Name: Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Analyse von zellfreier DNA-Integrität in Urinproben zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs. Diese Methode ermöglicht eine einfache und zuverlässige Diagnose urologischer Malignome.

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Die Autoren danken Gráinne Tierney und Silvia Bellissimo für ihre redaktionelle Unterstützung.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des IRST Human Research Ethics Committee. HINWEIS: In diesem Protokoll isolierten wir DNA aus Urinproben eine Integritätsanalyse UCF DNA durchzuführen. LNCaP und MRC-Zelllinien wurden verwendet Standards zu konstruieren. Techniken wie DNA - Extraktion, DNA - Quantifizierung (Spektralphotometer und real-time PCR für das Kontroll - Gen, STOX1) und Echtzeit - PCR für spezifische Onkogene wurden durchgeführt (Abbildung 1). 1. Urin Erhebung und Verarbeitung <ol><li> Besorgen Sie sich eine saubere Beifang ersten Morgenurinprobe in einem sauberen, trockenen, Plastikbecher. Sammeln mindestens 50 ml der Urinprobe. </li><li> Aufrechterhaltung des Urins bei 4 ° C für maximal 3 Stunden und an das Labor bei der gleichen Temperatur zu senden. </li><li> Mischen Sie jede Probe zweimal unmittelbar nach der Ankunft im Labor und den Transfer in zwei 50-ml konischen Boden Polypropylen-Röhrchen zu invertieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchenbei 850 xg für 10 min bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig 10 mL übertragen des oberen Teils des Urins Überstand in zwei 5-ml-Röhrchen, mit mindestens 2 ml des Überstandes über dem Zellpellet zu verlassen. HINWEIS: Übertragen des oberen Teils des Überstands verringert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zelltrümmer. Es gibt keine klare Abgrenzung zwischen den oberen und unteren Teil. </li><li> Entsorgen Sie das Pellet und gefrieren sofort den Überstand bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. DNA-Isolierung aus dem Urin Überstand und Zelllinien HINWEIS: Trennen Sie die DNA aus einer Zelllinie (zB LNCap für Prostatakrebs oder MRC für Blasenkrebs) unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers. Isolierung von DNA aus dem Urin Überstand sollte mit dem kommerziellen Protokoll durchgeführt werden, wie folgt geändert: <ol><li> Auftauen ein Aliquot des Urins Überstand bei Raumtemperatur. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex und mischen Sie die Urinprobe und 1 ml des Urins Überstand in eine klare 5-ml-Röhrchen. Frieren Sie den Restharn bei -80 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Proteinase K direkt auf die Probe. </li><li> 1 ml AL-Puffer auf die Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. </li><li> Schließen die Röhrchen und Inkubation der Proben bei 56 ° C für 15 min. </li><li> Während der Inkubation vorbereiten eine Spalte für jede Probe und bereiten die Waschpuffer, AW1 und AW2, gemäß den Anweisungen des Herstellers (fügen Sie die angegebene Menge von 100% Ethanol). </li><li> Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und 1 mL absolutem Ethanol. Mischen Sie vollständig durch Pipettieren. </li><li> Hinzufügen 650 &amp; mgr; l der Mischung in Schritt erhaltenen 2,7 auf die Säule und Zentrifugieren es bei 6.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses und legen Sie die Spalte auf eine neue, saubere Sammelröhrchen enthält. Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.9 bis sich das gesamte Probenmischung verwendet wurde (5-mal). </li><li> In 500 &amp;# 181; l Puffer AW1 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifugieren es bei 6000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Hinzufügen 500 ul Puffer AW2 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g) für 3 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.12 restliche Waschpuffer zu entfernen. </li><li> Die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer AE und warten 7 min, um sicherzustellen, dass der Puffer benetzt die Säule. </li><li> Zentrifugieren es bei 8000 × g für 1 min. </li><li> Pipettieren Eluent aus Schritt 2.15 in die Mini-Säule zentrifugieren und es bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute die maximale Rückgewinnung von DNA zu gewährleisten. </li></ol> 3. DNA-Quantifizierung und Verdünnung <ol><li> Mit einem Spektralphotometer, führen Sie die Quantifizierung von DNA aus Both die Zelllinie und die Urinproben Überstand. Verwenden Sie 2 ul der Probe auf einem Benchtop-Spektrometer, gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünne die Proben UCF DNA mit einer Konzentration von 1 ng / &amp; mgr; l zu erhalten und speichern die DNA bei -20 ° C, bis die DNA Integritätsanalyse. HINWEIS: Wenn die DNA-Menge nicht ausreicht, um mit Echtzeit-PCR (mindestens 100 ng), um fortzufahren, führen Sie eine neue DNA-Isolierungsverfahren. </li><li> Verdünne die DNA aus der Zelllinie Proben zu erhalten sechs Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 und 2 ng / &amp; mgr; l, jeweils mit einem Volumen von 100 ul (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 und ST6). Bewahren Sie die Zelllinie DNA-Standards bei -20 ° C, bis die DNA-Integritätsanalyse. </li></ol> 4. DNA-Integritätstest - PCR <ol><li> Auftauen die Primer (die Konzentration ist abhängig von der Art des Assays), Grün supermix, Zelllinie DNA-Standards und UCF DNA verdünnten Proben auf Eis. </li><li> Bereiten Streifen Rohre in der Platte foder der 72-Well-Rotorscheibe. Aliquot 10 ul in zweifacher Ausfertigung für jeden Standard und verdünnte Probe und 10 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser für die negative Kontrolle. </li><li> Bereiten einer Mischung aus 1 &amp; mgr; l jedes Primers (die Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben), 12,5 &amp; mgr; l des grünen supermix und 6,5 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser für jede Probe. Wenn die Mischung vorbereitet, verwenden Sie die folgende Anzahl der Proben: 6-Normen für 2 Wiederholungen, Anzahl der Proben für 2 Wiederholungen, negative Kontrolle für 2 Wiederholungen und 2 zusätzliche Proben. </li><li> Aliquot 15 ul der Mischung in jede Vertiefung. Sie nicht die Rohre Pipette oder drehen. </li><li> Starten Sie das Protokoll mit den Bedingungen PCR in Tabelle 1 angegeben. HINWEIS: Für die UCF-DNA-Wert, 29 DNA-Proben für jede Echtzeit-Experiment verarbeitet wurden unter Verwendung des 72-Well-Rotorscheibe: 29 x 2 Proben + 6 x 2 Standards + negative Kontrolle x 2 = 72 (UCF DNA-Wert). HINWEIS: Das Protokoll für die Integritätsanalyse UCF DNA kann auchdurchgeführt andere Echtzeit-PCR Instrument (wenn ein anderes Gerät verwenden, können hinzugefügt werden müssen, ROX-Farbstoff). </li></ol> 5. DNA-Integritätstest - Datenanalyse und Interpretation HINWEIS: Die DNA UCF - Wert für jede Probe wurde durch eine Echtzeit - Gerät-Erfassungssystem - Software unter Verwendung einer Standardkurve Konstruktion für jede einzelne PCR - Gen Auswerte- und unter Verwendung von Standardkurve Interpolation erhalten, wie zuvor beschrieben , 7-9 (Abbildung 2). <ol><li> Bewerten Sie die Replikate; Probe repliziert mit einem Unterschied ≥1 Ct verworfen werden müssen, und in einem zweiten Versuch erneut ausgewertet. </li><li> Berechnen Sie die mittlere Ct für jede Probe und prüfen Proben mit einem Ct-Wert ≤ 36. </li><li> Bewerten Sie die Spezifität der PCR-Produkte Schmelzanalyse. </li><li> Bewerten Sie die Konzentration jedes Amplikon durch Interpolation mit der Standardkurve; einen Konzentrationswert (ng / ul) für jedes Amplifikat erhalten.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
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<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

UCF DNA Integritätsanalyse ist eine neue, nicht-invasive Methode zur Beurteilung DNA Integrität im Urin. Es wurde für die Frühdiagnose von Blasen 9 und Prostatakrebs 7,8 kürzlich vorgeschlagen. Eine Reihe von Vor- und Nachteilen der UCF DNA-Integritätstest werden hier diskutiert, zusammen mit Zukunftsperspektiven. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, daß es eine kostengünstige, nicht-invasive Methode bietet und ein einfaches Protokoll Urin als potentielle Quelle von Bi...

Zellfreie DNA kann in Blut und Urin aufgrund von Zelltod durch apoptotische oder nekrotische Mechanismen nachgewiesen werden. Zellfreie DNA in Blut wurde für diagnostische und prognostische Zwecke in verschiedenen Krankheiten intensiv untersucht, insbesondere Krebs 1. Jedoch weniger ist über die Rolle der Harn- zellfreien (UCF) DNA bekannt. UCF DNA kann aus dem Blut , das durch die glomeruläre Filtrationssystems oder aus Zellen stammen , die mit diesem Körperflüssigkeit 2 (beispielsweise Urothelzellen oder Prostatazellen) direkt in Kontakt kommen. Die Verwendung von UCF DNA als Quelle von Biomarkern ist für die Frühdiagnose von Nieren-, Blasen- und Prostatakrebs durch den hohen Anteil der UCF DNA , das direkt von der Harnwege Zellen untersucht 3,4 hauptsächlich worden. Wenig ist bekannt über UCF-DNA und die besten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von ihm. Angesichts der Hypothese, dass die Tumorzellen freizusetzen längere DNA-Fragmente als normale Zellen, die Auswertungsder zellfreien DNA - Integrität wurde in einem Versuch untersucht, 5 den Ursprung der DNA in den Blutkreislauf zu erläutern. Einige Studien haben gezeigt , daß zellfreie DNA Integrität im Blut einen guten diagnostischen Test für viele Krebsarten darstellt 6, und die gleiche Hypothese in bezug auf Urin 7-9 vorgeschlagen. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren zur UCF DNA Integritätsanalyse mit einer potentiellen Anwendung auf Blasen- und Prostatakrebserkennung. Insbesondere wurde die Integrität der UCF DNA - Fragmente mehr als 250 bp in 4 Regionen getestet bekannt , eine erhöhte DNA - Kopienzahl in soliden Tumoren, einschließlich Prostata- und Blasenkrebs: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) und AR (Xq12) 14.10. Spezifische Onkogene, anstatt Zufallssequenzen wurden gewählt, um die Wahrscheinlichkeit, sie in der zellfreie Fraktion von Krebspatienten zu erhöhen. Einer der wichtigsten Vorteile derdieses Verfahren ist, dass es flexibel ist und dass andere Bereiche können auch auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften gewählt werden.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Grün Supermix, 100 x 50 & Mikro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT benutzerdefinierte DNA-Oligos&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>HPLC-Aufreinigung, 100 nMol DNA-Oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Andere spektrophotometrische Methoden könnten ebenfalls zur Quantifizierung von DNA verwendet werden</td></tr><tr><td>Rotor-Gen 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Ein weiteres Real-Time-PCR-Gerät könnte ebenfalls verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eine Zentrifuge für 50-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&Grad; C Gefrierschrank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956; L Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; L Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Entnahmeröhrchen (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Puffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

zellfreie dna-integritätsanalyse in urinproben

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Obwohl die Anwesenheit zellfreie DNA in Plasma oder Serum von Zirkulieren einer geeigneten Quelle von Biomarkern für viele Krebsarten haben nur wenige Studien konzentrierten sich auf die mögliche Verwendung von zellfreien Urin (UCF) DNA weithin erwiesen hat. Ausgehend von den Hypothesen, die normale apoptotische Zellen produzieren stark fragmentierten DNA und dass Krebszellen schütten mehr DNA, die mögliche Rolle der UCF DNA-Integrität wurde als eine frühe Diagnosemarker ausgewertet Lage, die Unterscheidung zwischen Patienten mit Prostata- oder Blasenkrebs und gesunden Personen. C-MYC, BCAS1, HER2 und AR: A UCF DNA Integritätsanalyse wird auf der Grundlage von vier quantitative Echtzeit - PCR - Reaktionen von vier Sequenzen , die länger als 250 bp vorgeschlagen. Sequenzen, die häufig eine erhöhte DNA-Kopienzahl in der Blase und Prostata-Krebsarten wurden für die Analyse ausgewählt, aber das Verfahren ist flexibel, und diese Gene können mit anderen Genen von inte substituiert seinsich ausruhen. Die potentielle Nützlichkeit von UCF DNA als Quelle von Biomarkern bereits für urologische Malignitäten nachgewiesen und damit den Weg geebnet für weitere Untersuchungen auf UCF DNA Charakterisierung. Die UCF DNA-Integritätstest hat den Vorteil, dass sie nicht-invasive, schnelle und einfach durchzuführen, mit nur wenigen Milliliter Urin benötigt, um die Analyse durchzuführen.

Die gesamte freie DNA-Konzentration war quantifizierbare spektrophotometrisch für alle Proben analysiert, wobei eine Reihe von zwischen 1,51 und 138 ng / &amp; mgr; l zeigt. Fünf Kontrollproben wurden für die Reproduzierbarkeit der Daten verwendet: zwei unabhängige Echtzeit - Experimente durchgeführt wurden , für c-MYC, HER2, BCAS1, AR, und STOX1. Die Variationskoeffizienten (CV) wurden dann für jedes Gen (Tabelle 2) berechnet...

Es wird eine Methode zur Analyse der DNA-Integrität in der zellfreien Überstandsfraktion von Urinproben vorgeschlagen. Die Methode eignet sich zur Früherkennung urologischer Malignome und hat sich für die Früherkennung von Blasenkrebs als genau erwiesen.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Integrität der zellfreien DNA im Urin an spezifischen Onkogensequenzen zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des urologischen Krebses zu beantworten, wie z.B. die frühzeitige nicht-invasive Diagnose von Blasen- und Prostatakrebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen und zu analysieren ist.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose urologischer Malignome, da sie normalerweise Zellen und freie Nukleinsäuren im Urin freisetzen. Obwohl diese Methode Einblicke in Harnproben geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Serum oder Plasma angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Konzentration an zellfreier DNA im Urin oft niedrig ist.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, eine einfache Methode zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs zu finden. Um das Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie eine 50-Milliliter-Urinprobe für den ersten Morgen, die nicht länger als drei Stunden bei vier Grad Celsius gelagert wurde. Drehen Sie die Probe zweimal um und teilen Sie sie dann in zwei konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf.Zentrifugieren Sie die Probe bei 850 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann werden für jedes Röhrchen 10 Milliliter des oberen Teils des Überstands auf zwei Fünf-Milliliter-Röhrchen übertragen, wobei mindestens zwei Milliliter Überstand über dem Pellet verbleiben. Entsorgen Sie die Pellets und lagern Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius.Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf für weitere Urinproben. Um mit der DNA-Reinigung zu beginnen, taut für jede Probe ein Aliquot des Urinüberstands auf. Wirbeln Sie die aufgetaute Probe vor und drehen Sie das Röhrchen zweimal um.Geben Sie einen Milliliter der Probe in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie den Rest bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie ein DNA-Aufreinigungskit vor, das für Urinproben gemäß den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Geben Sie 100 Mikroliter Proteinase K und einen Milliliter Lysepuffer in die Probe und mischen Sie sie gut mit einer Pipette.Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 56 Grad Celsius. Bereiten Sie während der Inkubation die Waschpuffer in einer Schleudersäule vor. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation auf Raumtemperatur abkühlen, fügen Sie dann einen Milliliter absolutes Ethanol hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren gut.Übertragen Sie 650 Mikroliter der Probe in die Säule. Eine Minute lang bei 6000 mal G zentrifugieren. Setzen Sie das Sammelröhrchen wieder auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Probe auf die Säule geladen wurde.Geben Sie dann 500 Mikroliter des ersten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 6000 mal G. Setzen Sie das Sammelröhrchen wieder ein, fügen Sie 500 Mikroliter des zweiten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie die Säule drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit. Stellen Sie die Säule in ein sauberes Auffangröhrchen und zentrifugieren Sie weitere drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.Übertragen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Laden Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säule und lassen Sie den Puffer sieben Minuten lang in die Säule einziehen. Dann zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 6000 mal G.Pipettieren Sie das Eluat zurück in die Säule und zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die zellfreie DNA des Urins zu erhalten. Um mit der Vorbereitung der Standards zu beginnen, isolieren Sie zunächst DNA aus einer geeigneten Zelllinie mit einem Aufreinigungskit. Quantifizieren Sie die DNA aus jeder gereinigten Urinprobe in der Zelllinie mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers.Verdünnen Sie die UCF-DNA auf ein Nanogramm pro Mikroliter und lagern Sie die verdünnten Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für den Integritätstest bereit sind. Verdünnen Sie die DNA der Zelllinie, um sechs 100-Mikroliter-Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen zu erhalten. Lagern Sie die Standards bei minus 20 Grad Celsius.Um mit dem DNA-Integritätstest zu beginnen, tauen Sie die UCF-DNA-Proben, die Standards, die entsprechenden PCR-Primer und den grünen Supermix auf Eis auf. Richten Sie dann die 72-Well-Rotorscheibenplatte mit Streifenrohren ein. Geben Sie zwei 10-Mikroliter-Aliquots des Standards und dann jede Probe in die Vertiefungen.Bereiten Sie zwei Vertiefungen mit 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser als Negativkontrollen vor. Bereiten Sie für jede gefüllte Vertiefung eine Mischung aus einem Mikroliter jeder Grundierung, 12,5 Mikrolitern grünem Supermix und 6,5 Mikrolitern RNase-freiem Wasser vor. Übertragen Sie 15 Mikroliter der Mischung in jede gefüllte Vertiefung und übertragen Sie die Vertiefungen dann in eine 72-Well-Rotorscheibe.Führen Sie die PCR mit einem Echtzeitgerät gemäß den Angaben des Herstellers durch. Überprüfen Sie mit der Gerätesoftware, ob Replikate eine Differenz von einem oder mehreren Schwellenwerten aufweisen. Verwerfen Sie diese Proben aus der Analyse, und bewerten Sie den mittleren Zyklusschwellenwert für die verbleibenden Proben.Führen Sie eine Schmelzanalyse an jeder Probe mit einem mittleren Zyklusschwellenwert von 36 oder weniger durch, um die PCR-Produktspezifität zu bewerten. Verwenden Sie dann die Standardkurve, um eine Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter für jede Anwendung zu bestimmen. Es wurde zellfreie DNA im Urin isoliert und die DNA-Integrität in vier Regionen bewertet, die eine erhöhte DNA-Kopienzahl in soliden Tumoren aufweisen.Es wurde auch eine Kontrollsequenz ausgewertet, um zu überprüfen, ob die DNA-Menge in jeder Probe für den Integritätstest ausreichend war. Für jedes Gen wurden die Gesamtkonzentration der freien DNA und die Variationskoeffizienten berechnet. Diese Methode zeigt eine Sensitivität von 73 % und eine Spezifität von 84 % für die Erkennung von Blasenkrebs, aber nur eine Sensitivität von 58 % und eine Spezifität von 44 % für Prostatakrebs.Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Arbeitstag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie digitale PCR oder Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. den Kopienzahlinduktor der interessierenden Gene zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man auf sehr einfache Weise zellfreie DNA aus dem Urin isoliert und wie man die Integrität bestimmter interessierender Regionen mit Hilfe von Echtzeit-PCR-Ansätzen untersucht.

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Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.

Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

Lernen Sie die Analyse von zellfreier DNA-Integrität in Urinproben zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs. Diese Methode ermöglicht eine einfache und zuverlässige Diagnose urologischer Malignome.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

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