Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Matrix aus kultivierten Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Experimenten zu isolieren, um Funktionen und Eigenschaften der extrazellulären Matrix in normalen Geweben und Krankheitsprozessen zu verstehen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der extrazellulären Matrix zu beantworten, wie z.B. die Organisation, die molekulare Zusammensetzung, Proteininteraktionen oder die funktionellen Eigenschaften der extrazellulären Matrix. Auch die extrazelluläre Matrix könnte aus jedem adhärenten Zelltyp hergestellt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in verschiedenen Maßstäben durchgeführt werden können, um Zellen effizient zu entfernen und extrazelluläre Matrixproteine zurückzuhalten. Silvia Rosini, eine Doktorandin in meinem Labor, und Andrew Hellewell, ein Postdoktorand, werden das Verfahren demonstrieren. Zu Beginn werden Plattenzellen auf Deckgläsern für die Bildgebung von lebenden Zellen und extrazellulärer Matrix oder EZM verwendet.

Für Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen ist eine fixierte EZM. Oder zur Vorbereitung von zellbasierter EZM für kleine funktionelle Studien. Inkubieren Sie die Zellen bei einer angemessenen Temperatur und Luftfeuchtigkeit, damit die Zellen eine geeignete Zeit haben, um die EZM abzulagern.

In der Regel länger als 16 Stunden. In einer Extraktionshaube werden 20 Millimolare Ammoniumhydroxid in einem geeigneten Gefäß hergestellt, indem die Stammlösung mit entionisiertem Wasser eins bis 14 verdünnt wird. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie vorsichtig das Nährmedium.

Fügen Sie dann PBS ohne Kalzium oder Magnesium hinzu, indem Sie es vorsichtig gegen die Wand der Schüssel gießen. Schütteln Sie die Schüssel zweimal und gießen Sie die Flüssigkeit weg. Wiederholen Sie dann die Wäsche noch zwei weitere Male.

Entfernen Sie in der Dunstabzugshaube die letzte PBS-Wäsche, fügen Sie 1,5 Milliliter Ammoniumhydroxid pro 60-Millimeter-Schale hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Rühren Sie das Geschirr jede Minute sanft um, um die Lyse aller Zellen zu gewährleisten. Geben Sie als Nächstes reichlich deionisiertes Wasser in jede Schüssel und rocken Sie den Teller.

Gießen Sie dann das gelöste Ammoniumhydroxid-Material weg, das aus Ammoniumhydroxid, lysierten Zellen und deionisiertem Wasser besteht. Waschen Sie die unlösliche ECM-Schicht noch viermal in reichlich deionisiertem Wasser, um die vollständige Entfernung des gesamten gelösten Ammoniumhydroxids zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Zellen durch reichliches Waschen in entionisiertem Wasser vollständig entfernt werden.

Wenn diese Schritte nicht angemessen durchgeführt werden, kann zelluläres Material auf der Schale verbleiben und die nachgelagerte Analyse kontaminieren. Für die Untersuchung der EZM durch Immunfluoreszenz entfernen Sie das restliche deionisierte Wasser, fixieren Sie die EZM durch Zugabe von 2%-Paraformaldehyd, abgekürzt PFA, und inkubieren Sie die Schalen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie PBS, um jede fixe Probe zweimal zu waschen, und entsorgen Sie die Lösung in einem Behälter für flüssige Abfälle, bevor Sie die Fluoreszenzmikroskopie gemäß dem Textprotokoll durchführen.

Bereiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube sterile Lösungen aus PBS ohne Calcium und Magnesium, 20 Millimolar Ammoniumhydroxid und deionisiertem Wasser vor, indem Sie jede Lösung durch einen sterilen 0,2-Mikrometer-Filter in einen geeigneten sterilen Behälter leiten. Verwenden Sie unter Beibehaltung der sterilen Technik steriles PBS, um die Matrix-Produzentenzellen auf Deckgläsern dreimal sanft zu waschen. Nachdem Sie die letzte PBS-Wäsche entfernt haben, geben Sie 1,5 Milliliter steriles Ammoniumhydroxid in die 60-Millimeter-Schale und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter intermittierendem Schaukeln.

Geben Sie reichlich steriles deionisiertes Wasser in die Schüssel mit Schaukeln und gießen Sie das Zelllysat in einen geeigneten Abfallbehälter. Wiederholen Sie diese Wäsche noch viermal, um die vollständige Entfernung des gelösten Materials sicherzustellen. Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll trypsinisiert und pelletiert haben, resuspendieren Sie die Testzellen in frischem sterilem Medium und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.

Plattieren Sie dann die entsprechende Anzahl von Testzellen und Kulturmedium auf das steril isolierte ECM auf Deckgläsern und inkubieren Sie es zwei bis drei Stunden lang oder für die erforderliche Zeit. Um die Organisation des Aktin-Zytoskeletts zu untersuchen, fixieren Sie die Testzellen in 2%PFA und färben Sie sie mit FITC-Phalloidin, um das F-Aktin sichtbar zu machen, und DAPI, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Nachdem Sie eine große Anzahl von Zellen kultiviert, die Zellen entfernt und die EZM gewaschen haben, wie weiter oben im Video gezeigt, kippen Sie jede Platte in einem Winkel, um das Restwasser auf den Boden der Schale abzulassen, und entfernen Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig das restliche Wasser, bis die Platte vollständig trocken ist.

Gleichzeitig wird der SDS-PAGE-Probenpuffer mit 100 Millimolar DDT zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzt und jede 100-Millimeter-Platte, die mit einem Immunoblot untersucht werden soll, um 200 Mikroliter hinzuzufügen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Probe auf einer Seite der Schale zu sammeln, und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um sie in ein Röhrchen zu übertragen. Um die EZM mittels Massenspektrometrie zu analysieren, bereiten Sie eine konzentriertere Probe vor, indem Sie den SDS-PAGE-Probenpuffer aus der Schale sammeln, ihn erneut auf 95 Grad Celsius erhitzen und dasselbe Aliquot auf zwei bis drei zusätzlichen Platten verwenden.

Übertragen Sie alle verbleibenden SDS-PAGE-Probenpufferextrakte aus der Spitze des Zellschabers in das Röhrchen, um den Verlust von ECM-Material zu minimieren. Für eine effektive Extraktion des isolierten ECM in den SDS-PAGE-Probenpuffer ist es unerlässlich, dass der Probenpuffer auf 95 Grad erhitzt wird, ein Reduktionsmittel enthält und die Platte ausgiebig abgeschabt wird. Hier sind COS-7-Zellen zu sehen, die auf gläsernen Deckgläsern gezüchtet wurden.

Die Behandlung mit Ammoniumhydroxid entfernte die Zellen effektiv, was durch den Verlust der Zellkerne und des Aktin-Zytoskeletts festgestellt wurde. In dieser Abbildung wurden COS-7-Zellen mit RFP-Tag Thrombospondin-1 transfiziert. Und die ECM wurde vor und nach der Ammoniumhydroxid-Behandlung visualisiert.

Es wird vermutet, dass die in beiden Bildern identifizierten fluoreszierenden Punkte mit der EZM assoziiert sind. In diesem Experiment wurden humane dermale Fibroblasten mit Ammoniumhydroxid entfernt und die EZM mit einem Anti-Kollagen-1-Antikörper untersucht, der ein charakteristisches Fibula- und Meshwork-Färbemuster aufwies. Wie hier gezeigt, wurde die Fibronektin-Färbung an der EZM aus Ammoniumhydroxid-extrahierten Chondrosarkomzellen der Ratte durchgeführt.

In diesem Beispiel wurden Test-COS-7-Zellen zwei Stunden lang auf steriles ECM plattiert, das von RCS-Zellen produziert wurde, und durch FITC-Phalloidin-Färbung auf F-Aktin-Organisation analysiert. Im Vergleich zu COS-7-Zellen, die ihre eigene EZM produzieren. In diesem Experiment wurde die EZM aus Chondrosarkomzellen der Ratte isoliert und die von der EZM abgeleiteten Proteine wurden dann mittels SDS-PAGE getrennt.

Und die vier Hauptbanden wurden isoliert und mittels Massenspektrometrie analysiert. Fibronektin, Thrombospondin-1 und -5 sowie Matrilin-1 wurden identifiziert. Schließlich wurde die endogene EZM humaner dermaler Fibroblasten mittels Immunblotting analysiert.

Fibronektin und Thrombospondin-1 wurden nachgewiesen, während die intrazellulären Proteine Alpha-Tubulin und Beta-Aktin nicht vorhanden waren. Einmal gemeistert, kann die Entnahme von Zellen mit Ammoniumhydroxid und die Extraktion von ECM mit heißem SDS-PAGE-Probenpuffer aus drei 100-Millimeter-Schalen in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jedes Mal frische Ammoniumhydroxid-Arbeitslösungen herzustellen, um die Zellen zu entfernen.

Es ist auch sehr wichtig, ausgiebig mit deionisiertem Wasser zu waschen, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie die Proteomik-Analyse von extrahierter EZM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. eine relative Häufigkeit von EZM-Proteinen, die von verschiedenen Zelltypen produziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen effizient aus Zellkulturschalen entnimmt und wie man ECM extrahiert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer Dunstabzugshaube und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.