Fibroblasten angereicherten Kulturen vorherrschen anstatt Myoblasten-abgeleitete Zellen, wenn die Zellen auf einer unbeschichteten Oberfläche direkt nach der Isolierung geerntet. Abgesehen von Laminin, die Verwendung anderer Zellanheftung Lösungen wie Matrigel und Kollagenbasis Reagenzien können verwendet werden. Beschichtungslösungen können Wachstumsfaktoren und andere Verbindungen umfassen, die das Zellwachstum fördert, aber diese könnte das Zellverhalten verändern und somit die Versuchsergebnisse. Imunsere Erfahrung, 10 &amp; mgr; g / mL Laminin ist die optimale Konzentration und geeignete Beschichtungs Reagenz für Satellitenzellen und Myoblasten-Anhaftung und Proliferation, da es kein Wachstumsfaktor oder andere Komplemente fehlt. Außerdem ist Laminin von Natur aus in der Basallamina, direkt mit dem sarcolemma verbunden, die eine Schlüsselfunktion in der Satelliten Zellanheftung und die Migration durch die Skelettmuskelfaser spielt. Die Ergänzungen der Kulturmedien kann auch einen nachteiligen Einfluss auf das Verhalten des primären Myoblasten. Beispielsweise Wachstumsfaktor - Gruppen, wie FGFs oder IGFs weisen pleiotrope Wirkungen auf primäre Myoblastenkulturen mit FGF-2 Steuern sowohl mitogene und den programmierten Zelltod Antwort 31. Es ist daher notwendig, konsequent die Kulturbedingungen kontrollieren, vor allem, weil die Unterschiede im Verhalten von primären aus dem Muskel von Erwachsenen und alten Menschen isoliert Myoblasten sind sehr wahrscheinlich auf die Reinheit zu sein of die Kulturen und die Wahrscheinlichkeit von Fibroblasten 35 , die Myoblasten in Kultur während Langzeitkulturen Überholkupplung. Wir haben 1-Stunden-Vorgalvanisierung der Zellen während der ersten Spaltung auf eine nicht-beschichtete Oberfläche verwendet, um die Kontamination der Kulturen mit Fibroblasten zu verringern. Die Methode, die wir beschreiben, ist für von den Muskeln von beiden Erwachsenen und im Alter von Menschen myogenen Vorläuferzellen zu isolieren. Die isolierte Zelle besteht aus einer repräsentativen myogene Zellpopulation , wie durch einen hohen Anteil an myogenen Zellen (MyoD Expression und myogenen Eigenschaften von MF20 Immunofärbung in den 1 und 2 sichtbar) angezeigt und kann als ein in vitro Modell für funktionelle Studien von Prozessen verwendet werden , mit Muskel Homöostase assoziiert. Frühere Studien haben die Isolierung und Unterschiede in den Eigenschaften aus, oder das Fehlen davon, aus primären menschlichen Myoblasten ausErwachsene und alte Menschen 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Die Existenz von geriatrischen und / oder nicht-funktionellen humanen MPCs wurde 6 demonstriert, 20, 22. Es wurde jedoch kein Unterschied im Verhalten von frisch isolierten menschlichen MPCs auch 27 gezeigt. Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung von primären Myoblasten, die zumindest teilweise ihren Phänotyp, wie reduzierte Proliferationspotential oder Seneszenz der primären Myoblasten aus dem Muskel von alten Menschen und ermöglicht die Verwendung von diesen getrennt zu haltenZellen für funktionelle Studien der molekularen Mechanismen der Muskel Homöostase während 22 altert. Die primären Myoblasten hier kann mit dem beschriebenen Verfahren isoliert verwendet werden, nicht nur für myogenic Studien Differenzierung, sondern auch intrazelluläre Veränderungen, wie Veränderungen in der Genexpression zu untersuchen, während der Alterung in der menschlichen myogenic Vorläuferzellen auftreten. Jedoch Änderungen , die in Zellen während längerer ex vivo Kultur auftreten müssen berücksichtigt werden , wenn phänotypische und genotypische Veränderungen analysiert während der Alterung auftreten. Wir empfehlen frisch isolierten Zellen für diesen Zweck verwendet wird. Ferner beschrieben die primäre Myoblasten Kulturverfahren hier ermöglicht Expansion und relativ langfristige Kultur von primären menschlichen Myoblasten, so dass für robust in vitro funktionelle Studien. Wir haben bereits gezeigt, dass myogene Vorläuferzellen unserer Methode isoliert unter Verwendung kann sowohl von Expressionsprofilen und fu verwendet werdennctional Studien von Prozessen im Zusammenhang mit Muskel 22 Alterung. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf die Muskeln von erwachsenen und alten Nagetieren und ermöglicht die Isolierung von einer angereicherten Kultur von Myoblasten , das 22 zum Profilieren genetischen und epigenetischen Veränderungen während des Alterns und funktionelle Studien verwendet werden können. Die Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen die Verwendung von bis zu einem gewissen Grad, gemischten Population von Zellen statt einer reinen Population von Satellitenzellen, die 6 unter Verwendung von anspruchsvolleren publizierten Methoden erhalten werden können, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43. Wir präsentieren eine vereinfachte, kostengünstige und reproduzierbare Protokoll für die Isolierung von primären Myoblasten Zellen von Erwachsenen und im Alter vonMenschen. Nach unserer Erfahrung die zur Verfügung stehenden, anspruchsvollere Verfahren zur Isolierung und Kultur von humanen primären Myoblasten (wie MACS- oder FACS-sortierten Satellitenzellen) sind ideal für einige Arten von Studien, wie Profilierungs transkriptomischen oder Proteom-Veränderungen in den Zellen. Allerdings sind diese Methoden teuer, erfordern zumindest ein gewisses Maß an Know-how und kann schwierig sein, aufgrund der geringen proliferativen Rate von reinen primären Myoblastenkulturen und Fibroblasten zuwachs Myoblasten. Wir präsentieren ein reproduzierbares Protokoll, das die einfache Isolierung und Kultur von humanen primären Myoblasten für die Verwendung in funktionellen Studien ermöglicht. Darüber hinaus schlagen wir die Verwendung von Laminin 42 und die begrenzte Nutzung von bFGF als Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Kultur 44. Wir schlagen vor , auch die durch Zentrifugieren erzeugte Spannung zu vermeiden , wenn die Zellen aufgeteilt und ein Pre-Beschichtungsschritt bei der ersten Passage 45. Um es zusammenzufassen, wir habenein effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Myoblasten / MPL aus den Muskeln von Erwachsenen und im Alter von Menschen optimiert, der auch für die Muskeln von Nagetieren ist und ermöglicht die Expression und funktionelle Untersuchungen der Muskel Homöostase.

Krankheits- und altersbedingte progressive Verlust der Skelettmuskelmasse und Funktionsergebnisse in Schwachheit, Rückgang der Festigkeit und eine Abnahme der Lebensqualität der Menschen im Alter. Die Skelettmuskulatur ist für etwa 40% der Körpermasse 1. Während der Alterung und Krankheit, progressiver Atrophie einzelner Muskelfasern und Reduktion der Muskelqualität aufgrund der Infiltration von Fett und Fibrose auftritt 1, 2, 3, 4, 5, 6. Vor kurzem wurde vorgeschlagen , dass speziesspezifische Unterschiede bei der Alterung von Skelettmuskel auftreten, insbesondere , dass die Muskelfaserverlust bei Nagetieren auftritt, treten möglicherweise nicht in Menschen 7. Dennoch sind die verbleibenden Muskelfasern des gealterten Säugetieren durch erhöhte Anfälligkeit für Beschädigung und die Beeinträchtigung der Regenerations gekennzeichnet <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 8. Erwachsene Muskel - Reparatur und Wartung von Satellitenzellen 9, 10 vermittelt. Bei Muskelverletzungen und andere relevante Signale, werden Satellitenzellen aktiviert und sich vermehren. Eine Teilmenge der Zellen wieder in den Ruhezustand und der Rest schreitet in Myoblasten (Myogenic Progenitor Cells - MPCs). Diese tragen zur Reparatur der bestehenden myofiber 11. Die Funktionalität von Satellitenzellen bestimmt den Erfolg von Muskelregeneration und die Veränderungen in der Satellitenzelle Verfügbarkeit mit dem Altern haben 12 gezeigt worden, 13, 14, 15. Außerdem Satellitenzellen aus dem Muskel von alten Menschen und Nagetieren zeigen einen Transkriptionsprofilschalter und reduziert regenerative Potential 16, 17, </sup&gt; 18, 19. Satelliten - Zellen des Muskels von alten Mäusen und Menschen haben auch in ihrer reduzierten Funktionalität resultierenden 20 gezeigt Seneszenz zu unterziehen. Die meisten etablierten Zelllinie die Untersuchung von Muskel - Homöostase ermöglicht ist murine C2C12 - Zelllinie 21. Eine erhebliche Menge an Studien haben auch murinen primären Myoblasten 22 verwendet. Diese Kulturen haben zu einem signifikanten Verständnis von Maus und wirbel myogenesis sowie Muskelregeneration, Myotube / myofiber Atrophie und Hypertrophie Prozesse während der Muskelerkrankung auftreten und Alterung 23, 24, 25, 26. In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen unter Verwendung von humanen primären Myoblasten beschrieben Alterung Myogenese und Muskel zu untersuchen. Allerdings gibt es keinen Konsens mit regards auf Unterschiede zwischen primären aus dem Muskel von Erwachsenen isoliert Myoblasten und gealterten Menschen 27, 28, 29, 30, 31. Trotz der Unterschiede in der systemischen und lokalen gekennzeichnet Umwelt während der Entwicklung auftreten, Altern und Krankheit 6, 32, 33, 34, In - vitro - Myoblasten und Myotubenkulturen bleiben die am besten zugänglichen Tools für die molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit Muskelentwicklung, Wachstum und Atrophie studieren. Darüber hinaus bieten diese Studien nicht nur robust, sondern auch eine relativ schnelle, kostengünstige und mit hohem Durchsatz in vitro - Werkzeug. Darüber hinaus mit dem Studium der menschlichen Muskeln verbunden sind ethische Implikationen bedeuten, dass für die funktionelle Experimente Manipulationen der Genexpression beteiligt <em&gt;, In vitro menschliche Myoblasten und Myotubenkulturen bleiben die einzige Alternative zu wirbelModellOrganismen zur Verfügung. Hier zeigen wir ein einfaches experimentelles Protokoll für eine robuste, kostengünstige und reproduzierbare Isolierung von primären Myoblasten oder MPCs, aus dem Muskel von Erwachsenen und alten Menschen und beschreiben standardisierten Bedingungen von in - vitro - Kultur (Abbildung 1). Als Primärkulturen von Muskel in der Regel Fibroblasten neben Myoblasten enthalten, empfehlen wir eine Vorabscheidungsschritt bei verbesserter Reinheit und Qualität der primären Myoblasten Ziel. Zusammenfassend haben wir ein Protokoll ermöglicht effiziente und reproduzierbare Isolierung, Kultur und funktionelle Studien von angereichertem und funktionellen MPL / primären Myoblasten aus Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen etabliert.

<table><tbody><tr><td>60 mm Petrischalen</td><td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar Zellkulturschale, PS, 60/15 MM, VENTS.</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten (6 Well)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar Zellkulturplatten. 6 Well, flacher Boden (einzeln verpackt) .&nbsp;</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten (12 Well)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cellstar Zellkultur-Multiwell-Platten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kulturflaschen</td><td>Greiner Bio One</td><td>&nbsp; 690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).</td><td>Cellstar Filter Cap Zellkulturflaschen.</td></tr><tr><td>Standard Einweg-Skalpell</td><td>Granton</td><td>91310</td><td>Sterile Edelstahlklinge, Muster: 10.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)</td><td>Serologische Cellstar Pipetten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur-Kunststoffpipetten</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>3,0 mL graduierte Pasteurpipette (steril), ind. verpackt.</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>300613</td><td>20 mL BD Spritze mit exzentrischer Spitze.</td></tr><tr><td>0,2 &Mikro; m Filter</td><td>Gilson</td><td>ALG422A</td><td>Sterile Spritzenvorsatzfilter CA 0,2 &micro; m 33 mm Pk50.</td></tr><tr><td>Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td>Zellkultursieb steril einzeln verpackt 70 & Mikro; m Polypropylen.</td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td></td><td>Roche 11088882001</td><td>Kollagenase D; Aktivität: &ge; 0,15 U/mg&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td>Dispase II Protease aus Bacillus polymyx. Aktivität: &ge; 0,5 U/mg Feststoff.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>Calciumchlorid, wasserfrei, Kügelchen und Minus; 10 Maschen, &ge; 99,9 % Spurenmetallbasis</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9&nbsp;</td><td>Laminin aus der Basalmembran des Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkoms. 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>DMEM-hoher Glukosegehalt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Mittel - hohe Glukose. Mit 4.500 mg/L Glukose und Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin und Natriumpyruvat.</td></tr><tr><td>F-12 media</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Ham's F-12 Nährstoffmischung. 1x + L-Glutamin.</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>PetroTech</td><td>100-18B&nbsp;</td><td>Rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Fötales Kälberserum.</td></tr><tr><td>Pferdeserum (HS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>Pferdeserum. Spenderherde, Herkunft aus den USA, sterilfiltriert.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Penicillin-Streptomycin mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin pro ml in 0,9 % NaCl, sterilfiltriert.</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>L-Glutamin Lösung. 200 mM, Lösung, sterilfiltriert.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Trypsin-EDTA-Lösung. 0,25%, sterilfiltriert.</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>TrypLE Express Enzym (1x), kein Phenolrot.</td></tr><tr><td>DPBS (Zellkultur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid.</td></tr><tr><td>PBS (Immunfärbung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Phosphatgepufferte Kochsalztablette. Eine Tablette pro 200 ml entionisiertes Wasser (0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4).&nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4000/PC17</td><td>Methanol Analysereagenz in Qualität</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 für die Molekularbiologie.</td></tr><tr><td>anti-MF 20 Antikörper</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 &micro; g/ml.</td><td>MYH1E (MF 20) Maus mAb.</td></tr><tr><td>anti-MyoD-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td></tr><tr><td>anti-Ki67-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Kaninchen mAb auf Ki67 [SP6].</td></tr><tr><td>Anti-Maus 488 Sekundärantikörper&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat.</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-488-Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa-Fluor-488-Konjugat.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td></tr><tr><td>Seneszenz &beta;-Galactosidase-Färbekit</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Seneszenz &beta;-Galactosidase-Färbekit.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>Dimethylsulfoxid. BioUltra, für die Molekularbiologie, &ge; 99,5 % (GC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acridin-Orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>Acridin-Orange-Hydrochlorid-Lösung, 10 mg/ml in H2O.</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Ethidiumbromid-Lösung. BioReagenz, für die Molekularbiologie, 10 mg/ml in H2O.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Scramble-Kontrolle für Transfektionen</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript Inhibitor Neg. Kontrolle (5 nmol)</td></tr><tr><td>Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (zielt auf reife miRNA ab: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miRNA-Inhibitor</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miRNA-Inhibitor (zielt auf reife miRNA ab: has-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 R Zentrifuge</td><td>Heraeus</td><td>75003085</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor</td><td>Heraeus</td><td>3360</td><td>Heraeus Sepatech Megafuge Zentrifuge Rotor BS4402/A. Max. Radius: 15,5 cm.</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Inverses Mikroskop System</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Okulare: CFI 10X/22; Gesamtvergrößerung: 100X (MF20, Live/Dead und Ki67).</td></tr><tr><td>Axiovert 200 inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Okulare: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Gesamtvergrößerung: 100X (Seneszenz &beta;-Galactosidase-Färbung).</td></tr><tr><td>Axiovert 25 inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Okulare: E-PL 10X/20. Gesamtvergrößerung: 100X (Hellfeld).</td></tr><tr><td>Diaphot Inverses Gewebekulturmikroskop</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Okular: CFWN 10X/20. Gesamtvergrößerung: 100X (Hellfeld).</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Hydromount</td></tr></tbody></table>

herstellung und kultur von myogenic vorläuferzellen / primär-myoblasten aus skelettmuskel von adulten und im alter von menschen

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Der Skelettmuskel-Homöostase ist abhängig von Muskelwachstum (Hypertrophie), Atrophie und Regeneration. Während der Alterung und bei verschiedenen Erkrankungen, tritt Muskelschwund. Der Verlust der Muskelmasse und Funktion wird mit Muskelfasertyp Atrophie, Fasertyp Schalt, defekte Muskelregeneration mit einer Dysfunktion von Satellitenzellen, Muskel-Stammzellen und anderen pathophysiologischen Prozessen assoziiert. Diese Veränderungen werden mit den Veränderungen in der intrazellulären verbunden sowie lokale und systemische Nischen. Neben am häufigsten verwendete Nagetiermodellen von Muskel Altern, ist es notwendig Muskel Homöostase zu studieren und mit menschlichen Modellen verschwenden, was durch die ethischen Konsequenzen, überwiegend aus in vitro Kulturen bestehen. Trotz der breiten Verwendung von menschlichen Myogenic Progenitorzellen (MPL) und primären Myoblasten in myogenesis, gibt es nur wenige Daten zur humanen primären Myoblasten und Myotuben Kulturen zu untersuchen Regulierung molekularen Mechanismen verschiedene Aspekte des altersassoziierten Muscle Verschwendung, bei der Validierung von Mechanismen der Unterstützung in Nagetier Muskel vorgeschlagen Altern. Die Verwendung von menschlichen MPL, primären Myoblasten und Myotuben von Erwachsenen und alten Menschen isoliert, ein physiologisch relevanten Modell der molekularen Mechanismen von Prozessen mit Muskelwachstum verbunden sind, Atrophie und Regeneration. Hier beschreiben wir im Detail eine robuste, kostengünstige, reproduzierbare und effizientes Protokoll zur Isolierung und Wartung von menschlichen MPCs und ihre Nachkommen - Myoblasten und Myotuben aus menschlichen Muskelproben unter Verwendung von enzymatischem Verdau. Darüber hinaus haben wir die Passage Zahl , bei der primären Myoblasten von Erwachsenen und alten Menschen unterziehen Seneszenz in einem in - vitro - Kultur bestimmt. Schließlich zeigen wir die Fähigkeit , diese Myoblasten und die Fähigkeit , zu transfizieren ihre proliferative und Differenzierungsfähigkeit zu charakterisieren und ihre Eignung für die Durchführung vorzuschlagen funktionelle Studien der molekularen Mechanismen der Myogenese und Muskeln in vitro zu verschwenden. </p&gt;

MPL / primären Myoblasten sollte sichtbar 24 Stunden nach der Aussaat auf die Laminin beschichteten Oberfläche (Abbildung 2) sein. Die Zellen sollten eine spindelartige Form annehmen und sollte MyoD noch in Durchgang 4 (1A, B) exprimieren. Fibroblasten können durch ihre sternförmige Morphologie und fehlende Expression von MyoD (1B, C) zu unterscheiden. Sobald die Zellen am folgenden Tag angebracht werden, sollten Medien mit frischen bFGF Medien ersetzt werden. Die Kulturmedien sollte alle 48 Stunden ersetzt werden. Die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigten und veröffentlichten Daten aus unserem Labor 22 Ziel unserer Isolation und Kultur - Protokoll zu unterstützen und die verschiedenen Techniken zeigen , die für funktionelle Studien von menschlichen primären Myoblasten verwendet werden kann. Myoblasten Proliferation können mit Ki67-Immunfärbung und Lebensfähigkeit untersucht unter Verwendung von staining für die Zelllebensfähigkeitstest (Abbildung 3). Zur Unterscheidung soll die Kulturmedien zu Differenzierungsmedien verändert werden. Myotuben sollte in 5 bilden - 7 d und schwere Kette positiv sein Myosin (Abbildung 3). Beachten Sie, dass die Myotube Bildung möglicherweise weniger effizient , wenn Myoblasten aus dem Muskel von alten Menschen (Abbildung 3) isoliert sind. Seneszenz (SA-β-Galactosidase) Anfärbung kann auch ausgeführt werden , um den Prozentsatz von alternden Zellen in der Kultur (Figur 3) zu schaffen. Wir beobachteten , dass mit längeren Kulturen (Abbildung 3, Kanal 4), mehr Myoblasten aus dem Muskel von alten Menschen zeigen Seneszenz isoliert. Für funktionelle Untersuchungen Gen und mikroRNA - Expression kann unter Verwendung von lipophilen Transfektionsreagenzien-vermittelte Abgabe von Expressionsvektoren, siRNAs, MikroRNA nachahmt und antimiRs (Abbildung 4) manipuliert werden. Dies ermöglicht eine 40 -70% Transfektionseffizienz mit Gen / microRNA Ebenen sind nach oben oder nach unten reguliert innerhalb eines physiologischen Bereich (4; 22). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kulturgefäss </td><td> Ca. Area (pro Vertiefung) </td><td> Volumen von 10 &amp; mgr; g / mL Laminin </td></tr><tr><td> 35-mm-Schale </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 60-mm-Schale </td><td> 20 cm 2 </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> 100-mm-Schale </td><td> 60 cm 2 </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> 24-Well-Platte </td><td> 2 cm 2 </td><td> 200 &amp; mgr; l / Vertiefung </td></tr><tr><td> 12-Well-Platte </td><td> 4 cm 2 </td><td> 500 &amp; mgr; l / Vertiefung </td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> 10 cm 2 </td><td> 1 ml / Well </td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25 cm 2 </td><td> 3 mL </td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75 cm 2 </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Empfohlene Mindestmengen von Laminin-DPBS - Lösung (10 ug / ml) zur Beschichtung von Kulturfläche. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Die spezifische Aktivität / Molare Masse </td><td> Endkonzentration </td><td> Masse oder Volumen für 10 ml Lösung benötigt </td></tr><tr><td> Kollagenase D </td><td> 0,15 U / mg </td><td> 10 mg / ml (1,5 U / mL) </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> 0,5 U / mg </td><td> 4,8 mg / ml (2,4 U / mL) </td><td> 48 mg </td></tr><tr><td> 250 mM CaCl 2 </td><td> 110.98 G / mol </td><td> 2,5 mM </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Enzympräparat zum Muskel Verdauung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Zusammenfassung der Schritte des Protokolls zusammenfassend. Dissoziation des menschlichen Muskelbiopsie mit einer Schere oder mit einem chirurgischen Skalpell (I). Inkubation mit der Enzymlösung bei 37 ° C für 30 - 40 min (II). Ende der Verdau durch Zugabe von Wachstumsmedien und Filtern der Lösung durch einen 70 um - Membranfilter in ein Zentrifugenröhrchen (III). Zentrifugation bei 443 × g für 5 min (IV). Verwerfen des Überstandes und Resuspension in Wachstumsmedium , das 2,5 ng / mL FGF (V). Ausplattieren der Zellen auf einem Teller beschichtet mit 1081; g / mL Laminin und Ändern der Medien nach 24 h (VI). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> Abbildung 2. Myoblasten Isoliert von Muscle of Adult und im Alter von Menschen bei verschiedenen Passagen. A. Bilder darstellen isoliert Myoblasten aus extensor digitorum brevis, tibialis anterior oder Entführers Zehen Muskeln der weiblichen Patienten (Erwachsene: 30 ± 2,8 Jahre alt, im Alter von: 69 ± 5 Jahre alt, BMI &lt;25). Bei Passage 0 und nach 5 Tagen plattiert wird, werden die Zellen noch rund und klein, aber sichtbar unter dem hellen Lichtmikroskop (A). Myoblasten wird dann eine längliche Form annehmen, wie bei Passage 2 (A) gezeigt. MyoD ist in Myoblasten, aber nicht in Fibroblasten exprimiert<html> (B). Die Quantifizierung von MyoD-positiven Zellen gezeigt wird; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung; n = 3 (B). Repräsentative Bild , um die Unterschiede zwischen der Myoblasten und Fibroblasten - Morphologie zeigen (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> Abbildung 3. humanen primären Myoblasten kann verschiedene Färbungstechniken charakterisierenden. Lebensfähigkeit der Zellen kann unter Verwendung Anfärbung für die Zelllebensfähigkeitstests sichtbar gemacht werden, können die Proliferation unter Verwendung von Ki67-Immunfärbung beurteilt werden, Differenzierung beurteilt werden kann, kann MF20 (Myosin schwere Kette) Immunfärbung und Seneszenz Verwendung visualisiert werden Seneszenz assoziiert beta Galaktosidase (SA-β-Galactosidase unter Verwendung von ) Färbung.<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> Abbildung 4. menschliche primäre Myoblasten kann für funktionelle Studien von Muskel - Homöostase in vitro verwendet werden. A. MF20 (Myosin schwere Kette) Immunfärbung von differenzierten primären Myotuben von erwachsenen Menschen die Auswirkungen der Überexpression oder Hemmung der miR-378 auf Myotube Größe und Anzahl zeigt. B. qPCR zeigt relative Expression von miR-378 und IGF1 R, validiert miR-378 Zielgen nach miR-378 - Überexpression oder Hemmung in primären menschlichen Myoblasten. Expression relativ zu Rnu-6 und β-2-Mikroglobulin, jeweils, dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen SEM; n = 3, * - p &lt;0,05, Student T-Test.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste, reproduzierbare und einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von Myoblasten Vorläuferzellen aus dem Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen. Die Muskeln hier sind Fuß- und Beinmuskeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung einer angereicherten Population von primären Myoblasten für funktionelle Studien.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein robustes, reproduzierbares und einfaches Verfahren zur Isolierung primärer Myoblasten von erwachsenen und älteren Menschen bereitzustellen. Dieses Protokoll schlägt einen optimierten Arbeitsablauf für die Isolierung primärer humaner Myoblasten als In-vitro-Modell für funktionelle Untersuchungen von Prozessen vor, die mit der Muskelhomöostase während des Alterns assoziiert sind. Durch die Vermeidung von Belastungsfaktoren wie der Zentrifugation erhält dieses Protokoll das natürliche Zellverhalten aufrecht und ermöglicht die Isolierung sowie die Langzeitkultur primärer Myoblasten zur Erhaltung des Phänotyps.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine 60-Milliliter-Petri-Schale oder zwei Vertiefungen einer sechs-Vertiefungs-Platte vorbereiten. Anschließend pipettieren Sie eine minimale Menge an Laminin-Lösung, um die Oberfläche der Schale vollständig zu bedecken. Danach inkubieren Sie die Kulturschale mindestens 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen ansäen.Bereiten Sie anschließend die enzymatische Lösung in serumfreiem DMEM vor. Mischen Sie die enzymatische Lösung gründlich und filtrieren Sie sie zur Sterilisation durch eine 0,2-Mikrometer-Filtermembran. Nach der Probenentnahme bewahren Sie den Muskel bis zur Verdauung bei vier Grad Celsius in DPBS auf.Bereiten Sie mindestens zwei Milliliter enzymatische Lösung für 18 bis 20 Milligramm Muskelgewebe vor und erwärmen Sie diese vor der Gewebe-Dissociation auf 37 Grad Celsius. Tauchen Sie die Muskelbiopsie anschließend kurz in 70 Prozentigen Ethanol ein. Waschen Sie sie mit frischem DPBS und danach erneut mit 70 Prozentigem Ethanol, und legen Sie das Gewebe dann in eine neue Petrischale mit ausreichend enzymatischer Lösung, um die Probe vollständig zu bedecken.Entfernen Sie so viel fettiges und fibrotisches Gewebe wie möglich und zerreien Sie den Muskel vorsichtig in kleine, aber erkennbare Stücke. Danach überführen Sie die Probe in ein 50-Milliliter-Gefäß mit mindestens einem Milliliter enzymatischer Lösung. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius bis zu 30 oder 40 Minuten lang und bewegen Sie das Muskelgewebe, indem Sie das Gefäß alle fünf bis zehn Minuten vorsichtig schütteln.Als Nächstes beschichten Sie die Pipetten mit Medium, um eine Adhäsion der freigesetzten Zellen an der Plastikwand der Pipetten zu vermeiden. Geben Sie dann vier Milliliter steriles Wachstumsmedium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Freisetzung der Zellen aus den Muskel­fasern zu unterstützen.Filtern Sie anschließend die Muskelzelllösung durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Waschen Sie die verbleibenden Zellen mit zusätzlichem Medium und filtrieren Sie diese erneut durch den Sieb.Zentrifugieren Sie die Probe anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Nach fünf Minuten das Überstandsvolumen vorsichtig entfernen. Danach das Pellet in F12-Wachstumsmedium auflösen.In diesem Schritt nehmen Sie den zuvor mit Laminin beschichteten Kulturgefäßbehälter aus dem Inkubator. Entfernen Sie vorsichtig den Überschuss an Laminin aus der Kulturschale und vermeiden Sie es, die Oberfläche zu berühren. Anschließend spülen Sie die Kulturschale vorsichtig mit DPBS aus.Als Nächstes die Zellen direkt auf das mit Laminin beschichtete Gefäß geben und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag die Zellen im Hellfeldmikroskop sichtbar machen.Kleine runde Zellen heften sich an der Oberfläche an, und der verbleibende Zelltrümmer sollte im Kulturmedium sichtbar sein. Danach wechseln Sie das Medium auf frisches F12-Medium. Wechseln Sie in diesem Verfahren das Medium alle zwei bis drei Tage und passagieren Sie die Zellen, sobald Zellansammlungen unter dem Mikroskop sichtbar sind, um eine spontane Differenzierung zu vermeiden.Entfernen Sie für das Passagieren der Zellen das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie die geringste Menge an 0,25 Prozent EDTA-Trypsin hinzu, die benötigt wird, um die Zellenoberfläche zu bedecken. Schwenken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Zellen von der Ablösungslösung benetzt sind, und inkubieren Sie dann 10 Sekunden bei Raumtemperatur, bevor Sie sie entfernen.Anschließend die Zellen für drei bis fünf Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vorsichtig klopfen und unter dem hellen Mikroskop überprüfen, ob die Zellen aufgerundet, aber noch nicht vollständig von der Oberfläche gelöst sind. Danach fünf Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen, um die Zellen zu sammeln, gut vermischen und die Zellen mit dem neuen Medium in einen T75-Fläschchen überführen.Anschließend die verbleibenden Zellen mit weiteren 5 Milliliter Wachstumsmedium waschen. Um im ersten Passagierschritt vorzuinkubieren, die Zellen 40 Minuten bis eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach das Überstand-Medium, das die nicht angehefteten Zellen enthält, sammeln und in einem neuen T75-Fläschchen inkubieren.Dadurch sollte die Kultur und die Myoblasten angereichert werden, da sich die meisten Fibroblasten im ersten Kolben angeheftet haben sollten. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und teilen Sie die Zellen, sobald sie eine Konfluenz von 70 Prozent erreicht haben.Für die Differenzierung wechseln Sie das Kulturmedium, sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, auf Differenzierungsmedium. Die Zellen sollten sich innerhalb von fünf bis sieben Tagen differenzieren, abhängig von der Qualität und Reinheit der Myoblastenkultur. Im Durchgang null und nach fünf Tagen nach der Aussaat sind die Zellen noch rund und klein, aber unter hellem Lichtmikroskop sichtbar. Die Myoblasten nehmen dann eine längliche Form wie im Passagierungsprozess an. Wie hier gezeigt, wird MyoD in Myoblasten exprimiert, nicht jedoch in Fibroblasten. Menschliche primäre Myoblasten können mittels Färbung auf Zellviabilität, Ki67-Immunfärbung zur Bestimmung der Proliferation, MF20-Immunfärbung zur Bestimmung der Differenzierung und seneszenzassoziiierter Betagalactosidase-Färbung für Seneszenz-Assays charakterisiert werden.Primäre Myoblasten können für Funktionsassays verwendet werden. In dieser Abbildung zeigen die MF20-Immunfärbungen differenzierter primärer Myotubuli von erwachsenen Menschen die Auswirkungen einer Überexpression oder Hemmung von miR-378 auf Größe und Anzahl der Myotubuli. QPCR-Analysen zeigen, dass die Transfektionen mit dem miR-378-Mimetikum und dem Anti-miR erfolgreich waren und zu Veränderungen in der relativen Expression von miR-378 und LGF1R, einem validierten Zielgen von miR-378, nach Überexpression oder Hemmung von miR-378 in humanen primären Myoblasten führten.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Dieses robuste und reproduzierbare Protokoll ist besonders nützlich, wenn andere, anspruchsvollere und teurere Methoden wie die Zellsortierung nicht möglich oder praktikabel sind. Diese vereinfachte Technik ist für Forscher auf dem Gebiet der Muskelforschung nützlich, um das Phänomen der Alterung in humanen in-vitro-Modellsystemen zu untersuchen.Zusammenfassend ermöglicht diese vorgeschlagene Methode die Isolierung myogener Vorläuferzellen aus dem Muskelgewebe nicht nur erwachsener, sondern auch älterer Menschen für funktionelle Untersuchungen in vitro, die ebenfalls auf Tiermodelle angewendet werden können.

preparation-culture-myogenic-precursor-cellsprimary-myoblasts-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Engineered Muskelgewebe hat ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, als Krankheit Modell und auch als alternative Quelle für Fleisch. Hier beschreiben wir die Konstruktion von einem Muskel-Konstrukt, in diesem Fall von der Maus Myoblasten Vorläuferzellen, und die Stimulation durch elektrische Impulse.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die...

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden.  hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Lernen Sie die Isolierung und Kultur primärer Myoblasten aus Skelettmuskel adulter und alter Menschen. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen zur Untersuchung von Muskelhomöostase und Alterung.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

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