Name: Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Lernen Sie die Soft-Agar-Overlay-Technik zur Screening bakterieller Hemmstoffe in P syringae. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Untersuchung antagonistischer Interaktionen in der mikrobiellen Ökologie.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch den kompetitiven Zuschuss 2015-67012-22773 der Agriculture and Food Research Initiative des USDA National Institute of Food and Agriculture an K.L.H.

1. Herstellung von Supernatant sein, um nach Aktivität getestet <ol><li> Bereiten Sie eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Mitomycin C durch die entsprechende Menge in sterile 0,1 M MgSO 4 Puffer Auflösung (zB 1 mg Mitomycin C / 2 ml Puffer). Shop Lager bei 4 ° C in einem lichtgeschützten Behälter (Mitomycin C ist lichtempfindlich). </li><li> Impfen eine einzige Kolonie von P. syringae in 3 ml Königs Medium B (KB) Brühe 14. Inkubieren über Nacht unter Schütteln (200 rpm) bei Raumtemperatur (21-25 ° C). </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen Sie die Brühe Kultur 1/100 in 3 ml frisches KB Brühe. Inkubieren für 3-4 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur. In Mitomycin C (0,5 ug / ml, Endkonzentration). Inkubieren der Kultur über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. HINWEIS: Mitomycin C verursacht doppelsträngigen DNA-Brüche, wodurch die Reaktion SOS Zelle stimulierenden, was zur Produktion von sowohl Bakteriophagen und Bacteriocinen. </li><li> Pellet 1-2 ml Mitomycin C Kulturen durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 5 min in einer Tischmikro induziert. </li><li> Entfernen und sterilisieren Kulturüberstand entweder durch den Überstand durch einen Filter von 0,22 um Porengröße vorbei oder durch den Überstand mit Chloroform Behandlung (100 ul Chloroform pro 1 ml Überstand). <ol><li> Wenn unter Verwendung von Chloroform, Strudel der Mischung für 15 Sekunden und lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation Zentrifugation der Mischung bei 20.000 × g für 5 min. HINWEIS: Chloroform effizient tötet Zellen, die durch ihre Solubilisierung von Membranen. Der Vorteil von Chloroform über Filtersterilisation ist, daß es billiger und einfacher ist, zu einer Zeit, viele (&gt; 20) -Proben maßstabs-up, wenn die Verarbeitung. Es kann eine Möglichkeit sein, dass eine gegebene Tötungsaktivität nach Chloroformbehandlung als Folge der Unterteilung in die organische Phase verloren geht. </li><li> Entfernen Sie die obere, wässrige Phase mit einer 1-ml-Pipette in ein frisches, steriles 1,5 oder 2,0 mlMikrozentrifugenröhrchen. Seien Sie vorsichtig, nicht von der unteren Chloroformschicht zu übertragen (es ist besser, zu entfernen, weniger von der wässrigen Phase Übertrag zu vermeiden). </li><li> Inkubieren des übertragenen Überstand in einem Abzug nicht begrenzten das restliche Chloroform verdampfen zu lassen (mehrere Stunden). Store-Überstände bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Trennung und Konzentration von hochmolekularem bakteriziden Verbindungen von Polyethylenglykol (PEG) Fällung <ol><li> Zum sterilen Überstand, fügen NaCl und PEG 8000 bis 1 M und 10% Endkonzentrationen sind. bis invertieren wiederholt die Probe sowohl das NaCl und PEG vollständig gelöst sind. Inkubieren Proben in einem Eisbad für 1 h oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte am Boden des Zentrifugenröhrchens bilden. Den Überstand abgießen und das Pellet in gewünschte Volumen (wie 1/10 oder 1/100 des ursprünglichen Überstand volUME) der Puffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Entfernung des restlichen PEG durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit einem gleichen Volumen an Chloroform. <ol><li> Kombinieren Chloroform mit dem resuspendierten Pellets und Vortex für 10 bis 15 Sekunden, Zentrifuge dann die Mischung bei 20.000 xg für 5 min. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Extraktion, bis keine weißen Schnittstelle zwischen der wässrigen und der organischen Phase sichtbar ist (in der Regel zwei Extraktionen insgesamt). Lassen Rest Chloroform extrahiert aus Überstand in einem Abzug verdampfen. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Overlay und Testüberstände auf Aktivität <ol><li> Impfen eine einzelne Kolonie von einer P. syringae - Stamm für die Empfindlichkeit in 3 ml KB getestet werden, Inkubation über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen wieder die Kultur 1/100 in frischer KB. Inkubieren 3-4 h mit Schütteln bei Raum temperatuRe. </li><li> Bereiten sterilisiertem Wasser agar indem man eine Suspension von 0,35 bis 0,7% Autoklavierung (w / v) Agar in Reinstwasser. HINWEIS: Ein Vorrat an weichem Wasser Agar kann wiederholt in einer Mikrowelle und wiederverwendet werden geschmolzen, frisch Overlay muss nicht für jedes Experiment vorbereitet zu sein. Wenn Wasser Agar wieder verwendet wird, ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, wird folgende microwaving vollständig geschmolzen. Wenn nicht, wird das Overlay eine körnige Textur auf erstarrenden die Interpretation schwierig machen wird. Wenn dies geschieht, schmilzt das Agar für einige Minuten länger in der Mikrowelle als bisher durchgeführt. </li><li> Pflegen Sie das geschmolzene Weichagar in einem 60 ° C Wasserbad vor der Verwendung. Mit einer sterilen serologischen Pipette Transfer 3 ml Weichagar in ein steriles Kulturröhrchen. Liefert die Kulturröhrchen auf Wasserbad in einem geschmolzenen Zustand zu halten. </li><li> Um das Overlay gießen, zuerst das geschmolzene Agar abkühlen lassen (es sollte sich warm, aber nicht heiß zum Anfassen), aber nicht zulassen, sich zu verfestigen. </li><li> In einer sterilen Haube, impfen 100 uldie Teststammkultur in den weichen Agar und Wirbel zu mischen. Drehen Sie Kultur mit der Hand für 10 bis 15 Sekunden, dann gieße auf einem Boden-Agar (KB-Agar). Kippen Sie die Platte in alle Richtungen der Soft-Agar, um sicherzustellen, gleichmäßig den Boden Agar abdeckt. HINWEIS: Die untere Agar kann jeder verfestigt sein (1,5% Agar) Medium, auf dem die Teststamm kräftig wächst. Für einen Standard-Durchmesser von 100 mm Petrischale, verwenden Sie ~ 20 ml geschmolzene Medium. Der untere Agar kann mehrere Wochen vor der Zeit vorbereitet werden (bei 4 ° C ohne Trocknung gehalten) oder kann am gleichen Tag hergestellt werden. Wenn am gleichen Tag hergestellt, wie das Overlay durchgeführt wird, ist es am besten so vor tun 3.4 zu treten. </li><li> Decken Sie die Platte und lassen Sie es 20-30 Minuten zu verfestigen. Achten Sie darauf, die Platte nicht zu stören, während erstarrt. </li><li> Einmal verfestigt, beschmutzen 2-5 &amp; mgr; l Überstand (erzeugt in den Abschnitten 1 und 2, oben) auf das Overlay. Lassen Sie die Platten zur Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Beobachten Sie und ein Rekordergebnis am nächsten Morgen. Notiere eskann nützlich sein aus einer Reihenverdünnung des Überstands durchzuführen und beschmutzen. Auf diese Weise können die Forscher zwischen Bakteriophagen und Bacteriocin Clearing-Aktivität zu unterscheiden. In diesem Fall ist es empfehlenswert, 1 auszuführen: 5 oder 01.10 Verdünnungen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Soft-Agar-Overlay-Technik hier beschrieben ist seit vielen Jahrzehnten von den Forschern interessiert in Bakteriophagen oder bacteriocins weit verbreitet. Die wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind, dass es ist einfach, billig und relativ einfach zu interpretieren. Durch die Kombination der Soft-Agar - Deckschicht mit PEG - Fällung und serielle Verdünnung können antimikrobielle Mittel in hohem bzw. niedrigem Molekulargewicht Mittel getrennt werden, und replikative vs. nicht replikativen Mittel (dh Bakteriophagen gegen tailocin, beziehungsweise). Schließlich kann Inkorporation von gezielte genetische Manipulation (Deletion und Komplementation) putativer Bacteriocin oder Prophagen loci fest um die Identität einer bestimmten antagonistische Verbindung herzustellen. Wir haben diese Methode vor kurzem eine neue Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin weit verbreitet unter den Pseudomonas syringae - Stämmen 9 zu beschreiben. Die Wachstumsmedien und in diesem Protokoll Arbeit angegebenen Bedingungen gut für Pseudomonas syringae und würden für andere gramnegative Bakterien wahrscheinlich ausreichen , das kräftig unter diesen Bedingungen wachsen. Jedoch Forscher dieses Verfahren verwendet werden soll das Timing, Kulturmedium, Induktionsverfahren und Inkubationstemperatur für ihr System zu optimieren. Die kritischen Parameter sind die Produktionskultur zu induzieren, während in der logarithmischen Wachstumsphase sowie Impfen der Soft-Agar-Deckschicht mit einer ausreichenden logarithmischen Phase Kultur eine einheitliche Bakterienverteilung zu gewährleisten, aber nicht übermäßige Kultur, die potentiellen Klärungszonen verdunkeln wird. Es gibt viele Bakteriocine, die nicht als Teil der SOS - Antwort induziert , sondern werden durch peptidbasierte Quorum sensing - Systeme induziert (insbesondere Gram-positive Bacteriocine 15), damit ein Forscher möchte kann mehrere verschiedene Induktionsverfahren zu screenen (wie Modifizieren Nährstoffgehalt von Medium zu induzieren, oder so dass für längere Inkubation des produzierenden Stamm). Beim BenutzenDiese Technik muss der Weichagar overlay gründlich vor der Zugabe des seeding Dehnung bei 55-60 ° C geschmolzen und gehalten werden. Wir haben mehrere Experimente hatten, wo die Soft-Agar nicht gründlich geschmolzen war (wenn auch visuell es zu sein schien) und führte zu einer Überlagerung mit einem körniges Aussehen. Die Ergebnisse einer körnig Overlay kann im Allgemeinen noch interpretierbar sein, aber dies auf die Stärke der Hemmung (schwächere Hemmung wird schwieriger zu beobachten) abhängig ist. Eine letzte, Verwechselung Variable zu berücksichtigen, wenn mit dieser Technik ist, dass die Temperatur des geschmolzenen Agar wird ausreichend Zeit gelassen, bevor sie mit dem Aussäen Stamm der Inokulation zu kühlen, um die Tötung der Seeding-Stamm zu vermeiden. Um dieses Problem zu vermeiden, stellen wir sicher, die Soft-Agar ist warm, aber nicht heiß, zu berühren. In dieser Richtung haben wir auch festgestellt, dass, wenn wir nicht ausreichend Zeit für eine seeding Kultur geben zum geschmolzenen Agar zu akklimatisieren, bevor die Überlagerungs Ausgießen gewinnen wir im allgemeinen eine schlechte bakterielle growth, die Auslegung der spezifischen Hemmung schwierig oder unmöglich zu interpretieren ist. Aus diesem Grund wir 10-15 zusätzliche Sekunden Inkubation zwischen Verwirbelung und Gießen der Overlay ermöglichen. Die Trade-off der Agar in einem vollständig geschmolzenen Zustand zwischen der Aufrechterhaltung (heißer ist besser), aber nicht tödlich für die Aussaat Stamm (heißer ist nicht besser) ist eine, die wahrscheinlich von einem Forscher durch Versuch und Irrtum bestimmt werden müssen. Wenn ein PEG-Fällungsschritt verwendet wird, wäre es vorteilhaft, eine negative Kontrolle enthalten, wo eine sterile Broth-Medium identisch zu dem Kulturüberstand verarbeitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Aktivität Töten ist nicht das Ergebnis von Rest PEG oder Chloroform innerhalb des Probenüberstand. Da beide Bakteriophagen und bacteriocins neigen hoch spezifisch zu sein, ist es nicht ungewöhnlich, mit einer bestimmten Kombination von Stämmen keinen offensichtlichen Tötungsaktivität zu begegnen. Dies kann aus einer Vielzahl von stammspezifischen re führenResistenz-Mechanismen, wobei man, dass der Stamm-Tester entweder fehlt oder hat eine unbekannte Version des von einem bestimmten Bacteriocin oder Bakteriophagen benötigt Rezeptor für das Targeting. Ein alternatives Verfahren, Bacteriocin Screeningverfahren wurde von Kawai et al beschrieben worden. , Leidet aber unter Nachteile und hat weit 16 nicht verabschiedet. Insbesondere erfordert diese Technik broth Proben in Zeitintervallen beobachtet, die lästig sein kann und nicht für die Unterscheidung zwischen Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin und abgeleitete Abtötung Aktivitäten erlaubt. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist, dass es nicht gut für Organismen geeignet ist, die wachsen nicht robust (und wird somit leicht unterscheidbare Klärungszonen fehlt), oder dass Hafen Prophagen oder Bakteriocine, die nicht robust unter Laborbedingungen hergestellt. Adaption dieser Technik bacteriocins zu erkennen, in Umweltproben erzeugt würde sowohl den Nutzen erweiterndieser Technik und einen besseren Einblick in die Rolle der bacteriocins in natürlicher Umgebung erleichtern.

Vor kurzem gab es in unser Verständnis der mikrobiellen Ökologie wesentlichem Interesse (insbesondere die microbiomes verschiedener Umgebungen), sowie neue antibakterielle Verbindungen bei der Bekämpfung von Antibiotika - resistenten Erregern 1,2 zu verwenden. Ein Verbindungs ​​Thema zwischen diesen Interessen ist das Verständnis antagonistische Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen in ihrer natürlichen Umgebung. Es gibt zahlreiche Wege , auf denen Bakterien Konkurrenten 3 antagonisieren. Bacteriocins, eine heterogene Gruppe von protein-, antibakterielle Verbindungen, wurden für ihre Rolle längst bei der Vermittlung interbakterieller Antagonismus, mit zwei der am meisten untersuchten Spezies ist von Pseudomonas aeruginosa 4,5 und Escherichia coli 6, wichtige menschliche Krankheitserreger untersucht. Neben bacteriocins können, induzierte Prophagen auch als anticompetitor Mittel wirken, so dass ein Stamm in eine Nische zu erobern , die bereits 7 besiedelt ist. Pseudomonas syringae ist eine bekannte Pflanze Pathogen eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln zu erzeugen, einschließlich einzelnes Protein bacteriocins 8, Bakteriophagenschwanz abgeleitete bacteriocins 9 (genannt tailocins) sowie Nicht-Protein - Sekundärmetaboliten 10. In letzter Zeit hat das Interesse gewesen zu verstehen , wie diese antimikrobiellen Substanzen , die Ökologie dieses Organismus beeinflussen, und wie können sie genutzt werden , um Pflanzenkrankheiten 11 steuern. Eine weit verwendete Methode sowohl bacteriocins und Bakteriophagen für die Untersuchung ist die Soft-Agar-Overlay-Technik. Diese Methode wurde zum ersten Mal in das Aufzählen Bakteriophagen 12,13 von Gratia 1936 zu Hilfe beschrieben. Hier wir die Anwendung der weich Agar-Overlay-Verfahren in Kombination mit gezielten genetischen Manipulation und Polyethylenglycol (PEG) Fällung, bei der Unterscheidung zwischen drei verschiedenen antimikrobiellen Mitteln (ein Bakteriophage beschreiben, ein hochmolekulares bacteriocin, und ein niedermolekulares Bacteriocin) durch eine einzelne Bakterienstamm produziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und billig, weshalb, obwohl es entschieden &quot;Low-Tech&quot; zu sein, wird immer noch weit verbreitet genutzt.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Karzinogen. Verwenden Sie geeignete PSA (d.h. Handschuhe, Augenschutz und Gesichtsmaske), insbesondere bei der Zubereitung der Stammlösung.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Akut giftig, Gefahr für die Atemwege. Verwenden Sie geeignete PSA (Handschuh und Augenschutz), handhaben Sie offene Behälter in einem chemischen Abzug.</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologischer Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

die nutzung der soft-agar-overlay-technik zur leinwand für bakteriell hemmstoffe produziert

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Die Soft-Agar-Overlay-Technik wurde ursprünglich vor mehr als 70 Jahren entwickelt und in verschiedenen Bereichen der mikrobiologischen Forschung, einschließlich der Arbeit mit Bakteriophagen und bacteriocins, proteinhaltiges antibakterielle Mittel in großem Umfang eingesetzt worden. Dieser Ansatz ist relativ kostengünstig, mit geringem Ressourcenbedarf. Diese Technik besteht Überstand von einem Spenderstamm von Spek (möglicherweise eine toxische Verbindung Beherbergung (n)) auf eine verfestigte weiche Agar-Deckschicht, die mit einem bakteriellen Teststamm (potentiell empfindlich gegenüber der toxischen Verbindung (en)) ausgesät wird. Wir nutzten diese Technik eine Bibliothek von Pseudomonas syringae zu screenen für innerartliche Tötung Stämme. Durch die Kombination dieser Ansatz mit einem Fällungsschritt und gezielte Gen-Deletionen, mehrere toxische Verbindungen, die durch den gleichen Stamm hergestellt werden, können unterschieden werden. Die beiden antagonistischen Mittel häufig diese Technik gewonnen verwenden, sind Bakteriophagen und bacteriocins. Diese beiden Mittel können differenziert werden unter Verwendung vonzwei einfache zusätzliche Tests. Durchführen einer seriellen Verdünnung auf einen Überstand Bakteriophagen enthält, wird in den einzelnen Plaques führen weniger an der Zahl mit größerer Verdünnung zu werden, während serielle Verdünnung eines Überstand Bacteriocin enthält eine Klärungszone führen, die mit einer größeren Verdünnung gleichmäßig mehr trüb wird. Darüber hinaus wird ein Bakteriophage eine Klärungszone erzeugen, wenn sie auf eine frische Soft-Agar-Overlay ausgesät mit dem gleichen Stamm entdeckt, während ein Bakteriocin wird keine Klärungszone erzeugen, wenn sie zu einem frischen Weichagar Rasen übertragen, um die Verdünnung des Bakteriocin zurückzuführen ist.

Die Kombination des weichen Agar-Deckschicht und PEG-Fällung kann verwendet werden, um verschiedene antimikrobielle Mittel durch die gleiche Stamm produziert zu identifizieren und zu charakterisieren. Figur 1 zeigt zwei Stämme von P. syringae (A und B) , die durch eine dritte Stamm der gleichen Spezies inhibiert werden. Die beiden Stämme sind jedoch durch verschiedene bacteriocins gehemmt. Die Klärungszone auf Stamm A weist eine scharfe Kante, während die Klärungszone auf Stamm B größer ist, und weist eine nicht scharfe Grenze. Genetische Manipulationen innerhalb des produzierenden Stammes, der spezifisch entweder die tailocin (tailocin mangelhaft) oder niedermolekularen Bacteriocin (bacteriocin mangelhaft) bestätigen zu inaktivieren, die A- und B-Stämme sind empfindlich auf unterschiedliche bacteriocins. 2 zeigt , dass Bakteriophagen-vermittelten Abtötung kann durch Vergleichen einer Verdünnungsreihe von anderen nicht-replikativen antimikrobiellen Mitteln unterschieden werden. Da beide bacteriocins undProphagen kann durch Mitomycin C-Behandlung, Aktivitäten dieser beiden Mittel können einander sehr ähnlich induziert werden (insbesondere, wenn die aktivierte Phagen reichlich vorhanden ist). Im Falle der Bakteriophagen-vermittelten Clearing, Verdünnung des Überstandes wird in einzelne Plaques (Clearing-Zonen) lösen, während Bacteriocin-vermittelte Clearing nicht in eine solche Plaques lösen wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die phänotypische Unterscheidung mehrerer antimikrobieller Mittel durch den gleichen Stamm produziert. Stamm A ist empfindlich gegenüber einem hochmolekularen Bacteriocin (tailocin), aber keine Alternative mit niedrigem Molekulargewicht Bacteriocin, wie durch das Fehlen von belegt in der tailocin defizienten Stamm löschen, jedoch nicht die Bacteriocin-defiziente Stamm. Umgekehrt ist der Stamm B zum tailocin insensitive, ist jedoch empfindlich gegenüber der niedermolekularen Bakteriocin. Die tailocin ist efficiently folgende PEG Fällung gewonnen, während mit niedrigerem Molekulargewicht bacteriocins nicht. WT = Wildtyp. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Unterscheidung zwischen nicht-replikativen antimikrobielle Substanzen und Bakteriophagen. (A) Verdünnung von einem hohen Titer von Bakteriophagen Ergebnisse in einzelnen Plaques , die weniger zahlreich geworden (hohe Titer oben, niedrige Titer unten). (B) Verdünnung von bacteriocins Ergebnisse in gleichmäßig weniger Lichtung , die nicht in einzelne Plaques löst. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir beschreiben eine einfache Methode zum Screening von Bakterienkulturen auf die Produktion von Verbindungen, die gegenüber anderen Bakterien hemmend wirken.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Wirkstoffe einer Bakterienstamm zu identifizieren, die hemmend auf einen zweiten Bakterienstamm wirken. Diese Methode kann zur Beantwortung von Fragen in zahlreichen mikrobiologischen Fachgebieten beitragen, ist jedoch insbesondere in der mikrobiellen Ökologie nützlich, um antagonistische bakterielle Wechselwirkungen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie kostengünstig ist und einfach durchzuführen sowie auszuwerten.Die Durchführung des Verfahrens wird von Aretha, einer Studentin im Labor, vorgenommen. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie eine einzelne Kolonie von P. syringae in 3 Milliliter King's Medium B-Brühe (KB) impfen. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht. Am folgenden Morgen verdünnen Sie die Brühe-Kultur im Verhältnis 1 zu 100 in 3 Milliliter frische KB-Brühe.Inkubieren Sie die Kultur drei bis vier Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Kultur eine deutliche Zunahme der Trübung aufweist, und geben Sie anschließend Mitomycin C hinzu. Inkubieren Sie die Kultur danach über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag pelletieren Sie ein bis zwei Milliliter der mit Mitomycin C induzierten Kulturen in einer Tischmikrozentrifuge.Entfernen und sterilisieren Sie die Kulturüberstände, indem Sie den Überstand durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern leiten. Geben Sie Natriumchlorid hinzu, um eine Konzentration von einem Mol pro Liter zu erreichen, und fügen Sie Polyethylenglykol, oder PEG 8000, bis zu einer Endkonzentration von 10 %, dem sterilisierten Überstand hinzu. Invertieren Sie die Proben wiederholt, bis sowohl Natriumchlorid als auch PEG vollständig gelöst sind.Die Proben eine Stunde lang in einem Eisbad inkubieren. Anschließend die Proben zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und das Pellet durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren in Puffer erneut suspendieren.Entfernen Sie restliches PEG durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit jeweils gleicher Menge Chloroform. Kombinieren Sie das Chloroform mit dem resuspendierten Pellet und mischen Sie die Probe 15 Sekunden lang durch Vortexen. Zentrifugieren Sie danach die Mischung bei 20.000 × g für fünf Minuten.Überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diese Extraktion zweimal, bis keine weiße Grenzschicht zwischen der wässrigen und der organischen Phase mehr sichtbar ist. Lassen Sie restliches Chloroform aus den extrahierten Überständen in einem Abzug verdunsten.Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie eines P. syringae-Stamms in drei Milliliter KB-Medium und inkubieren Sie die Kultur über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur. Am folgenden Morgen verdünnen Sie die Kultur 1:100 in frisches KB-Medium. Inkubieren Sie die Kultur drei bis vier Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur. Bereiten Sie anschließend sterilisiertes Wasser-Agar vor, indem Sie eine Suspension von Agar in ultrareinem Wasser im Autoklaven sterilisieren.Halten Sie das geschmolzene weiche Agar in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius vor der Verwendung bereit. Übertragen Sie mithilfe einer sterilen serologischen Pipette drei Milliliter weiches Agar in ein steriles Kulturgefäß. Stellen Sie das Kulturgefäß zurück in das Wasserbad, um es im geschmolzenen Zustand zu halten.Bevor die Überlagerung gegossen wird, sollte das geschmolzene Agar abkühlen, jedoch nicht verfestigen. Es ist entscheidend, dass das Agar vor der Inokulation heiß und vollständig flüssig bleibt. Andernfalls weist die Überlagerung eine körnige Struktur auf und ist schwieriger zu interpretieren.In einem sterilen Abzug 100 µL der Testerstammkultur in die weiche Agarlösung geben und kurz vortexen, um sie zu mischen. Die Kultur für 10 bis 15 Sekunden von Hand rotieren, dann auf den Boden einer Agarplatte gießen. Die Platte in alle Richtungen kippen, um sicherzustellen, dass die weiche Agarlösung den Untergrundagar gleichmäßig bedeckt.Decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten lang verfestigen. Achten Sie darauf, die Platte während des Verfestigens nicht zu stören. Sobald die Verfestigung abgeschlossen ist, geben Sie zwei bis fünf Mikroliter Überstand auf die Überlagerung. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Am folgenden Morgen die Ergebnisse beobachten und dokumentieren. Mit dieser Methode werden zwei Stämme von P syringae durch unterschiedliche Bakteriozine gehemmt.Stamm A ist empfindlich gegenüber einem bakterioziden Tailocin mit hohem Molekulargewicht, jedoch nicht empfindlich gegenüber einem alternativen, bakterioziden Stoff mit niedrigem Molekulargewicht. Umgekehrt ist Stamm B gegenüber dem Tailocin unempfindlich, zeigt aber Empfindlichkeit gegenüber dem bakterioziden Stoff mit niedrigem Molekulargewicht. Das Tailocin wird effizient nach PEG-Fällung zurückgewonnen, während bakteriozide Stoffe mit niedrigerem Molekulargewicht dies nicht tun.Die durch Bakteriophagen vermittelte Abtötung unterscheidet sich von anderen nicht-replikativen Antimikrobiellen durch den Vergleich einer Verdünnungsreihe. Im Fall einer durch Bakteriophagen vermittelten Klärung führte die Verdünnung des Überstandes zur Auflösung in einzelne Plaques oder Klärungszonen, während eine durch Bacteriocine vermittelte Klärung sich nicht in solche Plaques auflöste. Dieses Verfahren kann als anfänglicher Screeningansatz zur Identifizierung inhibitorischer Wirkstoffe verwendet werden und lässt sich mit nachgeschalteten genetischen Modifikationen kombinieren, um die Quelle dieser Aktivität zu identifizieren oder zu bestätigen.

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