Name: Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Isolierung zellulärer Extrazellulärmatrix mit Ammoniumhydroxid für biochemische und funktionelle Analysen. Diese Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung von ECM-Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit.

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Wir sind sehr dankbar, dass Dr. Belinda Willard, Proteomics und Metabolomics Labor, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, die Proteomanalyse von RCS ECM für die Durchführung. Wir erkennen die finanzielle Unterstützung von theMedical Research Council in Großbritannien, gewähren Nummer K018043, zu JCA.

1. Entfernung von Zellen mit Ammoniumhydroxidlösung <ol><li> Bereiten Sie adhärenter Zellen durch an der geeigneten Dichte Überzug. HINWEIS: Die Zellen können beliebige adhärenten Zelltyp sein, der für die Analyse ausreichend ECM erzeugt. Hier beschreiben wir die Verwendung von COS-7-Zellen, eine afrikanische grüne Affen-Nieren-Fibroblasten-ähnliche Zelllinie, die SV-40-Virus-DNA-Sequenzen enthält; RCS, eine Ratte Chondrosarkom Zelllinie; oder normalen humanen dermalen Fibroblasten (HDF) Stämmen aus juvenile Vorhaut. HDF sind aus dem Kanal 1 bis Kanal 8 nur dann verwendet. <ol><li> Platte, die Zellen auf Deckgläser für die Abbildung von lebenden Zellen und ECM, für die Fluoreszenzmikroskopie Studien von festen ECM, oder zur Herstellung von Zellen abgeleiteten ECM für kleine funktionelle Assays. Platte der Zellen auf Zellkulturschalen für die SDS-PAGE-Analyse, Immunoblot oder Proteomik-Studien. HINWEIS: Die Zellkulturbedingungen (Anzahl der Zellen und Kulturmedium zu plattieren) hängt vom Zelltyp. Die Zellzahl auf Platte müssenempirisch für die jeweilige Zelllinie oder Zellstamm aufgebaut werden. </li><li> Lassen Sie eine geeignete Zeit für die Zellen ECM zu deponieren, in der Regel&gt; 16 h. HINWEIS: Die Zeitdauer vom Zelltyp abhängen und müssen empirisch ermittelt werden. Wenn ektopische Expression leitenden, entsprechenden Zeit für die Expression des transfizierten Proteins von Interesse und zur Abscheidung von ECM. </li></ol></li><li> In einer Dunstabzugshaube, werden 20 mM Ammoniumhydroxid in einem geeigneten Gefäß durch die Stammlösung Verwässerungs 1/14 mit entsalztem H 2 O. <ol><li> Entfernen der Zellen aus dem Inkubator und schonend Kulturmedium zu entfernen. Fügen Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ / Mg 2+ , indem sie gegen die Wände der Schale sanft gießen. Rock the Gericht zweimal, und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Kunststoff Transferpipette. Wiederholen Sie zweimal. </li></ol></li><li> In einer Dunstabzugshaube, jedes Gericht kippen und die PBS aus Schritt 1.2 mit einem Kunststoff Transferpipette entfernen. In 3ml Ammoniumhydroxid pro 100-mm-Schale und inkubieren sie für 5 min bei Raumtemperatur. Während der 5-min Inkubationszeit leicht bewegen das Gericht alle min die Lyse aller Zellen zu gewährleisten. 1,4-1,7 Schritte auch in der Dunstabzugshaube durchgeführt werden. HINWEIS: Alternative Zellentfernungsreagenzien umfassen 2 M oder 8 M Harnstoff, der mit den Zellen für 10 min inkubiert werden. </li><li> In reichlich entionisiertem H 2 O in jede Schale, mindestens 20 ml pro 100 - mm - Schale, mit Schaukeln. Entsorgen des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Material , das aus Ammoniumhydroxid zusammengesetzt ist, lysierten Zellen und deionisiertem H 2 O-durch Aspiration mit einer Transferpipette. Übertragen Sie diese Abfalllösung in einen Behälter für flüssige Abfälle. </li><li> Waschen des unlöslichen ECM Schicht in reichlicher deionisiertem H 2 O viermal die vollständige Entfernung aller Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. </li><li> Zur Untersuchung des ECM durch Immunofluoreszenz, fixieren Sie die ECM durch Zugabe von 2%Paraformaldehyd (PFA; 3 ml pro 100 mm Schale) bei Raumtemperatur für 10 min. Achtung: PFA ist sehr gefährlich im Falle von Haut- oder Augenkontakt und schweren Überbelichtung kann Lungenschäden, Würgen, Bewusstlosigkeit oder zum Tod führen produzieren. Es sollte nur in einer Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung gehandhabt werden sollte getragen werden. </li><li> Waschen Sie jeden festen Probe zweimal mit PBS, wie in Schritt 1.2, und entsorgen Sie die PFA-Lösung in einen geeigneten Abfallbehälter. Falls notwendig, speichert das ECM Proben in PBS bei 4 ° C, bevor sie für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. </li></ol> 2. Tracking-Abscheidung eines ECM-Protein durch konfokale Mikroskopie Imaging lebender Zellen <ol><li> Zählen Sie die Zellen unter einem Hämozytometer. Für COS-7-Zellen, 250.000 Zellen auf einer 60 mm Zellkulturschale zur Transfektion plattieren. HINWEIS: Für die Live-Cell-Imaging, müssen die Zellen mit einem Vektor transfiziert werden codiert, das ECM-Protein von Interesse, fusioniert im Rahmen mit einem genetisch kodierten fluoreszierennt-Tag. Dies ist die Identifizierung des ECM-Protein von Interesse während der Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen. </li><li> Nach einer geeigneten Zeit für die Proteinexpression (zB 16 h) , um die Zellen von der Schale mit Trypsin-EDTA - Lösung zu entfernen, so dass sie in einem Hämocytometer zählen, und Platte ~ 150.000 Zellen auf eine 35-mm - Gitter, Glasbodenschale für die Bildgebung. Allow 2 h für die Zellen wieder zu befestigen und ECM deposition (die Zeitdauer hängt von dem Zelltyp und muß empirisch ermittelt werden) zu beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Zellmedium, das nicht Phenolrot enthält, da dies eine rote Färbung geben können, die Bildqualität auswirkt. </li><li> Während der obigen Zeitraum von 2 h, stellen ein konfokales Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator Kammer und einer CO 2 -Angebot auf. Dass die Temperatur in der Kammer und in der Schale auf 37 ° C vor der Bildgebung zu stabilisieren; dies kann bis zu 1 Stunde dauern. </li><li> Inkubieren Sie die auf die Schale mit einem fluoreszierenden Zellmarker für 30 min gridded 35 mm plattierten Zellen. Dann waschen Sie die Zellenzweimal in Phenolrot-freiem Kulturmedium vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Eine cytoplasmatische können fluoreszierende Marker verwendet werden, um Zellvolumen sichtbar zu machen, oder ein membran Einbeziehung Marker verwendet werden können Zellränder sichtbar zu machen. </li><li> Mit dem 20x-Objektiv und Phasenkontrast auf einem konfokalen Mikroskop, identifizieren ein geeignetes Planquadrat, das eine Anzahl (&gt; 3) von adhärenten enthält, gesunde Zellen. Bestätigen Sie die Expression des Zielproteins der Wahl in den Zellen innerhalb des ausgewählten Planquadrat die 63X oder 100X Ziele und die entsprechenden Wellenlängen unter Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Richten Sie Fluoreszenz und Phasenkontrast-Zeitraffer-Bildgebung einen z-Stack-Software. Stellen Sie die &quot;Start&quot; Stack zu sein knapp unterhalb der ECM-Schicht und dem &quot;Ende&quot; Stack knapp über dem Zellkörper zu sein. Stellen Sie die z-Schrittweite auf 0,3 um und die z-Volumen zwischen 5 und 10 &amp; mgr; m Tiefe in insgesamt, je nach Zelltyp. Dies gibt zwischen 15-30 z Schnitte pro Zeitpunkt. </li><li> Capture-Fluoreszenz (für rot fluoreszierendes Protein (RFP), Anregung = 555 nm und Emission = 584 nm) und Phasenkontrast-Bilder in regelmäßigen Abständen über einen festgelegten Zeitraum. Verwenden Sie zum Beispiel die Zeitraffer-Software das Zeitintervall, in 2 Minuten und die Dauer bis 2 h einzustellen. Wählen Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; Erfassung von z-Schnittbilder über den definierten Zeitraum zu beginnen. </li><li> Am Ende des Zeitraums, entfernen Sie die Zellen, die aus Schale, wie 1,1-1,5 in den Schritten, die Lokalisierung des fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse in der ECM zu bestätigen. </li><li> Verwenden der Phasenkontrast-Bildgebung und die 20x-Objektiv das entsprechende Planquadrat zu verlagern. </li><li> Wechseln Sie in das 63X Ziel und zu identifizieren, die ECM-Schicht unter Fluoreszenzmikroskopie. Vergleichen Sie dieses Bild mit dem Pre-Extraktion Bild </li></ol> 3. Sterile Herstellung von Zell abgeleiteten ECM für Zell funktionelle Assays <ol><li> Wachsen einer Population von Zellen (die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen) auf Deckgläsern und anderen popunung (die &quot;test&quot; Zellen) in Standard-Kultur in einer Schale 100 mm Zellkultur für 24 Stunden mindestens. ANMERKUNG: Diese können zwei beliebige unterschiedliche adhärenten Zelltypen sein, und das experimentelle Design kann die Transfektion von einer oder beiden Zellpopulationen umfassen eine fluoreszenzmarkierte ECM-Protein zu exprimieren. </li><li> In einer laminaren Strömungshaube, wie für die Zellkultur verwendet wird , herzustellen sterile Lösungen von PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+, 20 mM Ammoniumhydroxid (siehe Schritt 1.3) und deionisiertes H 2 O , indem jeweils durch ein steriles 0,2 Passieren um-Filter in eine geeignete sterile Behälter. </li><li> sterile Technik Pflege, vorsichtig waschen die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen auf Deckgläsern dreimal mit sterilem PBS (siehe Schritt 1.2). </li><li> Entfernen Sie die PBS durch Absaugen mit einer sterilen Pipette und entsorgen sie in einem geeigneten flüssigen Abfallbehälter. In 20 mM sterile Ammoniumhydroxid (3 ml / 100-mm-Schale) und brüten sie für 5 min mit in Abständen zu schaukeln. </li><li> In großen Mengensterilem deionisiertem H 2 O in die &quot;Matrix - Hersteller&quot; Schale, mindestens 20 ml pro 100 - mm - Schale, mit Schaukeln, und das Zelllysat in einen geeigneten Abfallbehälter ausleeren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5 noch viermal die vollständige Entfernung des Ammoniumhydroxid-solubilisierten Materials zu gewährleisten. HINWEIS: Das ECM abgelegt durch die &quot;Matrix-Hersteller&quot; Zellen auf den Deck liefert dann eine sterile ECM für funktionelle Assays mit irgendwelchen Testzellen von Interesse. </li><li> Inkubieren der Testzellen aus der Zell Lager-Schale mit 1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung pro 100 mm Schale (von 0,05% w / v Trypsin und 0,02% w / v EDTA in Hanks balancierter Salzlösung), bis die Testzellen von der Schale abgelöst werden . In Zellmedium Zentrifugation der Testzellen bei 400 × g für 5 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren der Testzellen in frisches, steriles Medium und zählen sie in einem Hämozytometer. Platte, die eine entsprechende Anzahl dieser Testzellen auf die sterile, isoliert ECM auf coverslips. Kultur sie in der entsprechenden Zelle Medium für 2-3 h, oder für die Zeitdauer für die Versuchsplanung erforderlich. </li><li> Um die Organisation des Aktin-Zytoskelett untersuchen, fixieren die Testzellen in 2% PFA und färben sie mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -phalloidin (Anregung = 490 nm und Emission = 525 nm) sichtbar zu machen F-Actin und mit 4 &#39;, 6 -diamidino-2-phenylindol (DAPI; Anregung = 358 nm und Emission = 461 nm) , um die Kerne 11 zu visualisieren. HINWEIS: Vergleichen Sie die Morphologie und die Aktin-Organisation in den Test auf heterologen Zellen abgeleiteten ECM mit Testzellen auf ihre eigenen ECM plattiert plattierten Zellen. </li></ol> 4. Isolierung von ECM für SDS-PAGE, Immunblot-Analyse oder Proteomics <ol><li> Wachsen anhaftenden Zellen von Interesse auf 100 mm Zellkulturschalen (5 bis 10 Gerichte für die Proteomik oder 1-2 Gerichte für Immunoblotting) für 24-96 h, je nach Zelltyp, Sekretion und Ablagerung von ECM zu ermöglichen. </li><li> Entfernen Sie die Zellen als Beschribed in Schritten von 1,1 bis 1,5. </li><li> Kippen Sie jede Platte in einem Winkel zu entwässern Rest H 2 O an den Boden der Schale und vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden H 2 O mit einem p200 pipettieren , bis die Platte vollständig trocken ist. </li><li> Parallel Wärme SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM Dithiothreitol (DTT) bis 95 ° C für 2 min ein Heizblock verwendet, und dann zu der Platte hinzuzufügen. 200 &amp; mgr; l Probenpuffer pro 100 mm Platte ist geeignet für Proben, die durch Immunoblot untersucht werden. <ol><li> Bis ECM durch Massenspektrometrie analysiert, erzielen eine konzentrierte Probe durch die SDS-PAGE-Probenpuffer von der Schale zu sammeln (wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben, weiter unten), wieder Erhitzen auf 95 ° C, und unter Verwendung des gleichen Aliquots in 2-3 zusätzliche Platten. </li></ol></li><li> Verwenden Sie einen Zellschaber, um gründlich die ECM von der Schüssel kratzen, um sicherzustellen, dass alle Bereiche der Schale gekratzt wurden. </li><li> Mit dem Zellschaber, sammeln die Probe auf einer Seite der Schale und nehmen Sie sie mit einem 200&amp; mgr; l-Pipettenspitze in ein Rohr. </li><li> Die zurückbleibenden SDS-PAGE-Probenpuffer Extrakt aus der Zellschaber Spitze in die Röhre um den Verlust von ECM-Material zu minimieren. Für eine konzentrierte Probe erneut erhitzen die gleiche SDS-PAGE-Probenpuffer Aliquot auf 95 ° C und wiederverwenden es über 2-3 zusätzliche Platten. </li><li> Lösen Sie die ECM - Proteine durch SDS-PAGE 12, unter Verwendung von entweder 7% oder 4-7% Steigung Polyacrylamidgelen. HINWEIS: Es ist bequem vorgefärbten Proteinmarker zu verwenden. </li><li> Um die Auflösung der hochmolekularen ECM-Proteine ​​erhöhen, verlängern die Gel Laufzeit, so dass die 37 kDa Molekulargewichtsmarker verläuft in der Nähe der Unterseite des Gels und Molekulargewichtsmarker &lt;37 kDa haben das Gel ablaufen. </li><li> Für Proteomanalyse von ECM-Proteine, färben das Gel mit einem Protein-Färbung und ein Bild aufzunehmen. Schneiden Sie Bänder von Interesse aus dem Gel, verdauen sie mit Trypsin und analysieren sie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) -Masse Spektrometrie &lt;sup&gt; 13. </li><li> Alternativ kann für eine umfassendere Analyse des ECM - Extrakt und die gesamte Probe zu analysieren, um das Gel Spur in Abschnitte schneiden, verdauen sie mit Trypsin und führen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) 14. </li><li> Alternativ 15 Immunoblotting übertragen Proteine aus dem SDS-PAGE - Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran bei 15 V für mindestens 1 h 10 min (Halbtrockenverfahren) , um die Übertragung der hochmolekularen ECM Proteine zu gewährleisten . Visualisieren Sie die Gesamtzahl auf die Membran übertragen Protein mit einer Ponceau S-Färbung. </li><li> Nach dem Schritt 4.11 Verwenden Antikörper die Anwesenheit einzurichten , und / oder eine semi-quantitative Analyse einzelner ECM Proteine 15 machen. <ol><li> Blockieren der Membran mit 2% (w / v) Milch in TBS-Tween 20 (Blockierungspuffer) über Nacht bei 4 ° C. Verdünnte spezifische Antikörper gegen ECM-Proteine ​​in Blocking-Puffer und Inkubation mit der Membran für 1,5 h bei Raumtemperatur (Antikörper gegen fibronectin verdünnt 1/600 und Antikörper gegen Thrombospondin-1, verdünnt 1/150; Ergänzende Tabelle 1). </li><li> Testen der Qualität der ECM Isolierung durch die gleiche Blot mit Antikörpern gegen reichlich intrazelluläre Proteine ​​erneut Sondieren wie Actin oder Tubulin (anti-Aktin verdünnt 1 / 10.000 und anti-Tubulin-1 / 5.000 verdünnt). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Das Verfahren hat einige wichtige Schritte, die die erfolgreiche Isolierung und Analyse von ECM zu gewährleisten, die befolgt werden müssen. Beispielsweise wird Ammoniumhydroxid verwendet, um die Zellen zu entfernen, und ECM für die Analyse zu isolieren. Obwohl Ammoniumhydroxid in wässrigen Lösungen im Dunkeln stabil ist und bei Raumtemperatur gelagert werden, Flaschen muss zwischen jedem Gebrauch wieder dicht verschlossen werden. Da das Gas aus der Lösung verdampfen kann, wodurch die Konzentration zu reduzieren, haben wir eine frische Flasche beginnen alle 6-8 Wochen wird dringend empfohlen. Darüber hinaus sollte die Arbeitslösung frisch für jedes Experiment durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, dass die Zellen vollständig mit reichlichen Waschungen in entionisiertem Wasser entfernt. Wenn diese Schritte nicht ausreichend durchgeführt werden, kann Zellmaterial auf dem Teller bleiben und Downstream-Analysen verunreinigen. Wenn Zellen für 10 Tage oder länger, zusätzliches Wasser wäscht angebaut worden erforderlich sein. Es ist wichtig zu nOTE dass die isolierten ECM - Schicht im Vergleich zu den Zellen 11 typischerweise sehr dünn ist, so Sorgfalt erforderlich ist , wenn das ECM während der Abbildung identifizieren. Für eine effektive Extraktion des isolierten ECM in SDS-PAGE-Probenpuffer, ist es wesentlich, daß die Probenpuffer ein Reduktionsmittel enthält. Für die wirksamste Entfernung des ECM, kochend heißen Probenpuffer verwendet werden. Für Experimente, in denen ECM Proben werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese für die Proteinfärbung oder Proteomik gelöst werden, ist es entscheidend, eine konzentrierte Probe durch Abschaben mehrere Platten-Wert von ECM in der gleichen aliquoten Probenpuffer zu erreichen. Technische Änderungen und Fehlerbehebung Die Produktion und Sekretion von ECM - Proteine können signifikant zwischen Zelltypen variieren, so Zeiträume für die Sekretion und Ablagerung von ECM sollte de novo für jeden Zelltyp bestimmt werden. Es ist auch wichtig, sich bewusst zu sein, dass ECM Zusammensetzung dynamisch in Relation t änderno Zelldichte und der Zeit in Kultur 18. Dieser Faktor sollte berücksichtigt werden, wenn Experimente entwerfen. Natürlich ist die Auswahl eines Zelltyps für dieses Verfahren an Bedeutung, insbesondere, wenn ECM für die Analyse durch Massenspektrometrie Extraktion, die eine erhebliche Menge an Gesamt ECM-Protein erfordern. Einschränkungen der Technik Zellen, die sehr geringe Mengen an ECM Proteine ​​sezernieren wird zur Verwendung bei diesem Verfahren schwieriger sein. Nicht anhaftende Zellen, Kulturen 3D-Zelle oder Assays Zellinvasion sind derzeit für ECM Isolation durch dieses Verfahren nicht geeignet. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Verwendung mit Standard &quot;2-dimensional&quot; Zellkulturen. Weil das Ammoniumhydroxid Extraktion die Zellen vollständig entfernt, zugeordnete ECM mit den Oberseiten der Zellen und sezerniert wird, jedoch nicht vernetzt, werden ECM-Proteine ​​ebenfalls entfernt, auf der Schale verlassen eine dünne Schicht zusammengesetzt ECM von unten und um die Basen der Zellen 11,17 </sup&gt;. Es ist komplex zu quantifizieren, wie viel ECM wird durch die Ammoniumhydroxid-Extraktion freigesetzt, da das freigesetzte Material auch ECM-Proteine ​​enthält, die entweder vor von der Zelloberfläche zur Sekretion oder nach Aufnahme intrazellulär vorliegen. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden Die Fähigkeit, eine breite Palette von Experimenten mit isolierten ECM zu führen ist wichtig, im Rahmen der Zellbiologie und Gewebephysiologie, und es hat auch Auswirkungen auf den Gebieten der Geweberegeneration und Tissue Engineering. Das Verfahren hat Vorteile gegenüber Gele aus gereinigtem Kollagen oder andere gereinigte ECM-Proteine ​​in dass die gebildeten Zellen montieren komplexe ECM Strukturen an ihrer nativen Größe, mit nativer Vernetzungsmechanismen und mit den einzelnen ECM Proteine ​​in Verhältnissen entsprechend dem Zelltyp Herkunft. Zum Beispiel zeigte die Proteom-Studie von RCS ECM reichlich Matriline und COMP / TSP5, wie erwarteteine knorpelige ECM 19,20 (Abbildung 4). Im Allgemeinen ist die Analyse von Zellen abgeleiteten ECM durch seine Natur als umfangreiches Netzwerkmultiprotein behindert, die in kovalenter Vernetzung und die Unlöslichkeit vieler ECM-Proteine ​​führt, und auch durch die mögliche Kontamination von ECM-Extrakte mit intrazellulären Proteinen. Ein mehrstufiges Verfahren entwickelt , um die ECM - Fraktion aus Geweben für Proteomanalyse zur Isolierung ergab 8% der ECM - Proteine in der gesamten Gruppe von Proteinen 21 identifiziert. Jedoch Peptide aus ECM-Proteine ​​waren 73% der gesamten Peptide identifiziert. Dieses Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM schnell und zuverlässig entfernt Zellmaterial während ECM-Proteine ​​erhalten bleibt. Dieses Verfahren kann für eine Reihe von Zelltypen und Downstream-Anwendungen verwendet werden, und erleichtert die Analyse der ECM biology und Zell-ECM-Wechselwirkungen in Zellkultur. Unsere Protokolle Detail, wie das Verfahren auf verschiedenen Ebenen angewendet werden kann, eine breite Palette von exp zu adressierenerimental Fragen in Bezug auf ECM-Organisation, Dynamik oder Zusammensetzung, sowie die funktionalen Auswirkungen der isolierten ECM auf Zellen. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Mit Blick auf die Zukunft könnte das Verfahren für die mit 3D-Zellkulturen Verwendung angepaßt werden; dies würde ihre physiologische Relevanz erweitern. Dezellularisiertes natives Gewebe hat ein großes Potenzial als ein Gerüst für die Regeneration von verlorenen oder beschädigten Gewebes und als Alternative zur Transplantation, beispielsweise nach 22 Herzinsuffizienz. Es hat das Potenzial, die Probleme der Spender Verfügbarkeit und Immunabstoßung zu überwinden. Zukünftige Anwendungen des Verfahrens in diesem Bericht beschriebenen könnte seine Verwendung mit 3D-Zellkulturen oder Gewebe Dezellularisierung untersuchen, was den Anwendungsbereich dieses Ansatzes erhöhen würde.

In den letzten Jahrzehnten hat sich die extrazelluläre Matrix (ECM) als eine vielfältige, dynamische und komplexe Umgebung geworden erkannt, die in mehreren Zell-physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. Auf der Ebene der Gewebe beeinflusst die ECM - Zell - Signal, Motilität, Differenzierung, Angiogenese, Stammzellbiologie, Tumorentstehung, Fibrose, usw. 1,2. Die Studie von ECM-Organisation und ECM-abhängige Prozesse hat somit weitreichende Auswirkungen für die Zellbiologie und Gewebephysiologie. Um ein mechanistisches Verständnis von ECM-Zusammensetzung, Organisation und funktionelle Eigenschaften, Methoden für die präzise Trennung von ECM erreichen sind erforderlich. Während die früheste Erkennung von ECM - Proteine verlassen nach der Isolierung aus Geweben 3 hat sich die Herstellung von ECM aus kultivierten Zellen nun häufiger geworden. Die Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM ist kompliziert aus zwei Hauptgründen. Erstens, die Anwesenheit von Zellen, und dieir reichlich intrazellulärer Proteine ​​kann es schwierig machen, die ECM als diskrete extrazelluläre Struktur zu isolieren. Tatsächlich haben einige ECM Proteine Rollen innerhalb der Zelle als auch in der ECM 4; Daher ist die effiziente Entfernung von intrazellulären Proteinen aus Zellen stamm ECM ist entscheidend, wenn die Untersuchung von Proteinen innerhalb der ECM nicht mit ihren Rollen in der Zelle zu verwechseln ist. Zweitens Zellen stamm ECM wird von vielen großen, oligomere Proteinen, die oft kovalent vernetzt bei ECM Montage und sind daher unlöslich in Vollwaschmitteln. Diese Eigenschaften können Extraktions- und die weitere Analyse der ECM komplizieren. Um diese Probleme anzugehen, ist ein Verfahren erforderlich, die eine effiziente Trennung von ECM-Proteinen aus Zellkomponenten ermöglicht. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für die Isolierung von ECM entweder aus Zellkultur oder Gewebeextrakten beschrieben. Viele dieser Methoden sind bei der Extraktion des reichlich vorhandenen ECM pr gerichtetotein, Kollagen, aus Geweben und umfassen die Verwendung von Neutralsalzen 3, sauren Bedingungen 5,6 oder Pepsin 7. Isolierung von Gesamt-ECM aus Gewebeextrakten beinhaltet oft Dezellularisierung des Gewebes vor der Isolierung des ECM. Zum Beispiel wurde ein sequentielles Extraktionsverfahren beschrieben , das 8 ECM aus menschlichem Herzgewebe isoliert. Zunächst wurden lose gebundene ECM-Proteine ​​extrahiert, mit 0,5 M NaCl vor der Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen. Schließlich wurden die verbleibenden ECM - Proteine unter Verwendung von 4 M Guanidin - 8 extrahiert. ECM kann auch von dezellularisierter Proben unter Verwendung von 8 M Harnstoff 9 gelöst werden. Andere Techniken verwenden Detergentien wie Desoxycholsäure 10, beide Zellen und ECM zu extrahieren , bevor unlösliches ECM Proteine aus der löslichen Zelllysat durch Zentrifugation abtrennt. Das Verfahren zur Isolierung und Analyse von Zellen abgeleiteten ECM in diesem Bericht beschrieben wird, liefert eine Reproproduzierbar Verfahren zur Entfernung von Zellmaterial, so dass Zellen abgeleiteten ECM , die durch für weitere biochemische Analyse in situ Immunfluoreszenz oder extrahiert analysiert werden. Dieses Verfahren kann für jede adhärenten Zelltyp angepasst werden und kann für nachgeschaltete Verfahren skaliert werden, wie beispielsweise Immunoblotting oder Massenspektrometrie, oder für die Verwendung des isolierten ECM in funktionellen Studien. Das Verfahren kann auch in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie lebender Zellen verwendet werden ECM Ablagerung eines getaggten Proteins von Interesse in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird durch die Verwendung einer gerasterten, Glasbodenschale erzielt. Insgesamt bietet der Ansatz eine genaue Isolierung von Zellen abgeleiteten ECM und auch den Umfang zu identifizieren und die Abscheidung und die Dynamik der einzelnen ECM-Proteine ​​überwachen.

<table><tbody><tr><td>Antikörper gegen COL1A1</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Kaninchen polyklonal. Reagiert mit anderen fibrillären Kollagenen sowie Kollagen I. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antikörper gegen Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F3648</td><td>Kaninchen polyklonal. WB: 1/600 für 1,5 h. IF: 1/200</td></tr><tr><td>Antikörper gegen Thrombospondin 1</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-13398</td><td>Monoklonaler Maus-Klon A6.1. WB: 1/150 für 1,5 h</td></tr><tr><td>Antikörper gegen RFP</td><td>Abcam</td><td>ab62341</td><td>Kaninchen polyklonal. WB: 1/2.000 für 2 h</td></tr><tr><td>Antikörper gegen &beta;-Aktin</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>Maus monoklonaler Klon AC-15. WB: 1/10.000 für 1,5 h</td></tr><tr><td>Antikörper gegen &alpha;-Tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Maus monoklonaler Klon DM1A. WB: 1/5.000 für 1,5 h</td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>C2925</td><td>Marker für fluoreszierende Zellen. Verwendung bei 1 & Mikro; M für 30 min</td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P-5282</td><td>Stamm = 50 mg/ml in DMSO. 1/50 für 45 min</td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>Sigma</td><td>F8771</td><td>IF: 1/50 für 1 h</td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Schaf-Anti-Kaninchen IgG</td><td>SIgma</td><td>F7512</td><td>IF: 1/50 für 1 h</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80010</td><td>WB: 1/50.000 für 1 h</td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-80011</td><td>WB: 1/100.000 für 1 h</td></tr><tr><td>Vectorshield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Bei 4 Grad lagern; C im Dunkeln</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Warm vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsmedium</td><td>PromoCell</td><td>C-23010</td><td>Warm vor Gebrauch, Ergänzung mit 50 & Mikro; g/mL Ascorbinsäure</td></tr><tr><td>Phenolrotfrei DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>21063-029</td><td>Vor Gebrauch erwärmen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Vor Gebrauch erwärmen</td></tr><tr><td>Gitterschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-C-GRID</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH, 28-30%ige Lösung</td><td>Sigma</td><td>221228</td><td>In entionisiertem Wasser auf 20 mM verdünnen. Einmal geöffnet, im Dunkeln aufbewahren, fest verschlossen.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16%ige Lösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Verdünnung auf 2 % (v/v) in PBS</td></tr><tr><td>Desoxycholsäure</td><td>Sigma</td><td>D2510</td><td>Verwendung bei 2 % (v/v) Endkonzentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Verdünnung auf 0,5 % (v/v) Endkonzentration</td></tr><tr><td>GelCode Blue Färbereagenz</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>24590</td><td>Proteinfärbung für SDS-PAGE-Gele</td></tr><tr><td>Precision Plus Proteinstandards</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td>Proteinstandards für SDS-PAGE-Gele</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi Dry Transferzelle</td><td>Biorad</td><td>1703940</td><td>Effizienter Transfer von hochmolekularen Proteinen</td></tr><tr><td>PVDF-Transfermembran</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td>Immobilon-PSQ&nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S Färbung</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td>Reversible Proteinfärbung für PVDF-Membran</td></tr><tr><td>WesternSure Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrat</td><td>LI-COR</td><td>926-80200</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungs-Chemilumineszenzfolie</td><td>GE</td><td>Healthcare 28906837</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfiltrationseinheit, MILLEX-GV</td><td>Millipore</td><td>ML481051</td><td></td></tr><tr><td>SP8 AOBS konfokales Laserscanning Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Klimakammer für Temperatur- und CO2 (Life Imaging Services)</td></tr><tr><td colspan="4">Legende: IF, Immunfluoreszenz; WB, Western Blot</td></tr></tbody></table>

eine schnelle, skalierbare methode für die isolierung, funktionelle untersuchung und analyse von zellen abgeleiteten extrazellulärmatrix

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Die extrazelluläre Matrix (ECM) wird als eine vielfältige, dynamische und komplexe Umgebung anerkannt, die an mehreren zellphysiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. Die Isolierung von EZM aus Geweben oder Zellkulturen wird jedoch durch die unlösliche und vernetzte Natur der assemblierten EZM und durch die potenzielle Kontamination von EZM-Extrakten mit Zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung mit kultivierten Zellen, mit der Zellen schnell und zuverlässig entnommen werden können, um eine aus Zellen gewonnene EZM für nachgelagerte Experimente zu isolieren.
Durch die Verwendung dieser Methode können die isolierte EZM und ihre Komponenten durch in situ Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Dynamik spezifischer EZM-Proteine kann verfolgt werden, indem die Ablagerung eines markierten Proteins mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sowohl vor als auch nach der Entnahme von Zellen verfolgt wird. Alternativ kann die isolierte EZM für biochemische Analysen, wie z. B. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunblotting, extrahiert werden. Auf größeren Skalen kann eine vollständige Proteomik-Analyse der isolierten EZM mittels Massenspektrometrie durchgeführt werden. Durch die Durchführung der EZM-Isolierung unter sterilen Bedingungen können sterile EZM-Schichten für funktionelle oder phänotypische Studien mit jeder interessierenden Zelle gewonnen werden. Die Methode kann auf jeden adhärenten Zelltyp angewendet werden, ist relativ einfach durchzuführen und kann mit einem breiten Repertoire an experimentellen Designs verknüpft werden.

Das Protokoll, beschrieben in den Schritten 1,1-1,5 wirkt Zellen zu entfernen, und hinter der Zelle stamm ECM verlassen. Das Protokoll wurde auf COS-7-Zellen durchgeführt wird für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet und die Zellen stamm ECM wurde durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Ammoniumhydroxid - Behandlung entfernt , die Zellen wirkungsvoll , da durch den Verlust der Zellkerne und Aktin - Zytoskelett etabliert nach DAPI und Phalloidin - Färbung, bzw. (Abbildung 1). Die Extraktion der Zellen mit 2 M Harnstoff war nicht so wirksam wie Ammoniumhydroxid; Spuren von DAPI und Phalloidin-Färbung wurden nach der Behandlung festgestellt. 8 M Harnstoff hatte eine ähnliche Wirkung wie Ammoniumhydroxid (Abbildung 1). Als nächstes Zellen abgeleiteten ECM vor und nach der Behandlung Ammoniumhydroxid visualisiert wurde (Schritte von 2,1 bis 2,11). COS-7 - Zellen wurden mit einem monomeren rot fluoreszierendes Protein transfiziert (mRFP) -markierte Thrombospondin-1 C-terminalen Trimer (mRFPovTSP1C) 11 und auf einer 35 - mm - Schale mit einem gerasterten Glasbasis gewachsen. Zwei Stunden nach der Plattierung, ein geeignetes Planquadrat, das mehrere gesunde Zellen enthielt exprimieren mRFPovTSP1C wurde unter einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Ein Referenzphasenkontrastbild wurde dieser Bereich genommen, und dann Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung wurde alle 1 min für 2 h (2A) durchgeführt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das gleiche Gitterquadrat in der Schale wurde unter Phasenkontrast verlagert und dann durch Fluoreszenzmikroskopie erneut analysiert. Die Zellen waren nicht mehr in der Planquadrat, aber mRFPovTSP1C blieb innerhalb des ECM, durch Fluoreszenzmikroskopie als charakteristische puncta (2A) nachgewiesen. Jede mRFPovTSP1C in der ECM Entfernung vor der Zelle abgelagert wurde durch Vergleich der Fluoreszenzmuster prä- identifiziert und post-Entfernung von Zellen. Die fluoreszierende puncta in beiden Bildern identifiziert (Figure 2A, beispielsweise Pfeile) sind geschlossen mit dem ECM verbunden zu sein. Ammoniumhydroxid Behandlung wurde dann aus kultivierten, anhaftenden Zellen zu isolieren nativen ECM verwendet. Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden für 96 h auf Glasdeckgläschen gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entfernt, und das ECM wurde mit einem anti-Kollagen - I - Antikörper sondiert, die eine charakteristische fibrilläre und meshwork Färbemuster zeigten 16 (2B). Fibronectin Strukturieren wurde um feste, nicht-permeabilisierten Zellen , Ratte Chondrosarkom (RCS) und innerhalb des ECM nach der Entfernung der RCS - Zellen (2C) untersucht. Das Ammoniumhydroxid Isolierung von ECM wurde ebenfalls unter sterilen Bedingungen durchgeführt, so daß &quot;test&quot; Zellen auf die ECM für phänotypischen oder funktionellen Studien wieder ausplattiert werden konnten. Zum Beispiel, &quot;test&quot; COS-7-Zellen wurden für 2 h auf sterilem ECM plattierten von RCS-Zellen produziert, und then sie wurden fixiert, permeabilisiert, und F-Actin - Organisation von FITC-Phalloidin - Färbung im Vergleich zu COS-7 - Zellen analysiert , um ihre eigenen ECM Herstellung (Schritte 3,1-3,9) (Abbildung 3). Bei einem größeren Maßstab wurde das Verfahren verwendet ECM für biochemische Verfahren zu isolieren. Zum Beispiel wurden RCS-Zellen auf zwei 100 mm-Zellkulturschalen gezüchtet für 7 Tage, und die Prozeduren in Schritten von 4,1 bis 4,7 wurden befolgt. Proteine ​​in der Zelle stamm ECM wurden gesammelt, indem sie in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer Abkratzen und wurden durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen getrennt. Das Gel wurde Protein - gefärbt, und die vier Hauptbanden wurden jeweils isoliert und durch Massenspektrometrie (4A) analysiert. Eine Reihe von ECM - Proteinen, einschließlich Fibronectin, Thrombospondin 1 (TSP1), Thrombospondin 5 / Cartilage Oligomeric Matrix Protein (TSP5 / COMP) und Matrilin-1 identifiziert wurden (4B). Alternativ kleinere Präparate von ECM kann durch Immunoblots ausgewertet werden. Beispielsweise Zellen abgeleiteten ECM von COS-7 - Zellen ektopisch exprimieren mRFPovTSP1C durch SDS-PAGE, auf eine PVDF - Membran und sondiert für RFP mit einem Anti-Antikörper , RFP (4C) getrennt. Diese Technik ist empfindlich genug , um Unterschiede zwischen einem nativen Trimer von TSP1 (mRFPovTSP1C) und ein angelegtes Pentamer des TSP1 C-terminalen Region (mRFP-TSP-5-1C) 17 (4C) in der Abscheidung zu erkennen. Um das endogene ECM von HDF, das Vorhandensein von spezifischen Proteinen in Zelllysat oder dem isolierten ECM untersuchen wurde durch Immunoblotting untersucht. Die charakteristische ECM Proteine Fibronektin und Thrombospondin-1 wurden in der ECM festgestellt, während die intrazelluläre Proteine reichlich α-Tubulin und β-Aktin aus dem isolierten ECM (4D) nicht anwesend sind. Abbildung 1: Vergleich der Methoden der Zellentnahme. COS-7-Zellen wurden für 96 h auf Deckgläsern mit hoher Dichte gezüchtet, in 2% PFA fixiert und in 0,5% Triton X100 permeabilisiert oder behandelt wurden, wie für die Zellentfernung angegeben. Deckgläser wurden dann mit FITC-Phalloidin gefärbt F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren. Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m. Diese Zahl wird im Journal of Cell Science 11 von einer ursprünglichen Veröffentlichung geändert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig2.jpg" /> Abbildung 2: Identifizierung von ECM - Proteine in isolierten ECM. (A) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder vonCOS-7-Zellen mRFPovTSP1C und aufgewachsen auf einer 35-mm-Schale mit einem Glasboden, gridded Basis für 2 h zum Ausdruck. Bilder vor und nach der Entfernung der Zellen durch Ammoniumhydroxid gezeigt. Die Kante des Gitters Buchstabe wird in der Phasenkontrast-Bilder mit einer gestrichelten Linie angedeutet. Weiße Pfeile zeigen Beispiele für fluoreszierende puncta, die vor und nach der Zellentnahme vorhanden waren. (B) Nachweis von Kollagen I in HDF ECM durch indirekte Immunofluoreszenz. HDF wurden für 96 h entfernt und mit Ammoniumhydroxid gezüchtet und der ECM wurde für menschliche fibrillärem Kollagen I. gefärbt, um die ECM auch allein mit FITC-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper gefärbt wurde. (C) Lokalisierung von Fibronektin rund RCS - Zellen oder in isolierten RCS ECM, wie durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. RCS-Zellen wurden für 48 h, fixiert in 2% PFA, und gefärbt für Fibronektin und mit DAPI gezüchtet. Parallel Gerichte wurden die Zellen mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt und der ECM wurde fibr gefärbtenonectin und mit DAPI. Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-Maus-IgG-Antikörper allein gefärbt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Verwendung von sterilem ECM für funktionelle Studien. RCS &quot;Matrix Produzent&quot; Zellen wurden für 48 h auf Glasplättchen gezüchtet und dann mit 20 mM Ammoniumhydroxid unter sterilen Bedingungen behandelt, um die Zellen zu entfernen. COS-7 &quot;test&quot; Zellen wurden 2 h auf Deckgläsern mit oder ohne isoliert RCS ECM überzogen, in 2% PFA fixiert, in 0,5% Triton X100 permeabilisiert, und gefärbt mit FITC-Phalloidin F-Actin und DAPI sichtbar zu machen Kerne zu visualisieren . COS-7 auf RCS ECM plattierten Zellen verteilt umfangreicher und bildeten große microfilament Bündel (Beispiel siehe Pfeil) und Rand ruffles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55051/55051fig4.jpg" /> Abbildung 4: Identifizierung von Proteinen aus isolierter ECM durch SDS-PAGE, Massenspektrometrie oder Immunoblotting. (A) wurden RCS - Zellen für 7 Tage wachsen gelassen und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt werden ; das ECM wurde in heißer SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT abgekratzt. Die ECM-Präparat wurde unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel getrennt. Vier signifikante Banden (Pfeile 1-4) wurden durch Proteinfärbung identifiziert. (B) Proteine , die von RCS ECM Banden 1-4 wurden durch MALDI - Massenspektrometrie identifiziert. (C) COS-7 - Zellen, die entweder mRFPovTSP1C (Trimer) oder mRFP-TSP-5-1C (Pentamer) für 48 kultiviert wurden ,h und mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt, und das war ECM isoliert in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 100 mM DTT. Die ECM-Präparation wurde durch SDS-PAGE auf einem 7% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit einem anti-RFP-Antikörper sondiert. Diese Platte wird von einer ursprünglichen Veröffentlichung in Bioscience Reports geändert 17. (D) HDF wurden für 96 h gezüchtet und dann entweder mit 2% Desoxycholsäure in PBS (Zelllysat) oder mit 20 mM Ammoniumhydroxid Zellen zu entfernen. Das ECM wurde geschabt in heißes SDS-PAGE-Probenpuffer. Die beiden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 10% Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und mit Antikörpern sondiert, wie angegeben. In jeder Platte sind die Positionen der Molekulargewichtsmarker in kDa angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55051/55051fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieses fi anzuzeigen</a>Abbildung.

Die extrazelluläre Matrix spielt eine wichtige Rolle bei der Definition der Mikroumgebung von Zellen und bei der Modulation des Zellverhaltens und des Phänotyps. Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung zelleigener extrazellulärer Matrix, die für mikroskopische, biochemische, proteomische oder funktionelle Studien an verschiedene Skalen angepasst werden kann.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Matrix aus kultivierten Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Experimenten zu isolieren, um Funktionen und Eigenschaften der extrazellulären Matrix in normalen Geweben und Krankheitsprozessen zu verstehen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der extrazellulären Matrix zu beantworten, wie z.B. die Organisation, die molekulare Zusammensetzung, Proteininteraktionen oder die funktionellen Eigenschaften der extrazellulären Matrix. Auch die extrazelluläre Matrix könnte aus jedem adhärenten Zelltyp hergestellt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in verschiedenen Maßstäben durchgeführt werden können, um Zellen effizient zu entfernen und extrazelluläre Matrixproteine zurückzuhalten. Silvia Rosini, eine Doktorandin in meinem Labor, und Andrew Hellewell, ein Postdoktorand, werden das Verfahren demonstrieren. Zu Beginn werden Plattenzellen auf Deckgläsern für die Bildgebung von lebenden Zellen und extrazellulärer Matrix oder EZM verwendet.Für Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen ist eine fixierte EZM. Oder zur Vorbereitung von zellbasierter EZM für kleine funktionelle Studien. Inkubieren Sie die Zellen bei einer angemessenen Temperatur und Luftfeuchtigkeit, damit die Zellen eine geeignete Zeit haben, um die EZM abzulagern.In der Regel länger als 16 Stunden. In einer Extraktionshaube werden 20 Millimolare Ammoniumhydroxid in einem geeigneten Gefäß hergestellt, indem die Stammlösung mit entionisiertem Wasser eins bis 14 verdünnt wird. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie vorsichtig das Nährmedium.Fügen Sie dann PBS ohne Kalzium oder Magnesium hinzu, indem Sie es vorsichtig gegen die Wand der Schüssel gießen. Schütteln Sie die Schüssel zweimal und gießen Sie die Flüssigkeit weg. Wiederholen Sie dann die Wäsche noch zwei weitere Male.Entfernen Sie in der Dunstabzugshaube die letzte PBS-Wäsche, fügen Sie 1,5 Milliliter Ammoniumhydroxid pro 60-Millimeter-Schale hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Rühren Sie das Geschirr jede Minute sanft um, um die Lyse aller Zellen zu gewährleisten. Geben Sie als Nächstes reichlich deionisiertes Wasser in jede Schüssel und rocken Sie den Teller.Gießen Sie dann das gelöste Ammoniumhydroxid-Material weg, das aus Ammoniumhydroxid, lysierten Zellen und deionisiertem Wasser besteht. Waschen Sie die unlösliche ECM-Schicht noch viermal in reichlich deionisiertem Wasser, um die vollständige Entfernung des gesamten gelösten Ammoniumhydroxids zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Zellen durch reichliches Waschen in entionisiertem Wasser vollständig entfernt werden.Wenn diese Schritte nicht angemessen durchgeführt werden, kann zelluläres Material auf der Schale verbleiben und die nachgelagerte Analyse kontaminieren. Für die Untersuchung der EZM durch Immunfluoreszenz entfernen Sie das restliche deionisierte Wasser, fixieren Sie die EZM durch Zugabe von 2%-Paraformaldehyd, abgekürzt PFA, und inkubieren Sie die Schalen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie PBS, um jede fixe Probe zweimal zu waschen, und entsorgen Sie die Lösung in einem Behälter für flüssige Abfälle, bevor Sie die Fluoreszenzmikroskopie gemäß dem Textprotokoll durchführen.Bereiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube sterile Lösungen aus PBS ohne Calcium und Magnesium, 20 Millimolar Ammoniumhydroxid und deionisiertem Wasser vor, indem Sie jede Lösung durch einen sterilen 0,2-Mikrometer-Filter in einen geeigneten sterilen Behälter leiten. Verwenden Sie unter Beibehaltung der sterilen Technik steriles PBS, um die Matrix-Produzentenzellen auf Deckgläsern dreimal sanft zu waschen. Nachdem Sie die letzte PBS-Wäsche entfernt haben, geben Sie 1,5 Milliliter steriles Ammoniumhydroxid in die 60-Millimeter-Schale und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter intermittierendem Schaukeln.Geben Sie reichlich steriles deionisiertes Wasser in die Schüssel mit Schaukeln und gießen Sie das Zelllysat in einen geeigneten Abfallbehälter. Wiederholen Sie diese Wäsche noch viermal, um die vollständige Entfernung des gelösten Materials sicherzustellen. Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll trypsinisiert und pelletiert haben, resuspendieren Sie die Testzellen in frischem sterilem Medium und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.Plattieren Sie dann die entsprechende Anzahl von Testzellen und Kulturmedium auf das steril isolierte ECM auf Deckgläsern und inkubieren Sie es zwei bis drei Stunden lang oder für die erforderliche Zeit. Um die Organisation des Aktin-Zytoskeletts zu untersuchen, fixieren Sie die Testzellen in 2%PFA und färben Sie sie mit FITC-Phalloidin, um das F-Aktin sichtbar zu machen, und DAPI, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Nachdem Sie eine große Anzahl von Zellen kultiviert, die Zellen entfernt und die EZM gewaschen haben, wie weiter oben im Video gezeigt, kippen Sie jede Platte in einem Winkel, um das Restwasser auf den Boden der Schale abzulassen, und entfernen Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig das restliche Wasser, bis die Platte vollständig trocken ist.Gleichzeitig wird der SDS-PAGE-Probenpuffer mit 100 Millimolar DDT zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzt und jede 100-Millimeter-Platte, die mit einem Immunoblot untersucht werden soll, um 200 Mikroliter hinzuzufügen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Probe auf einer Seite der Schale zu sammeln, und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um sie in ein Röhrchen zu übertragen. Um die EZM mittels Massenspektrometrie zu analysieren, bereiten Sie eine konzentriertere Probe vor, indem Sie den SDS-PAGE-Probenpuffer aus der Schale sammeln, ihn erneut auf 95 Grad Celsius erhitzen und dasselbe Aliquot auf zwei bis drei zusätzlichen Platten verwenden.Übertragen Sie alle verbleibenden SDS-PAGE-Probenpufferextrakte aus der Spitze des Zellschabers in das Röhrchen, um den Verlust von ECM-Material zu minimieren. Für eine effektive Extraktion des isolierten ECM in den SDS-PAGE-Probenpuffer ist es unerlässlich, dass der Probenpuffer auf 95 Grad erhitzt wird, ein Reduktionsmittel enthält und die Platte ausgiebig abgeschabt wird. Hier sind COS-7-Zellen zu sehen, die auf gläsernen Deckgläsern gezüchtet wurden.Die Behandlung mit Ammoniumhydroxid entfernte die Zellen effektiv, was durch den Verlust der Zellkerne und des Aktin-Zytoskeletts festgestellt wurde. In dieser Abbildung wurden COS-7-Zellen mit RFP-Tag Thrombospondin-1 transfiziert. Und die ECM wurde vor und nach der Ammoniumhydroxid-Behandlung visualisiert.Es wird vermutet, dass die in beiden Bildern identifizierten fluoreszierenden Punkte mit der EZM assoziiert sind. In diesem Experiment wurden humane dermale Fibroblasten mit Ammoniumhydroxid entfernt und die EZM mit einem Anti-Kollagen-1-Antikörper untersucht, der ein charakteristisches Fibula- und Meshwork-Färbemuster aufwies. Wie hier gezeigt, wurde die Fibronektin-Färbung an der EZM aus Ammoniumhydroxid-extrahierten Chondrosarkomzellen der Ratte durchgeführt.In diesem Beispiel wurden Test-COS-7-Zellen zwei Stunden lang auf steriles ECM plattiert, das von RCS-Zellen produziert wurde, und durch FITC-Phalloidin-Färbung auf F-Aktin-Organisation analysiert. Im Vergleich zu COS-7-Zellen, die ihre eigene EZM produzieren. In diesem Experiment wurde die EZM aus Chondrosarkomzellen der Ratte isoliert und die von der EZM abgeleiteten Proteine wurden dann mittels SDS-PAGE getrennt.Und die vier Hauptbanden wurden isoliert und mittels Massenspektrometrie analysiert. Fibronektin, Thrombospondin-1 und -5 sowie Matrilin-1 wurden identifiziert. Schließlich wurde die endogene EZM humaner dermaler Fibroblasten mittels Immunblotting analysiert.Fibronektin und Thrombospondin-1 wurden nachgewiesen, während die intrazellulären Proteine Alpha-Tubulin und Beta-Aktin nicht vorhanden waren. Einmal gemeistert, kann die Entnahme von Zellen mit Ammoniumhydroxid und die Extraktion von ECM mit heißem SDS-PAGE-Probenpuffer aus drei 100-Millimeter-Schalen in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jedes Mal frische Ammoniumhydroxid-Arbeitslösungen herzustellen, um die Zellen zu entfernen.Es ist auch sehr wichtig, ausgiebig mit deionisiertem Wasser zu waschen, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie die Proteomik-Analyse von extrahierter EZM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. eine relative Häufigkeit von EZM-Proteinen, die von verschiedenen Zelltypen produziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen effizient aus Zellkulturschalen entnimmt und wie man ECM extrahiert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer Dunstabzugshaube und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.

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Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

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Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

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Wir beschreiben die Isolierung der kardialen extrazellulären Matrix von C57Bl/6J-Kontrollmäusen, Enghautmäusen und Engerhautmäusen, die mit dem IRF5-Hemmpeptid behandelt wurden. Wir beschreiben auch die Vasodilatationsstudien an den isolierten Gefäßen von C57Bl/6J, Engehautmäusen und Engerhautmäusen, die mit dem IRF5-inhibitorischen Peptid behandelt wurden.

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Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix (Video) | JoVE Journal

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

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