der Anbau von Caenorhabditis elegans In drei Dimensionen im Labor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales Kultivierungssystem für Nematoden herzustellen, das die natürlichen Bedingungen besser simulieren kann. Diese Methode kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklung, Physiologie und des Verhaltens von C elegans beantworten. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir das natürliche Verhalten von Nematoden in verrottenden Früchten untersuchten, bei denen es sich um eine 3D-Umgebung handelt.

Diese Technik ist im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Kultivierungstechniken von Vorteil, da Nematoden in 3D-Lebensräumen in der Natur leben. Obwohl diese Methode für die C-elegans-Kultivierung entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Nematoden angewendet werden. Dieses Verfahren wird von Tong Young Lee, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert.

Um diesen Vorgang zu beginnen, stellt Otto die vorbereiteten Lösungen 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius in Clavien. Bereiten Sie anschließend 50 Milliliter der sterilen Cholesterinlösung mit 5 Milligramm pro Milliliter vor. In ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen 0,25 Gramm Cholesterin und 50 Milliliter 99,99 % Ethanol geben und gut mischen.

Als nächstes sterilisieren Sie die Cholesterinlösung mit einer 50-Milliliter-Spritze mit einem 0,45-Milliliter-Spritzenfilter und entfernen Sie ungebildetes Cholesterin. Dann impfen Sie 10 Milliliter Lysogenbrühe mit Bakterien. Kulturieren Sie die bakterielle Inokulation bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelbrutkasten über Nacht.

Zur Vorbereitung einer seriellen Verdünnung werden neun Milliliter der Natriumchloridlösung in sieben sterile konische 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Um ein Zelt aus der siebenfachen Verdünnung von Opi 50 Stamm E Coli herzustellen. Geben Sie anschließend einen Milliliter der Bakterienkultur oder der verdünnten Bakterienkultur in ein neues Röhrchen mit neun Millilitern Natriumchloridlösung.

Und die Mischung gut verwirbeln. Nach der Vorbereitung der Bakterienkultur 0,6 Gramm Natriumchlorid, ein Gramm granulierte Schnecke und 0,5 Gramm Pepton in einen 500-Milliliter-Kolben geben. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben.

Füge dann 195 Milliliter destilliertes Wasser hinzu und decke den Kolben mit Alufolie ab. Anschließend führt Otto die Probe 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius durch. Anschließend den heißen Otto-Claved-Kolben in eine Rührplatte geben, mindestens zwei Stunden lang bei mäßiger Geschwindigkeit rühren, bis er 40 Grad Celsius erreicht.

Alternativ kann der Kolben auf 40 Grad Celsius abgekühlt werden, indem er 15 Minuten lang in ein 40 Grad Celsius warmes Wasserbad gelegt wird, bevor er auf eine Rührplatte umgefüllt wird. Achten Sie darauf, ausreichend abzukühlen, da es von hier aus weitergeht. Eine hohe Temperatur kann zu einer Trübung der fertigen Schnecke führen, aber eine zu niedrige Temperatur kann zu einer vorzeitigen Aushärtung der Schnecke führen.

Wenn die Temperatur des Schneckenmediums 40 Grad Celsius erreicht, fügen Sie Calciumchlorid, Cholesterinlösung, Magnesiumsulfat und Kaliumphosphatpuffer hinzu und rühren Sie die Lösung weiter. Für den NGT-3D-Lebensdauer-Assay fügen Sie dem Medium 80 Mikroliter 150 Millimeter FUDR hinzu, um eine Endkonzentration von 120 Mikromolar zu erhalten. Nehmen Sie dann sechs Milliliter Schneckenmedium in ein steriles konisches Röhrchen und halten Sie es in einem Inkubator warm.

Dieses Medium wird für die bakterienfreie Deckschicht verwendet. Anschließend werden sechs Milliliter der verdünnten Bakterienkultur direkt auf einer sterilisierten Bank in den Kolben gegeben. Gießen Sie für NGT-3D 6,5 Milliliter Medium in die acht Milliliter durchsichtigen Kunststoffreagenzgläser, um eine Bakterienschneckenschicht zu bilden.

Und geben Sie vorsichtig 200 Mikroliter des bakterienfreien Mediums auf das halbharte 3D-Medium, um eine dünne, bakterienfreie Schicht darüber zu bilden. Schließen Sie dann den Deckel der Kammer fest. Gießen Sie für NGB-3D 65 Milliliter Medium in eine 25 Quadratzentimeter große, durchsichtige Zellkulturflasche aus Kunststoff.

Positionieren Sie die Kammer dann eine Woche lang vertikal bei Raumtemperatur, damit die Bakterienkolonien zu einer beachtlichen Größe von mindestens einem Millimeter Durchmesser heranwachsen können. Bei diesem Verfahren wird ein vierstufiger L-Wurm entnommen und auf eine bakterienfreie NGM-Platte umgefüllt. Lassen Sie den Wurm dann einige Minuten lang frei herumlaufen, um Bakterien aus seinem Körper zu entfernen.

Und wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male. Platzieren Sie anschließend die saubere Schnecke vorsichtig auf der Oberfläche des 3D-Mediums. Der Wurm hätte eigentlich die Schnecke in die 3D-Schneckenmatrix eingeben sollen.

Schließen Sie dann den Deckel locker und inkubieren Sie 96 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Nach vier Tagen schließen Sie den Deckel fest und stellen die NGT-3D-Kulturkammer in ein Wasserbad bei 88 Grad Celsius, um die Schnecke zu schmelzen. Übertragen Sie das geschmolzene Medium mit einer Glaspipette auf eine neun Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff.

Zählen Sie anschließend mit einem Transmissionsstereo-Präpariermikroskop die Anzahl der Würmer im L3-, L4- und Erwachsenenstadium. Wie hier gezeigt, handelt es sich bei der Konstruktion von NGT-3D um ein einfaches und unkompliziertes Protokoll, das zu einem mit Schnecke gefüllten Reagenzglas mit kleinen Bakterienkolonien führt, die über die Schnecke verteilt sind. Um zu bestätigen, ob sich C elegans in NGT-3D reduzieren und normal wachsen kann, werden Fertilität und Larvenentwicklung in 3D mit den Standard-2D-NGM-Platten verglichen.

Im Relative Brutgrößen-Assay vermehrten sich adulte C elegans-Hermaphroditen in NGT-3D genauso gut wie Hermaphroditen in den Standard-2D-MGM-Platten, wenn Bakterienkolonien mit mindestens 60 Kolonien reichlich vorhanden sind. Darüber hinaus verläuft die Larvenentwicklung in NGT-3D auch normal, wenn es viele Bakterienkolonien gibt, wobei die Mehrheit der Würmer nach 96 Stunden im erwachsenen Zustand ist. Sind Bakterienkolonien in der 3D-Matrix jedoch spärlich, wirkt sich dies sowohl auf die relative Brutgröße als auch auf die Larvenentwicklung negativ aus.

Hier ist eine Überlebenskurve des Wildtyps C elegans in NGT-3D- oder NGM-Platten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Lebensdauer-Assays und Verhaltensanalysen durchgeführt werden, um Fragen zum Altern und Verhalten in 3D zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Genetik den Weg ebnen, Fragen zur Ökologie und Evolution in der Welt zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nematoden in einer 3D-Laborumgebung kultiviert.