Name: Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Analyse von zellfreier DNA-Integrität in Urinproben zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs. Diese Methode ermöglicht eine einfache und zuverlässige Diagnose urologischer Malignome.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Gráinne Tierney und Silvia Bellissimo für ihre redaktionelle Unterstützung.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des IRST Human Research Ethics Committee. HINWEIS: In diesem Protokoll isolierten wir DNA aus Urinproben eine Integritätsanalyse UCF DNA durchzuführen. LNCaP und MRC-Zelllinien wurden verwendet Standards zu konstruieren. Techniken wie DNA - Extraktion, DNA - Quantifizierung (Spektralphotometer und real-time PCR für das Kontroll - Gen, STOX1) und Echtzeit - PCR für spezifische Onkogene wurden durchgeführt (Abbildung 1). 1. Urin Erhebung und Verarbeitung <ol><li> Besorgen Sie sich eine saubere Beifang ersten Morgenurinprobe in einem sauberen, trockenen, Plastikbecher. Sammeln mindestens 50 ml der Urinprobe. </li><li> Aufrechterhaltung des Urins bei 4 ° C für maximal 3 Stunden und an das Labor bei der gleichen Temperatur zu senden. </li><li> Mischen Sie jede Probe zweimal unmittelbar nach der Ankunft im Labor und den Transfer in zwei 50-ml konischen Boden Polypropylen-Röhrchen zu invertieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchenbei 850 xg für 10 min bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig 10 mL übertragen des oberen Teils des Urins Überstand in zwei 5-ml-Röhrchen, mit mindestens 2 ml des Überstandes über dem Zellpellet zu verlassen. HINWEIS: Übertragen des oberen Teils des Überstands verringert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zelltrümmer. Es gibt keine klare Abgrenzung zwischen den oberen und unteren Teil. </li><li> Entsorgen Sie das Pellet und gefrieren sofort den Überstand bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. DNA-Isolierung aus dem Urin Überstand und Zelllinien HINWEIS: Trennen Sie die DNA aus einer Zelllinie (zB LNCap für Prostatakrebs oder MRC für Blasenkrebs) unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers. Isolierung von DNA aus dem Urin Überstand sollte mit dem kommerziellen Protokoll durchgeführt werden, wie folgt geändert: <ol><li> Auftauen ein Aliquot des Urins Überstand bei Raumtemperatur. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex und mischen Sie die Urinprobe und 1 ml des Urins Überstand in eine klare 5-ml-Röhrchen. Frieren Sie den Restharn bei -80 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Proteinase K direkt auf die Probe. </li><li> 1 ml AL-Puffer auf die Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. </li><li> Schließen die Röhrchen und Inkubation der Proben bei 56 ° C für 15 min. </li><li> Während der Inkubation vorbereiten eine Spalte für jede Probe und bereiten die Waschpuffer, AW1 und AW2, gemäß den Anweisungen des Herstellers (fügen Sie die angegebene Menge von 100% Ethanol). </li><li> Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und 1 mL absolutem Ethanol. Mischen Sie vollständig durch Pipettieren. </li><li> Hinzufügen 650 &amp; mgr; l der Mischung in Schritt erhaltenen 2,7 auf die Säule und Zentrifugieren es bei 6.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses und legen Sie die Spalte auf eine neue, saubere Sammelröhrchen enthält. Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.9 bis sich das gesamte Probenmischung verwendet wurde (5-mal). </li><li> In 500 &amp;# 181; l Puffer AW1 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifugieren es bei 6000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Hinzufügen 500 ul Puffer AW2 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g) für 3 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.12 restliche Waschpuffer zu entfernen. </li><li> Die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer AE und warten 7 min, um sicherzustellen, dass der Puffer benetzt die Säule. </li><li> Zentrifugieren es bei 8000 × g für 1 min. </li><li> Pipettieren Eluent aus Schritt 2.15 in die Mini-Säule zentrifugieren und es bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute die maximale Rückgewinnung von DNA zu gewährleisten. </li></ol> 3. DNA-Quantifizierung und Verdünnung <ol><li> Mit einem Spektralphotometer, führen Sie die Quantifizierung von DNA aus Both die Zelllinie und die Urinproben Überstand. Verwenden Sie 2 ul der Probe auf einem Benchtop-Spektrometer, gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünne die Proben UCF DNA mit einer Konzentration von 1 ng / &amp; mgr; l zu erhalten und speichern die DNA bei -20 ° C, bis die DNA Integritätsanalyse. HINWEIS: Wenn die DNA-Menge nicht ausreicht, um mit Echtzeit-PCR (mindestens 100 ng), um fortzufahren, führen Sie eine neue DNA-Isolierungsverfahren. </li><li> Verdünne die DNA aus der Zelllinie Proben zu erhalten sechs Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 und 2 ng / &amp; mgr; l, jeweils mit einem Volumen von 100 ul (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 und ST6). Bewahren Sie die Zelllinie DNA-Standards bei -20 ° C, bis die DNA-Integritätsanalyse. </li></ol> 4. DNA-Integritätstest - PCR <ol><li> Auftauen die Primer (die Konzentration ist abhängig von der Art des Assays), Grün supermix, Zelllinie DNA-Standards und UCF DNA verdünnten Proben auf Eis. </li><li> Bereiten Streifen Rohre in der Platte foder der 72-Well-Rotorscheibe. Aliquot 10 ul in zweifacher Ausfertigung für jeden Standard und verdünnte Probe und 10 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser für die negative Kontrolle. </li><li> Bereiten einer Mischung aus 1 &amp; mgr; l jedes Primers (die Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben), 12,5 &amp; mgr; l des grünen supermix und 6,5 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser für jede Probe. Wenn die Mischung vorbereitet, verwenden Sie die folgende Anzahl der Proben: 6-Normen für 2 Wiederholungen, Anzahl der Proben für 2 Wiederholungen, negative Kontrolle für 2 Wiederholungen und 2 zusätzliche Proben. </li><li> Aliquot 15 ul der Mischung in jede Vertiefung. Sie nicht die Rohre Pipette oder drehen. </li><li> Starten Sie das Protokoll mit den Bedingungen PCR in Tabelle 1 angegeben. HINWEIS: Für die UCF-DNA-Wert, 29 DNA-Proben für jede Echtzeit-Experiment verarbeitet wurden unter Verwendung des 72-Well-Rotorscheibe: 29 x 2 Proben + 6 x 2 Standards + negative Kontrolle x 2 = 72 (UCF DNA-Wert). HINWEIS: Das Protokoll für die Integritätsanalyse UCF DNA kann auchdurchgeführt andere Echtzeit-PCR Instrument (wenn ein anderes Gerät verwenden, können hinzugefügt werden müssen, ROX-Farbstoff). </li></ol> 5. DNA-Integritätstest - Datenanalyse und Interpretation HINWEIS: Die DNA UCF - Wert für jede Probe wurde durch eine Echtzeit - Gerät-Erfassungssystem - Software unter Verwendung einer Standardkurve Konstruktion für jede einzelne PCR - Gen Auswerte- und unter Verwendung von Standardkurve Interpolation erhalten, wie zuvor beschrieben , 7-9 (Abbildung 2). <ol><li> Bewerten Sie die Replikate; Probe repliziert mit einem Unterschied ≥1 Ct verworfen werden müssen, und in einem zweiten Versuch erneut ausgewertet. </li><li> Berechnen Sie die mittlere Ct für jede Probe und prüfen Proben mit einem Ct-Wert ≤ 36. </li><li> Bewerten Sie die Spezifität der PCR-Produkte Schmelzanalyse. </li><li> Bewerten Sie die Konzentration jedes Amplikon durch Interpolation mit der Standardkurve; einen Konzentrationswert (ng / ul) für jedes Amplifikat erhalten.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

UCF DNA Integritätsanalyse ist eine neue, nicht-invasive Methode zur Beurteilung DNA Integrität im Urin. Es wurde für die Frühdiagnose von Blasen 9 und Prostatakrebs 7,8 kürzlich vorgeschlagen. Eine Reihe von Vor- und Nachteilen der UCF DNA-Integritätstest werden hier diskutiert, zusammen mit Zukunftsperspektiven. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, daß es eine kostengünstige, nicht-invasive Methode bietet und ein einfaches Protokoll Urin als potentielle Quelle von Bi...

Zellfreie DNA kann in Blut und Urin aufgrund von Zelltod durch apoptotische oder nekrotische Mechanismen nachgewiesen werden. Zellfreie DNA in Blut wurde für diagnostische und prognostische Zwecke in verschiedenen Krankheiten intensiv untersucht, insbesondere Krebs 1. Jedoch weniger ist über die Rolle der Harn- zellfreien (UCF) DNA bekannt. UCF DNA kann aus dem Blut , das durch die glomeruläre Filtrationssystems oder aus Zellen stammen , die mit diesem Körperflüssigkeit 2 (beispielsweise Urothelzellen oder Prostatazellen) direkt in Kontakt kommen. Die Verwendung von UCF DNA als Quelle von Biomarkern ist für die Frühdiagnose von Nieren-, Blasen- und Prostatakrebs durch den hohen Anteil der UCF DNA , das direkt von der Harnwege Zellen untersucht 3,4 hauptsächlich worden. Wenig ist bekannt über UCF-DNA und die besten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von ihm. Angesichts der Hypothese, dass die Tumorzellen freizusetzen längere DNA-Fragmente als normale Zellen, die Auswertungsder zellfreien DNA - Integrität wurde in einem Versuch untersucht, 5 den Ursprung der DNA in den Blutkreislauf zu erläutern. Einige Studien haben gezeigt , daß zellfreie DNA Integrität im Blut einen guten diagnostischen Test für viele Krebsarten darstellt 6, und die gleiche Hypothese in bezug auf Urin 7-9 vorgeschlagen. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren zur UCF DNA Integritätsanalyse mit einer potentiellen Anwendung auf Blasen- und Prostatakrebserkennung. Insbesondere wurde die Integrität der UCF DNA - Fragmente mehr als 250 bp in 4 Regionen getestet bekannt , eine erhöhte DNA - Kopienzahl in soliden Tumoren, einschließlich Prostata- und Blasenkrebs: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) und AR (Xq12) 14.10. Spezifische Onkogene, anstatt Zufallssequenzen wurden gewählt, um die Wahrscheinlichkeit, sie in der zellfreie Fraktion von Krebspatienten zu erhöhen. Einer der wichtigsten Vorteile derdieses Verfahren ist, dass es flexibel ist und dass andere Bereiche können auch auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften gewählt werden.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Grün Supermix, 100 x 50 & Mikro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT benutzerdefinierte DNA-Oligos&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>HPLC-Aufreinigung, 100 nMol DNA-Oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Andere spektrophotometrische Methoden könnten ebenfalls zur Quantifizierung von DNA verwendet werden</td></tr><tr><td>Rotor-Gen 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Ein weiteres Real-Time-PCR-Gerät könnte ebenfalls verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eine Zentrifuge für 50-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&Grad; C Gefrierschrank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; L Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Entnahmeröhrchen (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Puffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

zellfreie dna-integritätsanalyse in urinproben

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Obwohl die Anwesenheit zellfreie DNA in Plasma oder Serum von Zirkulieren einer geeigneten Quelle von Biomarkern für viele Krebsarten haben nur wenige Studien konzentrierten sich auf die mögliche Verwendung von zellfreien Urin (UCF) DNA weithin erwiesen hat. Ausgehend von den Hypothesen, die normale apoptotische Zellen produzieren stark fragmentierten DNA und dass Krebszellen schütten mehr DNA, die mögliche Rolle der UCF DNA-Integrität wurde als eine frühe Diagnosemarker ausgewertet Lage, die Unterscheidung zwischen Patienten mit Prostata- oder Blasenkrebs und gesunden Personen. C-MYC, BCAS1, HER2 und AR: A UCF DNA Integritätsanalyse wird auf der Grundlage von vier quantitative Echtzeit - PCR - Reaktionen von vier Sequenzen , die länger als 250 bp vorgeschlagen. Sequenzen, die häufig eine erhöhte DNA-Kopienzahl in der Blase und Prostata-Krebsarten wurden für die Analyse ausgewählt, aber das Verfahren ist flexibel, und diese Gene können mit anderen Genen von inte substituiert seinsich ausruhen. Die potentielle Nützlichkeit von UCF DNA als Quelle von Biomarkern bereits für urologische Malignitäten nachgewiesen und damit den Weg geebnet für weitere Untersuchungen auf UCF DNA Charakterisierung. Die UCF DNA-Integritätstest hat den Vorteil, dass sie nicht-invasive, schnelle und einfach durchzuführen, mit nur wenigen Milliliter Urin benötigt, um die Analyse durchzuführen.

Die gesamte freie DNA-Konzentration war quantifizierbare spektrophotometrisch für alle Proben analysiert, wobei eine Reihe von zwischen 1,51 und 138 ng / &amp; mgr; l zeigt. Fünf Kontrollproben wurden für die Reproduzierbarkeit der Daten verwendet: zwei unabhängige Echtzeit - Experimente durchgeführt wurden , für c-MYC, HER2, BCAS1, AR, und STOX1. Die Variationskoeffizienten (CV) wurden dann für jedes Gen (Tabelle 2) berechnet...

Es wird eine Methode zur Analyse der DNA-Integrität in der zellfreien Überstandsfraktion von Urinproben vorgeschlagen. Die Methode eignet sich zur Früherkennung urologischer Malignome und hat sich für die Früherkennung von Blasenkrebs als genau erwiesen.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Integrität der zellfreien DNA im Urin an spezifischen Onkogensequenzen zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des urologischen Krebses zu beantworten, wie z.B. die frühzeitige nicht-invasive Diagnose von Blasen- und Prostatakrebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen und zu analysieren ist.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose urologischer Malignome, da sie normalerweise Zellen und freie Nukleinsäuren im Urin freisetzen. Obwohl diese Methode Einblicke in Harnproben geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Serum oder Plasma angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Konzentration an zellfreier DNA im Urin oft niedrig ist.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, eine einfache Methode zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs zu finden. Um das Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie eine 50-Milliliter-Urinprobe für den ersten Morgen, die nicht länger als drei Stunden bei vier Grad Celsius gelagert wurde. Drehen Sie

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.

Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

Lernen Sie die Analyse von zellfreier DNA-Integrität in Urinproben zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs. Diese Methode ermöglicht eine einfache und zuverlässige Diagnose urologischer Malignome.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Weitere Videos entdecken