Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Integrität der zellfreien DNA im Urin an spezifischen Onkogensequenzen zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des urologischen Krebses zu beantworten, wie z.B. die frühzeitige nicht-invasive Diagnose von Blasen- und Prostatakrebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen und zu analysieren ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose urologischer Malignome, da sie normalerweise Zellen und freie Nukleinsäuren im Urin freisetzen. Obwohl diese Methode Einblicke in Harnproben geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Serum oder Plasma angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Konzentration an zellfreier DNA im Urin oft niedrig ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, eine einfache Methode zur nicht-invasiven Früherkennung von Blasenkrebs zu finden. Um das Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie eine 50-Milliliter-Urinprobe für den ersten Morgen, die nicht länger als drei Stunden bei vier Grad Celsius gelagert wurde. Drehen Sie die Probe zweimal um und teilen Sie sie dann in zwei konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 850 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann werden für jedes Röhrchen 10 Milliliter des oberen Teils des Überstands auf zwei Fünf-Milliliter-Röhrchen übertragen, wobei mindestens zwei Milliliter Überstand über dem Pellet verbleiben. Entsorgen Sie die Pellets und lagern Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius.

Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf für weitere Urinproben. Um mit der DNA-Reinigung zu beginnen, taut für jede Probe ein Aliquot des Urinüberstands auf. Wirbeln Sie die aufgetaute Probe vor und drehen Sie das Röhrchen zweimal um.

Geben Sie einen Milliliter der Probe in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie den Rest bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie ein DNA-Aufreinigungskit vor, das für Urinproben gemäß den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Geben Sie 100 Mikroliter Proteinase K und einen Milliliter Lysepuffer in die Probe und mischen Sie sie gut mit einer Pipette.

Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 56 Grad Celsius. Bereiten Sie während der Inkubation die Waschpuffer in einer Schleudersäule vor. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation auf Raumtemperatur abkühlen, fügen Sie dann einen Milliliter absolutes Ethanol hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren gut.

Übertragen Sie 650 Mikroliter der Probe in die Säule. Eine Minute lang bei 6000 mal G zentrifugieren. Setzen Sie das Sammelröhrchen wieder auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Probe auf die Säule geladen wurde.

Geben Sie dann 500 Mikroliter des ersten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 6000 mal G. Setzen Sie das Sammelröhrchen wieder ein, fügen Sie 500 Mikroliter des zweiten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie die Säule drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit. Stellen Sie die Säule in ein sauberes Auffangröhrchen und zentrifugieren Sie weitere drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.

Übertragen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Laden Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säule und lassen Sie den Puffer sieben Minuten lang in die Säule einziehen. Dann zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 6000 mal G.

Pipettieren Sie das Eluat zurück in die Säule und zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die zellfreie DNA des Urins zu erhalten. Um mit der Vorbereitung der Standards zu beginnen, isolieren Sie zunächst DNA aus einer geeigneten Zelllinie mit einem Aufreinigungskit. Quantifizieren Sie die DNA aus jeder gereinigten Urinprobe in der Zelllinie mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers.

Verdünnen Sie die UCF-DNA auf ein Nanogramm pro Mikroliter und lagern Sie die verdünnten Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für den Integritätstest bereit sind. Verdünnen Sie die DNA der Zelllinie, um sechs 100-Mikroliter-Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen zu erhalten. Lagern Sie die Standards bei minus 20 Grad Celsius.

Um mit dem DNA-Integritätstest zu beginnen, tauen Sie die UCF-DNA-Proben, die Standards, die entsprechenden PCR-Primer und den grünen Supermix auf Eis auf. Richten Sie dann die 72-Well-Rotorscheibenplatte mit Streifenrohren ein. Geben Sie zwei 10-Mikroliter-Aliquots des Standards und dann jede Probe in die Vertiefungen.

Bereiten Sie zwei Vertiefungen mit 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser als Negativkontrollen vor. Bereiten Sie für jede gefüllte Vertiefung eine Mischung aus einem Mikroliter jeder Grundierung, 12,5 Mikrolitern grünem Supermix und 6,5 Mikrolitern RNase-freiem Wasser vor. Übertragen Sie 15 Mikroliter der Mischung in jede gefüllte Vertiefung und übertragen Sie die Vertiefungen dann in eine 72-Well-Rotorscheibe.

Führen Sie die PCR mit einem Echtzeitgerät gemäß den Angaben des Herstellers durch. Überprüfen Sie mit der Gerätesoftware, ob Replikate eine Differenz von einem oder mehreren Schwellenwerten aufweisen. Verwerfen Sie diese Proben aus der Analyse, und bewerten Sie den mittleren Zyklusschwellenwert für die verbleibenden Proben.

Führen Sie eine Schmelzanalyse an jeder Probe mit einem mittleren Zyklusschwellenwert von 36 oder weniger durch, um die PCR-Produktspezifität zu bewerten. Verwenden Sie dann die Standardkurve, um eine Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter für jede Anwendung zu bestimmen. Es wurde zellfreie DNA im Urin isoliert und die DNA-Integrität in vier Regionen bewertet, die eine erhöhte DNA-Kopienzahl in soliden Tumoren aufweisen.

Es wurde auch eine Kontrollsequenz ausgewertet, um zu überprüfen, ob die DNA-Menge in jeder Probe für den Integritätstest ausreichend war. Für jedes Gen wurden die Gesamtkonzentration der freien DNA und die Variationskoeffizienten berechnet. Diese Methode zeigt eine Sensitivität von 73 % und eine Spezifität von 84 % für die Erkennung von Blasenkrebs, aber nur eine Sensitivität von 58 % und eine Spezifität von 44 % für Prostatakrebs.

Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Arbeitstag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie digitale PCR oder Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. den Kopienzahlinduktor der interessierenden Gene zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man auf sehr einfache Weise zellfreie DNA aus dem Urin isoliert und wie man die Integrität bestimmter interessierender Regionen mit Hilfe von Echtzeit-PCR-Ansätzen untersucht.