Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

Das übergeordnete Ziel des Präparierverfahrens ist es, die auditorische Bulla und die Kapsel zu isolieren, gefolgt von den einzelnen auditorischen Gehörknöchelchen von postnatalen Mäusen für verschiedene ganzheitliche und histologische Analysen. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Wundbiologie beantworten, wie z.B. Mechanismen einer schlechten Morphogenese, einer endochondralen Ossifikation oder eines schlechten Mineralstoffwechsels. Diese Methode basiert auf fundierten Kenntnissen der anatomischen Details.

Im Allgemeinen können Individuen, die die Maus als biologisches System noch nicht kennen, Schwierigkeiten haben, da ihr Wissen über das menschliche Mittelohr möglicherweise nicht auf das Gegenstück der Maus anwendbar ist. Das Verfahren wird von Ayako Sakamoto, einer Technikerin in meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie damit, die Gehörblase und die Kapsel mit dem umgebenden Schädelknochen in eine Probenschale zu legen, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 bei Raumtemperatur enthält.

Identifizieren Sie unter einem binokularen Präpariermikroskop die Schädelknochen, die die Hörkapsel umgeben, wie hier gezeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den umgebenden Schädel zu greifen, und eine zweite Garnitur, um das Basisphenoid und das Hinterhauptbein wegzuziehen. Ziehen Sie dann mit der Pinzette die interparietalen und parietalen Knochen vorsichtig von der Kapsel weg und entfernen sie, wenn sie vollständig gelöst sind.

Ziehen Sie dann das Plattenepitali von der Bulla und der Kapsel weg und ziehen Sie den Knochen und die Weichteile vorsichtig weg. Fassen Sie als Nächstes das Außenohr und drehen Sie die Probe um, um die mediale Seite freizulegen. Drehen Sie dann die Probe um 180 Grad, fassen Sie die Kapsel und ziehen Sie die restlichen Weichteile weg.

Der Rückenkamm ist nun sichtbar. In diesem Winkel sind der Nervus facialis und der Nervus vestibulo-cochlearis im auditorischen Gehörgang, in der Fossa subarcuatus und im vorderen Bogengang deutlich sichtbar. Wenn der Rückenkamm zum Boden der Präparierschale hin abgewinkelt ist, ist die Gehörblase deutlich zu sehen.

Ist das Präparat leicht abgewinkelt, so ist der Malleus innerhalb der Bulla sichtbar. Beginnen Sie damit, den äußeren Gehörgang oberhalb des Malleus und lateral des Sulcus tympanicus mit einer Pinzette zu brechen. Erstellen Sie eine zweite Faktur vor der ersten.

Entfernen Sie dann das Stück des äußeren Gehörgangs, so dass das Trommelfell sichtbar ist. Als nächstes entfernen Sie einen Teil des Trommelfells und des Paukenbeins in der Nähe des Processus brevis mallealis sowohl an der ventralen als auch an der hinteren Wand. Der Malleus, der Incus, der Steigbügel und der Musculus tensor tympani sollten nun freigelegt werden.

Hebe den Malleus an und schneide den Musculus tensor tympani mit der abgeschrägten Kante einer 27-Gauge-Nadel ab. Beachten Sie, dass das Manubrium fest mit dem Trommelfell verbunden ist, wie es bei anderen Säugetieren der Fall ist. Den Malleus aus dem Incus am Gehörknöchelchen ausrenken, indem der vordere Fortsatz des Malleus an der Goniale frakturiert wird.

Isolieren Sie den Malleus mit einer Pinzette von der Gehörblase. Entfernen Sie den größten Teil der Gehörblase, um den Incus und den Steigbügel freizulegen. Schneiden Sie dann mit der abgeschrägten Kante einer 27-Gauge-Nadel das hintere Band des Incus an der kurzen Kuppe ab.

Isolieren Sie den Incus mit einer Pinzette. Schneide die Steigbügelarterie in der Nähe des Steigbügels mit der abgeschrägten Kante einer 27-Gauge-Nadel ab. Drehen Sie die Probe so, dass das runde Fenster unten positioniert ist.

Führen Sie dann eine Nähnadel in das Foramen obturatorius des Steigbügels ein und heben Sie den Steigbügel an. Nach dem Entfernen des Steigbügels sollte die ovale Fensteröffnung gut sichtbar sein. Schiebe den Steigbügel mit der 27-Gauge-Nadel von der Nähnadel.

Um mit der Gewebeeinbettung zu beginnen, wird zunächst mit einer Schere der Griffelfortsatz am vorderen Ende der Bulla abgeschnitten. Der Malleus und der Rückenkamm sind durch den abgeschnittenen Teil sichtbar. Tauchen Sie die Bulla und die Kapsel in 1-2% Paraformaldehyd in PBS.

Wenn Luft in der Bulla eingeschlossen ist, entfernen Sie sie mit einer Nadel und einer Spritze. Lassen Sie die Bulla und die Kapsel im Fixiermittel bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Röhrchenrotator. Am nächsten Tag die Bulla und die Kapsel schnell in PBS waschen.

Tauchen Sie dann sofort in eine flüssige Kryo-Einbettmasse bei vier Grad Celsius. Es ist üblich, dass sich Luftblasen in der Kryo-Einbettungsverbindung auf Höhe des Mittel- und Außenohrs bilden. Entfernen Sie die Luftblase aus dem Mittelohr durch Aspiration mit einer Nadel.

Verwende die gleiche Technik für die Luftblase im Außenohr. Sobald alle Luftblasen entfernt wurden, richten Sie das Gewebe entsprechend der Art der zu erhaltenden Schnitte aus. Das Gewebe kann dann vor dem Schneiden in gefrorene Blöcke eingebettet werden.

Dieses Bild zeigt die H- und E-Färbung eines Paraffinschnitts in Längsrichtung eines entkalkten Malleus, gekennzeichnet durch den Buchstaben M, sowie die auditorische Bulla und Kapsel einer P14-Maus. Das Trommelfell wird durch den Buchstaben TM gekennzeichnet. Dieses Bild zeigt die Beschriftung des Kalziumknochens eines Längsschnitts eines gefrorenen, nicht entkalkten Malleus, gekennzeichnet durch den Buchstaben M, und der auditorischen Bulla einer P21-Maus. Kalziumgrüne Signale zeigen die Neubildung von Knochen im Malleus, in der Bulla und in der Kapsel an.

Sobald die Technik gemeistert ist, können die Hörblase und die Kapsel in zehn Minuten isoliert werden, wenn der Eingriff ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die anatomischen Orientierungen der gehörigen Gehörknöchelchen und Bullen bei der Maus haben, die im Haupttext beschrieben wurden.