ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

Das übergeordnete Ziel der Verwendung eines GFP-markierten Konstrukts besteht darin, die Identität eines bisher unbekannten Proteins mit dem GFP als Handle zu bestätigen. Diese Methode kann bei der funktionellen Identifizierung von Orphan-Genen helfen, wenn eine bestimmte Enzymaktivität nicht zur Bestätigung zur Verfügung steht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das GPF-Tag es ermöglicht, das gleiche Konstrukt für mehrere Arten von Experimenten zu verwenden.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Transfektion nicht immer zur Expression des starken Konstrukts führt und die Zellen nicht immer wiederbelebt werden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir begannen, die Schwierigkeiten zu erkennen, ein Protein nur mit Antikörpern zu identifizieren, die dagegen gebildet wurden. Beginnen Sie damit, die interessierenden Zellen in einem Milliliter HEPES-gepuffertem Kochsalzlösungs-Elektroporationspuffer zu resuspendieren und legen Sie die Zellen sofort auf Eis.

Geben Sie den Zellen ein ausreichendes Volumen an GFP-TMEM184A-markiertem Plasma, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter DNA zu erreichen, und überführen Sie etwa 0,4 Milliliter Zellen in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette. Elektropopolieren Sie die Zellen. Sehen Sie sich dann die transfizierten Zellen auf Gewebekulturschalen an und stellen Sie die Schalen für 24 bis 72 Stunden in einen Zellkultur-Inkubator.

Der Transfektionsschritt ist der kritischste Schritt des Verfahrens, da die meisten der verbleibenden experimentellen Arbeiten nicht effektiv abgeschlossen werden können, wenn die Zellen nicht lebensfähig sind und keine signifikanten Mengen des GFP-markierten Konstrukts exprimieren. Geben Sie zu einem geeigneten experimentellen Zeitpunkt 100 Mikrogramm pro Milliliter Rhodamin-Heparin in das GFP-Plasmid-exprimierende Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen lichtgeschützt, bis das gewünschte Färbeniveau erreicht ist, das durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde. Spülen Sie anschließend die Zellen mit PBS und einigen Sekunden leichtem Schütteln unter Lichtschutz, gefolgt von einer 15-minütigen Fixierung mit 4%igem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.

Um die GFP-markierte Rhodamin-Heparin-Co-Lokalisation zu beurteilen, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit der entsprechenden GFP- und Rhodamin-Anregung und verminderten Lasern, um mindestens 50 Zellen aus jedem separaten Markierungsexperiment abzubilden. Untersuchen Sie die Bilder in dem entsprechenden Bildanalyseprogramm, um den relativen Rhodamin-Befund und die Aufnahme in jeder Zelle zu bestimmen, indem Sie ein Freihandwerkzeug verwenden, um die Zellen in jedem Fluoreszenzbild zu umkreisen. Verwenden Sie das Messwerkzeug, um die Intensität innerhalb jedes eingekreisten Raums zu bestimmen, und exportieren Sie dann die Fluoreszenzintensitätsdaten in eine Tabelle, um die Fläche multipliziert mit der Intensität zu berechnen, wobei der Hintergrund für die gleiche Fläche für jede Zelle subtrahiert wird.

Die Fluoreszenz pro Zelle kann dann für alle Zellen gemittelt werden, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Um den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer von GFP TMEM184A zu Rhodamin-Heparin zu erleichtern, wurden zunächst fixierte GFP-TMEM184A transfizierten Rhodamin-Heparin-markierten Zellen auf Glasobjektträger. Stimulieren Sie die Zellen bei 405 Nanometern, um die Rhodamin-Emission abzubilden, gefolgt von einer Anregung von 488 Nanometern, um die GFP-Emission abzubilden.

Stimulieren Sie dann die Zellen bei 561 Nanometern für eine zweite Rhodamin-Emissionsbildgebung. Für die Lebendzellbildgebung der Rhodamin-Heparin-Aufnahme säen Sie eine 100-Milliliter-Konfluentenschalenkultur des GFP TMEM184A-transfizierten Zellen in 635-Millimeter-Lebendzell-Bildgebungsschalen, um Zellen in der Nähe der Konfluenz zu erhalten. Ersetzen Sie nach 48 Stunden den Überstand durch Kulturmedium ohne Phenolrot und geben Sie eine Schale mit Zellen in ein konfokales Mikroskop mit einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Erwärmungstisch.

Fokussieren Sie das Mikroskop und geben Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Rhodamin-Heparin durch sanftes Mischen in die Zellen. Beginnen Sie dann sofort mit der Aufnahme der Live-Bilder. Wenn im Sichtfeld keine Heparinaufnahme stattfindet, bewegen Sie die Schale leicht, um die Zellen mit mindestens einem grünen Vesikel zu identifizieren, das die Rhodamin-Markierung enthält.

Für die Beurteilung der Heparinbindung in vitro spülen Sie eine schwarze, mit Ativan beschichtete 96-Well-Platte und eine schwarze, unbeschichtete 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern 0,2 % CHAPS PBS Pro-Well für drei fünfminütige Wäschen unter Schütteln. Nach dem letzten Waschen 100 Mikroliter à 60 Picomole pro Vertiefung biotinyliertes Anti-GFP in dreifacher Ausfertigung in die Ativan-beschichtete Platte für jede GFP-Befundgruppe geben. Geben Sie anschließend nur Puffer in die Kontrollvertiefungen und versiegeln Sie alle Vertiefungen mit einer Plattenabdeckung für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln.

Am Ende der Inkubation waschen Sie alle Vertiefungen dreimal in CHAPS PBS, wie gerade gezeigt, und geben Sie 100 Mikroliter von fünf Nanomol GFP TMEM184A pro Vertiefung oder GFP allein in die entsprechenden Vertiefungen in der Ativan-beschichteten Platte. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln waschen Sie alle Vertiefungen mit frischem CHAPS PBS und geben Sie 100 Mikroliter jeder experimentellen Fluorescein-Heparin-Konzentration in dreifacher Ausfertigung in die entsprechende Testvertiefung auf die mit Ativan beschichtete Platte. Geben Sie die Konzentrationsstandards sowohl auf die mit Ativan beschichteten als auch auf die unbeschichteten Platten und inkubieren Sie beide Platten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln und vor Licht geschützt.

Verwenden Sie nun ein Platten-Reader, um die anfängliche Heparin-Fluoreszenz-Emission in den Kontroll-Wells beider Platten und die anfängliche Gesamtfluoreszenzemission aus den Wells mit dem immobilisierten GFP oder GFP-TMEM184A in der Ativan-beschichteten Platte aufzuzeichnen. Übertragen Sie dann das ungebundene fluoreszierende Heparin aus den Wells mit dem immobilisierten GFP TMEM184A oder GFP in die entsprechenden Wells in der unbeschichteten schwarzen Platte. Nach dem sofortigen Ablesen der Fluoreszenzemission auf der unbeschichteten schwarzen Platte geben Sie 100 Mikroliter frisches CHAPS PBS zurück in die Vertiefungen, aus denen das Fluorescein-Heparin entfernt wurde, und lesen Sie die Fluoreszenzemissionen für diese Vertiefungen ab, um die Fluoreszenzemission aus den entnommenen, ungebundenen Proben in der unbeschichteten Platte zu erhalten.

Wenn alle ungebundenen Messwerte erhalten wurden, verwenden Sie die gesamten Heparin-Emissionswerte, um zu bestätigen, dass die korrekten Heparinwerte zu jeder Vertiefung hinzugefügt wurden, indem Sie die durchschnittlichen Hintergrundmesswerte von den Werten subtrahieren. Erstellen Sie dann ein Diagramm der Emission im Vergleich zum gesamten hinzugefügten Fluorescein-Heparin, um das Ausmaß der Emission im Vergleich zur Heparinmenge zu bestimmen, und stellen Sie das korrigierte gebundene Heparin im Vergleich zum hinzugefügten Heparin für die Triplikate aus den GFP- und GFP-TMEM184A-Wells dar. Die Zeitspanne nach der Transfektion wirkt sich auf die Verteilung des GFP-TMEM184A aus, das sich über mindestens 72 Stunden anzusammeln scheint, wobei im Laufe der Zeit mehr GFP im paranukleären Bereich sichtbar ist.

Das Färbemuster von GFP in dieser repräsentativen vaskulären Zellkultur scheint dem eines Antikörpers, der gegen ein C-terminales Peptid erhoben wurde, am ähnlichsten zu sein, ein logisches Ergebnis, da sich das GFP am C-Terminus des Proteins befindet. Die Verwendung eines Fluorescein-Rhodamin-Heparin-Liganden kann auch für die Echtzeitbewertung der Co-Lokalisierung von Ligandenrezeptoren im Laufe der Zeit verwendet werden. Die Heparinaufnahme wird in GFP erhöht, TMEM184A transfizierte stabile Knockdown-Zellen zu konstruieren, was zu Zellen führt, die die Fähigkeit wiedererlangen können, Rhodamin-Heparin auf oder über dem Niveau von Wildtyp-Zellen zu internalisieren.

Unter Verwendung des demonstrierten Plasmid-kodierten GFP-Taktsystems zeigt das Anti-GFP-Antikörper-isolierte GFP-TMEM184A-Konstrukt eine spezifische satriple Heparin-Bindung, während das Kontroll-GFP kein Heparin bindet. Eine einfache Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern, wiederum GFP, kann auch Informationen über die GFP-Lokalisation liefern, basierend auf dem Antikörperzugang in nicht-permeabilisierten Zellen, was einen vorläufigen Beweis dafür liefert, dass das an der Plasmamembran exprimierte GFP extrazellulär ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik nach 24 bis 48 Stunden Kultur zu einem hervorragenden GFP-Konstrukt-Ausdruck führen.

Beim Versuch des Live-Imaging-Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen möglicherweise nicht die co-lokalisierte Aufnahme aufweisen, so dass es oft notwendig ist, andere Zellen zu untersuchen. Bindungsassays mit GFP-Liganden können durch Dimere oder Aggregate höherer Ordnung des GFP-Proteins erschwert werden, insbesondere wenn sie sich in Detergenzmizellen befinden. Insgesamt kann die Expression von GFP-markierten Proteinen eine Vielzahl von Experimenten ermöglichen, um die Identität eines bisher unbekannten Proteins zu bestätigen.