Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Charakterisierung und Untersuchung von Populationen von Plasmamembran-abgeleiteten Mikrovesikeln im peripheren Blut. Mikrovesikel von Tumorpatienten, sind proinvasive und funktionelle Assays. Daher wird eine weitere Charakterisierung Aufschluss darüber geben, wie diese Vesikel tatsächlich zur Invasion und Metastasierung beitragen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine relativ schnelle Analyse von Mikrovesikeln im Blut ermöglicht, ohne dass hochentwickelte oder teure Materialien und Geräte erforderlich sind. Nachdem Sie ein oder zwei Röhrchen Blut von einem Freiwilligen in Entnahmeröhrchen mit EDTA gewonnen haben, drehen Sie die Röhrchen mehrmals um, um eine wirksame Blutgerinnungsantikoagulation zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben innerhalb einer halben Stunde nach der Blutabnahme und fügen Sie den Röhrchen einen Ventilfilter hinzu, um das Plasma von jeglichem verbleibenden Blut zu trennen.

Übertragen Sie das Plasma für eine zweite Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Ernte den Überstand und fülle ihn in ein neues Röhrchen um. Fügen Sie bei Bedarf PBS hinzu.

Das Plasma, das den in PBS verdünnten Überstand enthält, wird nach Bedarf zentrifugiert, um die Mikrovesikel zu sammeln. Dann den Überstand dekantieren und die Röhrchen für drei bis fünf Minuten kopfüber auf ein Küchenpapier legen. Wenn der gesamte restliche Überstand in das Handtuch eingedrungen ist, entfernen Sie das restliche Plasma vom Rand der Röhrchen und resuspendieren Sie das Mikrovesikelpellet in einem Milliliter PBS.

Übertragen Sie die Lösung in ein 1,5-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 50 bis 500 Mikrolitern PBS, je nach Größe des Pellets. Bestimmen Sie dann die Proteinkonzentration der Mikrovesikel mit einem Proteinassay.

Um die Mikrovesikel durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren, übertragen Sie 15 Mikroliter PBS, ergänzt mit 1 % vesikeldepletiertem FCS, in ein Durchflusszytometrieröhrchen, gefolgt von drei bis fünf Mikrogramm Mikrovesikeln, die in PBS suspendiert sind. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um jede unspezifische Bindung an der Mikrovesikeloberfläche zu blockieren. Fügen Sie dann den fluoreszenzmarkierten Antikörper von Interesse für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzu.

Verdünnen Sie anschließend die Probe mit 250 Mikrolitern frischem PBS und laden Sie die Mikrovesikel in das Durchflusszytometer. Reduzieren Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers auf den niedrigstmöglichen Wert und durchsuchen Sie die Mikrovesikelpopulation mit einem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm in einer logorithmischen Skala. Machen Sie dann ein Gate um die Mikrovesikelpopulation und bewerten Sie das Fluoreszenzsignal in einem entsprechenden Histogramm.

Die Mikrovesikelausbeute aus Spenderblutproben kann im Lowry-Proteinassay mit typischen Ausbeuten zwischen 10 und 30 Mikrogramm Vesikel pro Milliliter Blut und einer Partikelkonzentration von 1,66 mal 10 bis zum 9. bis 2,36 mal 10 bis zum 10. bestimmt werden, wie durch die Interpartikel-Tracking-Analyse bestimmt. Eine weitere Charakterisierung der Mikrovesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigt eine Population von Vesikeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 Nanometern, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind, die keine Zellorganellen enthält. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse bestätigt auch, dass die durchschnittliche Größe der isolierten Mikrovesikel zwischen 100 und 600 Nanometern liegt, mit einem Mittelwert von 201 Nanometern.

Die Färbung typischer Mikrovesikel- und Exosomenmarker durch Western Blot zeigt, dass die im Blut isolierten Mikrovesikel typischerweise positiv für tubulant sind, mit einer schwachen Expression von CD9 und CD81, während Exosomen im Allgemeinen negativ für tubulant sind und mit den beiden anderen Markern angereichert sind. Die Durchflusszytometrie zeigt eine definierte von Spendern stammende Vesikelpopulation, die mit den gleichen Parametern wie bei Zellkulturüberständen und isolierten Mikrovesikeln gesteuert werden kann. Das unterscheidet sich auch deutlich von dem Hintergrundsignal, das für das kontrollierte PBS beobachtet wurde, ergänzt durch 1%-vesikeldepletierte FCS-only-Proben.

Die Mikrovesikelfärbung mit etablierten Markern für verschiedene Blutzellpopulationen zeigt, dass der Prozentsatz der Mikrovesikel-Subpopulationen zwischen den Blutspenderproben unterschiedlich ist, wobei die Mehrheit der Mikrovesikel in allen Proben von Blutplättchen ausgeschieden zu werden scheint. Einmal gemeistert, kann die Isolierung von Mikrovesikeln und deren anschließende Charakterisierung durch Durchflusszytometrie in etwa 2-1/2 Stunden durchgeführt werden. Die Charakterisierung von Mikrovesikel-Subpopulationen wird dazu beitragen, eine Tumorsignatur bei Patienten im Vergleich zu Kontrollen zu identifizieren.

Dies kann als Biomarker für die Gegendiagnostik und Therapie nützlich sein.