Name: ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie ein GFP-markierter TMEM184A-Konstrukt zur Bestätigung der Heparin-Rezeptor-Identität in vaskulären Zellen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Identifizierung von Orphan-Genen.

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Die Forschung im Lowe-Krentz-Labor wird durch Forschungszuschüsse unterstützt, die von den National Institutes of Health an LLK HL54269 wurden.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
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<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Protokolle , die hier berichtet wurden entwickelt 1 bestätigenden Beweis für die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor in vaskulären Zellen. Knockdown Techniken werden als ein Mechanismus zur Bestätigung der Identifizierung neuer Proteine ​​routinemäßig eingesetzt. Allerdings ist einige Funktionsverlust nach Zuschlags typischerweise nicht ausreichenden Nachweis, dass ein Kandidat Protein ist eigentlich die richtige Rezeptor (oder andere funktionelle Protein). Es ist auch wichtig...

Identifizierung von Kandidatenproteine ​​für neuartige Funktionen hängt oft von Affinität basierende Isolation Protokolle durch partielle Sequenzbestimmung gefolgt. Jüngste Beispiele für neu identifizierten Proteine sind Transmembranprotein 184A (TMEM184A), eine Heparin - Rezeptor identifiziert nach Heparin - Affinität Wechselwirkungen 1 und TgPH1, eine pleckstrin Homologie - Domäne - Protein , das Phosphoinositid PI (3,5) P 2 2 bindet. Andere neuartige Proteinidentifikation beinhaltet direkte Sequenzanalyse von Peptiden , wie sie von Vit, et al. die verwendeten Trans Peptide Proteinprodukte von bisher nicht charakterisierte Gene 3 zu erkennen. In ähnlicher Weise kann die Identifizierung neuer Proteinsequenzen erreicht werden Bioinformatik unter Verwendung von zuvor charakterisierten Proteinfamilien suchen, wie Identifizierung neuer 4TM Proteine 4. Die Prüfung der Aquaporinfamilie Gensequenzen hat also ergab die Identifizierung neuer Mitglieder mit neuen Funktionen 5. Nach der Identifizierung, Analyse der Proteinfunktion ist typischerweise ein nächster Schritt, die manchmal einen spezifischen Assay von Protein-Funktion, wie beispielsweise in dem Aquaporin Fall untersucht werden können. Wenn möglich, die Funktion eines neu identifizierte Protein kann mit spezifischen enzymatischen oder ähnlichen in vitro - Assays Funktion untersucht werden. Da viele Funktionen der neuen Proteine in komplexen Wechselwirkungen abhängen , die nur in intakten Zellen oder Organismen auftreten, in - vitro - Tests sind nicht immer wirksam. Jedoch müssen die in - vivo - Tests in der Weise ausgebildet sein , dass sie auf der Gensequenz abhängen. In Zellkultur und / oder einfachen Modellorganismen, kann Knockdown Nachweise für sorgen für die Protein / Funktion Identifizierung 6. Mit neuartigen Proteine ​​identifiziert, wie oben erwähnt, ist es oft nicht einfach ein Protein abreißen zu Funktion bestätigen, eind die Gestaltung der in vivo funktionelle Assays , die auf Gensequenz abhängen wird zur Charakterisierung von neuen Proteinen wichtig. Die kürzliche Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor (die Proliferation in der glatten Gefäßmuskulatur und Entzündungsreaktionen in Endothelzellen moduliert) unter Verwendung von Affinitätschromatographie und MALDI - MS - 1, 7 versehen , die Möglichkeit , eine Sammlung von Assays zu entwickeln , nach dem Zuschlags Ergebnisse erzielt , die mit der Identifizierung . Eine aktuelle Überprüfung bestätigt , dass Heparin spezifisch mit vielen Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung tritt, ihre Rezeptoren, extrazellulären Matrixkomponenten, Zelladhäsion Rezeptoren und anderen Proteinen 8. Im Gefäßsystem, Heparin und Heparansulfat - Proteoglykane (enthaltend Heparansulfatketten ähnlich in Struktur zu Heparin) interagieren mit mehreren hundert Proteine 9. Um funktionell bestätigen that TMEM184A wurde mit Heparin-Aufnahme beteiligt und Bindung, Techniken, die das Genkonstrukt für TMEM184A eingesetzt wurden entwickelt. Der vorliegende Bericht enthält eine Sammlung von Assays auf Basis eines GFP-TMEM184A zur Verwendung konstruieren in die Identität von TMEM184A als Heparin-Rezeptor bestätigt.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A Konstrukt</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Lichtempfindliches</td></tr><tr><td>Fluorescein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Lichtempfindliches</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA, methanolfrei)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, erhältlich über Fisher Scientific</td><td>PI28908 bei Fisher</td><td>Use in Fume Hood</td></tr><tr><td>Reacti-bind Neutravidin-Platten (Avidin-beschichtete schwarze 96-Well-Schalen)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, über Fisher Scientific</td><td>PI15510 bei Fisher</td><td>Achten Sie auf die Haltbarkeit</td></tr><tr><td>Schwarze 96-Well-Platten</td><td>Corning Life Sciences Plastic, gekauft über Fisher Scientific</td><td>064432 bei Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 vaskuläre glatte Muskelzellen Linie</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Kann in MEM-Medium1</td></tr><tr><td>BAOEC Rinder-Aorten-Endothelzellen</td> ausgetauscht werden <td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>Kultur, wie anfänglich empfohlen, kann zur Fortsetzung der Kultur in MEM-Medium ausgetauscht werden1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC glatte Bauchmuskelzellen der bovinen Aorta</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>Kultur, wie anfänglich empfohlen, kann in MEM-Medium ausgetauscht werden, um die Kultur fortzusetzen1</td></tr><tr><td>RAOEC Aorten-Endothelzellen der Ratte</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td><td>Kultur, wie ursprünglich empfohlen, kann in MEM-Medium ausgetauscht werden, um die Kultur fortzusetzen7</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, über Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete Kügelchen</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Erhältlich von Bio-Rad</td><td></td><td>Kann im Labor hergestellt werden. Der pH-Wert beträgt 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A Antikörper gegen den N-Terminus</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Einziger bekannter TMEM184A Antikörper gegen die N-terminale Region.</td></tr><tr><td>TMEM184A Antikörper gegen den C-Terminus</td><td>Gewonnen von ProSci Inc., Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci verwendet in Abbildung 1</td></tr><tr><td>GFP Antikörpern</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Verwendet in Abbildung 5</td></tr><tr><td>Sekundärantikörpern, markiert mit TRITC oder Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (Esel Anti-Kaninchen, TRITC) 715 165 150 (Esel Anti-Maus, Cy3)</td><td>Minimale Kreuzreaktivität zur Minimierung unspezifischer Fleckenbildung.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Erworben von Sigma</td><td>C5849</td><td>Bitte beachten Sie, dass diese Katalognummer nicht mehr hergestellt wird. Der Lieferant wird über den Ersatz informieren.</td></tr><tr><td>Live-Bildgebung 35-mm-Schüsseln</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta mit einer 63-fachen Öl-Immersionslinse</td><td>Wird für Bilder und Live-Aufnahmen in <stark>Bildern 1, 2 und 3</stark></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>C2+ konfokal mit einer 60-fachen Öl-Immersionslinse</td><td>Wird für Bilder in <stark>Abbildung 5</stark></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880 mit einer 63-fachen Öl-Immersionslinse</td><td>Wird für Bilder in Abbildung 2C</td></tr><tr><td>Elektroporationsgeräten</td><td>verwendet Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten</td><td>Erhältlich bei MidSci</td><td>EC2L</td><td>Kann auch vom Gerätelieferanten bezogen werden</td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro Plate Reader</td><td>Messwerte in der Mitte der Vertiefungen und nicht an der Oberfläche.</td></tr><tr><td>Computerprogramm zur Messung der Färbeintensität</td><td>Bild J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programm und Informationen sind online verfügbar</td><td>Jedes geeignete Programm kann verwendet werden. Weitere Informationen finden Sie https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html &nbsp;</td></tr><tr><td>Zellkultur-Trypsin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>als 10x-Lösung erworben</td></tr></tbody></table>

ein gfp-markierten tmem184a verwendung für die bestätigung der heparin-rezeptor identität construct

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Wenn neue Proteine ​​identifiziert werden durch Affinitäts-basierte Isolierung und Bioinformatik-Analyse, sind sie oft weitgehend uncharacterized. Antikörper, die gegen spezifische Peptide innerhalb der vorhergesagten Sequenz einige Lokalisierungs Experimente erlauben. Jedoch können auch andere mögliche Wechselwirkungen mit den Antikörpern oft nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Situation bot die Möglichkeit, eine Reihe von Tests, abhängig von der Proteinsequenz zu entwickeln. Insbesondere ist ein Konstrukt, das das Gen-Sequenz am C-terminalen Ende des Proteins an das GFP-codierende Sequenz gekoppelt enthielt, wurde für diese Zwecke gewonnen und eingesetzt. Experimente Lokalisierung, Ligandenaffinität zu charakterisieren, und die Verstärkung der Funktion wurden ursprünglich entworfen und ausgeführt , um die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor 1 bis bestätigen. Zusätzlich kann das Konstrukt für Studien Adressieren Membrantopologie Fragen und detaillierter Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden. Der vorliegende Bericht stellt arange der experimentellen Protokolle auf der Basis der GFP-Konstrukt TMEM184A in vaskulären Zellen exprimiert, die leicht für andere neue Proteine ​​angepasst werden könnte.

Während in der Theorie, die Transfektion von DNA in Zellen jeder konstruieren könnte mit lipophilen Transfektionsreagenzien durchgeführt werden, zeigen früheren Berichten effektiver Transfektion von GFP - Konstrukten in endothelial Elektroporation 12 unter Verwendung von Zellen. Das Protokoll hier bereitgestellt typischerweise erreicht GFP-Konstrukt die Expression in mehr als 80% der primären abgeleitete Endothelzellen und glatte Muskelzellen verwendet. Entwurf de...

Ein Konstrukt Codierung TMEM184A mit einem GFP-Tag am Carboxy-Terminus für eukaryotische Expressions entworfen wurde in Assays entwickelt, um zu bestätigen die Identifizierung von TMEM184A als Heparin-Rezeptor in vaskulären Zellen eingesetzt.

ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Das übergeordnete Ziel der Verwendung eines GFP-markierten Konstrukts besteht darin, die Identität eines bisher unbekannten Proteins mit dem GFP als Handle zu bestätigen. Diese Methode kann bei der funktionellen Identifizierung von Orphan-Genen helfen, wenn eine bestimmte Enzymaktivität nicht zur Bestätigung zur Verfügung steht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das GPF-Tag es ermöglicht, das gleiche Konstrukt für mehrere Arten von Experimenten zu verwenden.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Transfektion nicht immer zur Expression des starken Konstrukts führt und die Zellen nicht immer wiederbelebt werden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir begannen, die Schwierigkeiten zu erkennen, ein Protein nur mit Antikörpern zu identifizieren, die dagegen gebildet wurden. Beginnen Sie damit, die interessierenden Zellen in einem Milliliter HEPES-gepuffertem Kochsalzlösungs-Elektroporationspuffer zu resuspendieren und legen Sie die Zellen sofort auf Eis.Geben Sie den Zellen ein ausreichendes Volumen an GFP-TMEM184A-markiertem Plasma, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter DNA zu erreichen

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

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Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Kernige Hüllproteine spielen eine zentrale Rolle in vielen grundlegenden biologischen Prozessen und wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht.  Dieses Protokoll beschreibt ein neues Cre/Lox-basiertes Mausmodell, das die räumlich-zeitliche Kontrolle der Störung von LINC-Komplexen ermöglicht.

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