Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Analyse histologischer und molekularer Parameter aus benachbarten Schnitten eines einzelnen Gewebes zu ermöglichen. Mit dieser Methode können wir helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Skelettmuskelbiologie und -erkrankung zu beantworten. Was sind zum Beispiel die regenerativen Effekte nach Muskelverletzungen und was sind die Auswirkungen der viralen Genübertragung durch intramuskuläre Injektion

Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass histologische und molekulare Daten direkt aus einem einzigen Gewebe korreliert werden können. Das ermöglicht eine effektivere Datenanalyse und eine bessere Nutzung von Versuchsgeweben. Kühlen Sie das Kryokonservierungsbad fünf Minuten vor Abschluss der Dissektionen ab.

Wenn die Gewebeproben bereit zum Einbetten sind, tragen Sie zunächst Einbettharz auf das untere Drittel bis zur Hälfte des Gewebes auf, wo der Muskel auf den Korken trifft. Dies sollte ordentlich erfolgen, um Harzinterferenzen mit den nachgelagerten Schritten zu reduzieren. Lassen Sie den Korken dann sofort in das auf minus 140 Grad Celsius abgekühlte 2-Methylbutan-Bad fallen.

Fügen Sie bis zu acht Gewebepräparate pro Charge hinzu. Rühren Sie die Taschentücher im Bad 30 Sekunden lang um und kratzen Sie dabei den Boden des Becherglases ab, um zu verhindern, dass die Gewebekorken in der Lösung einfrieren. Ziehen Sie nach 30 Sekunden mit einem Metallwerkzeug einen Gewebekorken aus dem 2-Methylbutan.

Entfernen Sie dann schnell den stützenden Abdeckschub. Tupfen Sie das überschüssige 2-Methylbutan zurück in das Bad und lassen Sie dann den Gewebekorken in das äußere Stickstoffbad fallen. Nachdem alle Gewebe in den flüssigen Stickstoff überführt wurden, werden sie in einen Behälter umgefüllt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Nachdem Sie den Kryostaten vorbereitet und eine Gewebeprobe montiert haben, verwenden Sie die Grob- und Feinsteuerung, um die Probe so bis zur Klinge zu befördern, dass sie die Klinge berührt. Setzen Sie die Summe der Querschnittsdicken an dieser Stelle auf Null zurück. Stellen Sie anschließend den Kryostaten auf die Trimmfunktion mit einer Schnittdicke von 30 Mikrometern ein.

Und schneiden und entsorgen Sie Schnitte bis zur gewünschten Gewebetiefe. Um Kryosektionen für die RNA-Extraktion effizient zu sammeln, öffnen Sie zunächst das Entnahmeröhrchen und platzieren Sie es in der Nähe des Klingenträgers. Nehmen Sie dort mit einer vorgekühlten, sauberen Bürste jeden Abschnitt auf und übertragen Sie ihn auf die Tube.

Gepoolte 30-Mikron-Tibialis-Frontschnitte der Maus, die aus einer Gewebetiefe von 400 bis 4.000 Mikrometern entnommen werden, ergeben in der Regel 25 bis 50 Milligramm Muskel. Wenn der Kryoabschnitt von Einbettharz umgeben ist, verriegeln Sie die Handbremse und rasieren Sie mit einer Rasierklinge kleine Harzstücke ab, bis nur noch eine dünne Schicht um die Oberseite des Muskels herum vorhanden ist. Schneiden Sie das Harz immer mit der Klinge vom Muskel weg ab.

Eine dünne Schicht Einbettungsharz beeinträchtigt die nachgeschaltete RNA-Extraktion nicht wesentlich. Wenn dickeres Einbettharz vorhanden ist, ziehen Sie es mit Bürsten vom Muskel weg, bevor Sie den Kryoabschnitt in das Entnahmeröhrchen einführen. Wenn während des Schnittvorgangs histologische Schnitte gewünscht werden, setzen Sie die Schichtdicke mit den Kryostat-Steuerelementen auf sieben Mikrometer zurück.

Schneiden und entsorgen Sie dann vier bis sieben Abschnitte, um eine gleichmäßige, ebene Gewebeoberfläche zu erhalten, und notieren Sie sich diese Gewebetiefe. Schneiden Sie nun einen guten Abschnitt ab und richten Sie ihn auf der Oberfläche des Klingenträgers aus. Nehmen Sie mit einem Objektträger bei Raumtemperatur den Schnitt auf und bringen Sie den Objektträger wieder auf Raumtemperatur.

Entnehmen Sie alle gewünschten Schnitte und notieren Sie sich dann die endgültige Gewebetiefe. Erfassen Sie nach Abschluss der Schnitte schnell das Gewicht der gepoolten Kryosektionen für die RNA-Isolierung. Bringen Sie das Rohr sofort wieder in die Kryostatkammer zurück, um die Temperatur der Abschnitte nahe minus 20 Grad Celsius zu halten.

Beginnen Sie damit, die gepoolten Kryoschnitte schnell auf Eis zu übertragen und etwa einen Milliliter Reagenz für die organische RNA-Extraktion pro 50 Milligramm Kryoschnitte hinzuzufügen. Je früher das Reagenz aufgetragen wird, desto weniger wird die RNA abgebaut. Anschließend werden die Kryoschnitte mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel homogenisiert, ohne zu viele Blasen zu bilden, indem Sie wiederholt eine Lösung aufziehen und an die Röhrchenwände ausstoßen.

Verwenden Sie die Nadelspitze, um verklumpte Stücke zu dispergieren. Geben Sie die Probe nach jeweils fünf Zügen kurz auf das Eis zurück, um sie kühl zu halten. Nach der Homogenisierung verwenden Sie eine 22-Gauge-Nadel, um die Probe mit fünf weiteren Hüben vorsichtig zu zerkleinern.

Geben Sie die Probe dann wieder auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei- bis viermal, um eine sehr fein verteilte Gewebehomogenität zu erreichen. Sobald das endgültige Homogenat hergestellt ist, lassen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um molekulare Komplexe aufzubrechen.

Fügen Sie anschließend in einem Abzug 0,1 Milliliter BCP pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz hinzu. Schütteln Sie dann die Tube 15 Sekunden lang kräftig. Verwenden Sie keinen Wirbel.

Inkubieren Sie die Probe dann zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der kurzen Inkubation zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 12.000 g und vier Grad Celsius. Entnehmen Sie dann vorsichtig die durchsichtige obere Phase, die die RNA enthält.

Füllen Sie es in ein sauberes Rohr und fügen Sie das gleiche Volumen von 70 % Ethanol hinzu, das in Tiefseewasser hergestellt wurde. Lassen Sie das Röhrchen nach kurzem Vortexen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und fahren Sie fort, indem Sie das Textprotokoll befolgen. RNA-Präparate des Skelettmuskels wurden aus dem Tibialis anterior der Maus hergestellt.

Drei Tage zuvor wurden einigen Muskeln 10 mikromolare Kardiotoxine und anderen Kochsalzlösung injiziert. Die Reinheit und Ausbeute der RNA aus diesen Proben war ausgezeichnet. Die RNA-Ausbeute war in den vorderen Tibialis-Muskeln nach einer Toxinverletzung wesentlich höher.

Die Integrität des Gewebes und die RNA-Produktion könnten bei dieser Beobachtung eine Rolle spielen. Die Persistenz der präparierten RNA-Qualität wurde anhand eines Mikroliters RNA bewertet, der 18 Monate lang bei minus 20 Grad Celsius gelagert worden war. Prominente ribosomale 18S- und 28S-RNA-Banden sind in Proben, die eine hohe RNA-Qualität zeigen, immer noch nachweisbar.

Sieben-Mikrometer-Schnitte wurden auf die Expression der embryonalen Myosin-Schwerkette gefärbt, die in Rot zu sehen ist. Zum Nachweis von regenerierenden Fasern, gefärbt für Kollagen sechs, gesehen in grün, das die Muskelfasern umreißt, und gefärbt mit Dappy, in blau, um die Zellkerne zu beobachten. Wenn es sich um eine schlechte Toxininjektion handelt, scheint die Verletzung minimal zu sein.

Eine erfolgreiche Toxininjektion führt dazu, dass ein viel größerer Bereich des anvisierten Muskelkompartiments betroffen ist. Der Grad der Verletzung könnte als Einschlusskriterium für die RNA-Analyse herangezogen werden. Einmal gemeistert, können die Schnitte für die RNA-Extraktion und den histologischen Objektträger für ein einzelnes Gewebe in weniger als einer halben Stunde abgeschlossen werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere histologische oder immunfluoreszierende Färbungen verfolgt werden, um eine Vielzahl von Fragen zu beantworten. Gepoolte Kryosektionen können auch zur Entnahme von DNA oder Proteinen verwendet werden.