Name: Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäß Morphometry in einem Rattenmodell für Durchfluss-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines Rattenmodells für durchflussinduzierte pulmonale arterielle Hypertonie mittels Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäßmorphometrie. Diese Methoden ermöglichen die Analyse hämodynamischer und histologischer Endpunkte.

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Diese Studie wurde unterstützt von der Netherlands Cardiovascular Research Initiative, der Dutch Heart Foundation, der Dutch Federation of University Medical Centers, der Netherlands Organization for Health Research and Development und der Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald Fund, Stichting Hartekind).

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der niederländischen Zentralkomitee für Tierversuche und der Animal Care Committee an der University Medical Center Groningen (NL) genehmigt. Beide Wistar und Lewis-Ratten mit Gewichten zwischen 180 und 300 g wurden verwendet. 1. Gehäuse und Akklimatisierung <ol><li> Nach der Ankunft in der zentralen Tieranlage, Hausratten in Gruppen von 5 pro Käfig. Während einer 7-Tage Eingewöhnungszeit daran gewöhnen, die Ratten für die menschliche Behandlung, aber üben keine experimentellen Verfahren. </li></ol> 2. Vorbereitung und Injektion von Sterile Monocrotalin <ol><li> 1 ml 60 mg / mL monocrotalin (MCT) -Lösung, 60 mg wiegen von monocrotalin in einem 2-ml-Röhrchen. Hinzufügen 700 &amp; mgr; l 0,9% NaCl. Zugabe von 200 ul 1 M HCl. Wärmen Sie die Lösung in der Röhre unter fließendem warmen Leitungswasser und Wirbel es. Verwenden Sie 6 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,0 zu bringen. Verwenden Sie sterile Technik zur Herstellung von MCT für die Injektion in Nagetieren. </li&gt; <li> Injizieren von 1 ml steriles 60 mg / ml MCT Lösung pro kg subkutan in den Hals (0,3 ml von 60 mg / ml MCT für eine 300 g Ratte). HINWEIS: Wir bevorzugen nicht kleinere Mengen zu verwenden, aufgrund der größeren Wahrscheinlichkeit, dass die injizierten Dosis nicht geeignet sein wird. </li></ol> 3. Aorta-Kava-Shunt-Chirurgie <ol><li> Anästhesie. <ol><li> Füllen Sie die Induktionskammer mit 5% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min) und legen Sie die Ratte in der Kammer. Überprüfen Sie für eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Wiegen Sie die Ratte. </li><li> Rasur und reinigen Sie den Bauch auf einer Fläche, die etwa 8 cm lang und 3 cm breit ist. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Heizmatte (37 ° C) durch eine sterile Matte bedeckt. </li><li> Legen Sie die Schnauze in einer Beatmungsmaske / Kapuze mit 2 - 3% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min). Schauen Sie sich die Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Bewerben Augensalbe Trockenheit zu verhindern, während der Narkose. </li></ol></li><li> Shunt SurGery. <ol><li> Scrub die Haut mit Chlorid-hexidine zur Desinfektion. Injizieren 0,01 mg / kg Buprenorphin subkutan für die postoperative Analgesie. </li><li> Verwenden Sie sterile Instrumente für die Chirurgie. Einen Einschnitt mit einem # 10 Skalpellklinge in den Bauch auf der Mittellinie ab 1 cm unterhalb der Membran eine sich nach unten bis knapp oberhalb der Genitalien. </li><li> Heben Sie den Darm mit einem Wattestäbchen auf, decken den Darm in einem sterilen, feuchten Gaze (0,9% NaCl), und legen Sie sie auf der linken Seite des Tieres. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Membranen zu trennen, die die Bauchaorta und die untere Hohlvene in die umliegenden Gewebe befestigen. HINWEIS: sezieren nicht die Membranen zwischen der Aorta und die Hohlvene. </li><li> Mit Splitterpinzette, entfernen Sie die perivaskulären Aorten Fett knapp oberhalb der Bifurkation, nur auf der rechten Seite der Aorta und nur an der Stelle, wo die Nadel eingefügt wird. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen die Aorta und Vena Cava von 2 mm Supe zu trennenrior an der Stelle, wo die Nadel eingeführt werden, um Platz zu schaffen für eine Biemer Klemme. </li><li> In diesem Bereich muss zunächst eine lose Ligatur (5-0 Naht) um die Aorta. Erstellen Spannung auf die Ligatur durch einen Kocher Klammer Platzierung auf, und legen Sie dann die Kocher besser als der Schnitt (1A). Legen Sie die Biemer klemmen nur überlegen die Ligatur (Figur e 1A). </li><li> Mit einem Wattestäbchen, komprimieren die vena cava so distal wie möglich auf die Strömung (1A) zu behindern. Biegung eine Nadel (18 G in diesem Protokoll) in einen Winkel von 45 Grad, mit der Öffnung nach außen zeigen (1A). </li><li> Bei einem Winkel von 90 Grad, legen Sie die Nadel in der Aorta, knapp oberhalb der Bifurkation, mit der Öffnung der Nadel auf der linken Seite (Abbildung 1A). Manipulieren die Spitze der Nadel nach links und legen Sie sie in die Hohlvene. HINWEIS: Die Nadelspitze sollte jetzt sein visiBLE in der Hohlvene (1B). </li><li> Verwenden Sie einen zweiten Wattestäbchen das restliche Blut in die Aorta aus der Einstichstelle zu drücken Thrombose zu verhindern. Trocknen Sie den Bereich um den Shunt mit einer sterilen Gaze, um den Kleber ausreichend haften. </li><li> Ziehen Sie die gesamte Nadel aus der Aorta und sofort einen Tropfen Gewebekleber auf die Einstichstelle in der Aorta Anwendung. Achten Sie darauf, nicht mit dem Wattestäbchen auf das Gewebe zu verkleben. Ausspannen Aorta. </li><li> Überprüfen Sie den Shunt manuell durch Ziehen an und die Ligatur an der Aorta proximal der Shunt-Freigabe. Lockern sollte die Hohlvene distal der Shunt in leuchtend rote Farbe und schaffen Turbulenzen am Shunt Ort. HINWEIS: Anziehen wird das Blut in die Hohlvene zurück zu dunkel rot. </li><li> Platzieren Sie den Darm wieder in das Tier. Schließen Sie die Muskelschicht und die Haut mit resorbierbaren 4-0 Nähten. Belüften das Tier mit 100% O 2 aus der Narkose zu erholen. HINWEIS: Lassen Sie keine animal unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. </li></ol></li><li> Sham-Chirurgie. <ol><li> Führen alle obigen Verfahren, mit Ausnahme der Einführung der Nadel in die Aorta. </li></ol></li><li> Post-chirurgische Versorgung. <ol><li> Legen Sie die Ratte in einem einzigen Käfig und in einem Inkubator bei 37 ° C bis zum nächsten Morgen. </li><li> Etwa 6 Stunden nach der Operation, injizieren 0,01 mg / kg Buprenorphin subkutan für die postoperative Analgesie. Wiederholen Sie den nächsten Morgen, wenn die Ratte Anzeichen von Unwohlsein zeigt. HINWEIS: Die ersten 3 Tage nach der Operation, Ratten neigen dazu, weniger zu essen und zu trinken (dies ist besonders wichtig, wenn Futter oder Trinkwasser mit Drogen gemischt). Die meisten Ratten zeigen normales Verhalten von 3 Tagen nach der Operation. Wenn nicht, genau überwachen. Gewichtsverlust von 15% in 1 Woche überschreitet wird als abnormal, und solche Ratten sollte durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumen während der Narkose eingeschläfert werden. </li></ol></li></ol> HINWEIS: In diesem Protokoll wird das Tier durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens, während sie unter Anästhesie eingeschläfert. <ol><li> Sacrifice 1 Tag nach der Operation (MF8) für die frühen zellulären und funktionellen Antworten zu einer erhöhten Lungenblutung (zB Gen Hochregulation oder frühen Transkriptionsfaktoren). </li><li> Sacrifice 1 Woche nach der Operation (MF14) für eine im Frühstadium PAH vaskulären Phänotyp (mediale Hypertrophie ohne neointimalen Läsionen). </li><li> Sacrifice von 2 Wochen nach der Operation (MF21) für eine im fortgeschrittenen Stadium PAH vaskulären Phänotyp (markiert mediale Hypertrophie und neointimale Bildung) mit leichter Höhen in RVP und mPAP. </li><li> Sacrifice 3 Wochen nach der Operation (MF28) für eine im Endstadium PAH vaskuläre Phänotyp (markiert neointimalen Okklusion) und eine starke Erhöhung der RVP und mPAP. Klinische Zeichen einer Rechtsherzinsuffizienz sind in diesem Stadium üblich. </li><li> Opfer nach dem 28. Tag (MF-RVFfür) PAH-assoziierten Rechtsherzinsuffizienz (RVF), klinisch als Dyspnoe definiert, schwere Lethargie und Gewichtsverlust (&lt;10% in 1 Woche). Terminate Ratten, wenn eines dieser Zeichen vorhanden ist. Häufig Ratten diese Symptome zwischen den Tagen 28 und 35 und, wenn unbewacht gelassen entwickeln, sterben spontan während dieses Zeitintervalls. </li></ol> 5. Rechtsherzkatheter <ol><li> Anästhesie. <ol><li> Füllen Sie die Induktionskammer mit 5% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min) und legen Sie die Ratte in der Box. Überprüfen Sie für eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Wiegen Sie die Ratte. </li><li> Rasur und reinigen Sie den Hals an der rechten Bauchseite der Ratte und für die Echokardiographie-Protokoll, dem Thorax und Oberbauch. </li><li> Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Heizmatte (37 ° C) und legen Sie die Schnauze in einer Beatmungsmaske / Kapuze mit 2 - 3% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min). Die Schnauze sollte in Richtung der Forscher konfrontiert werden. </li><li&gt; Überprüfen der Narkosetiefe. Seien Sie vorsichtig mit Ratten mit schwerer PH. Wenn die Herzfrequenz abnimmt, verringern die Tiefe der Anästhesie. Bevorzugte, führen alle Messungen innerhalb von 20 min. Bewerben Augensalbe Trockenheit zu verhindern, während der Narkose. </li></ol></li><li> Echokardiographie-Protokoll. <ol><li> Führen Sie die Echokardiographie nach dem Protokoll von Brittain et al. in JoVE 13. </li></ol></li><li> Katheterisierung Protokoll. HINWEIS: Um die 15-cm Silizium Katheter zu führen mit einer Kugel 2 mm von der Spitze Dieses Protokoll verwendet eine starre Kanüle mit einem vorgeformten Spitze 20 Grad gebogen. Eine 20-G - Nadel mit seiner Öffnung leicht gebogen nach innen benutzt wird , um die Kanüle in die rechte Halsvene einzufügen (siehe die Liste der Materialien). Ratten in jeder Phase der Progression der PAH und Steuerung kann in diesem Protokoll verwendet werden. <ol><li> Desinfizieren Sie den Hals mit Chlorid-hexidine. Machen Sie einen 1,5-cm-Schnitt mit einem # 10 Skalpellklinge in der rechten Bauchseitedes Halses, vom rechten Kragen Knochen auf den Kieferknochen. </li><li> Verbreiten Sie das Gewebe einer Schere. Mit einer Pinzette, ziehen Sie das Gewebe auseinander, bis die Halsvene erscheint. Präparieren der Membranen um die Halsvene Splitterpinzette verwendet wird. </li><li> Setzen Sie die Spannung auf die Halsvene durch eine lose Ligatur platzieren (5-0 Naht) um das Gefäß. Erhöhen Sie die Spannung und Band der Ligatur auf die Beatmungsmaske (2A). </li><li> Stromabwärts der Insertionsstelle legen eine lose Ligatur um das Gefäß zu ziehen , nachdem die Kanüle in situ ist , um Leckage und Druckverlust zu verhindern. </li><li> Verwendung der Handgriffe einer Zange, verbiegen leicht die Spitze einer 20-G-Nadel mit der Öffnung an der Innenseite der Kanüle mit dem Katheter zu führen. </li><li> Führen Sie die Spitze des 20-G-Nadel in die Vene und legen Sie schnell die Kanüle des Katheters im Inneren des Gefäßes enthält. Ziehen Sie die Nadel heraus, und schließen Sie dann die Ligaturdass in Schritt 5.3.4 vorbereitet. </li><li> Führen Sie die Kanüle des Katheters in die Halsvene enthält. Die Spitze der Kanüle ist mit einer 20-Grad-Kurve (siehe Schritt 5.3.5). Manövrieren Sie die Kanüle unter dem Schlüsselbein und vorantreiben ein wenig in den rechten Vorhof (Abbildung 2C) einzugeben. </li><li> Um den rechten Ventrikel eingeben, richten Sie die Spitze der Kanüle nach links, in Richtung des Herzens (2D). Auf dem Nacht Monitor sollte eine RV - Druckkurve erscheinen, passend 2D. </li><li> Wenn der RV Druckkurve konstant ist, notieren Sie sich den systolischen und diastolischen Druck des rechten Ventrikels 1 (sRVP1 / dRVP1). </li><li> Manipulieren der Spitze der Kanüle nach links und nach oben. Schieben Sie den Katheter innerhalb der Kanüle (Abbildung 2E). </li><li> Schieben Sie den Katheter in die Hauptlungenarterie (PA). Kein Widerstand sollte spüren, wenn die Pulmonalklappe vorbei. HINWEIS: Wenn der Katheter die Hauptlungenarterie gelangt, die diastolic Druck steigen. Auf dem Nacht Monitor sollte eine PA - Druckkurve erscheinen, passend 2E. </li><li> Wenn der PA-Druckkurve konstant ist, schreiben die Systole, Diastole nach unten, und die mittlere PA Druck 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1). </li><li> weiter vorantreiben, den Katheter innerhalb der Kanüle, bis die Kugel an der Spitze des Katheters in einer Lungenarterie eingeklemmt wird. Beachten Sie die Druckkurve auf dem Nacht Monitor Abfall und entsprechen den Keil Druckkurve in 2F. </li><li> Wenn der Keildruckkurve konstant ist, notieren Sie sich den systolischen, diastolischen und Keildruck bedeuten. </li><li> Ziehen Sie den Katheter langsam zurück und anschließend messen und notieren Sie sich die Werte für sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 und dRVP2, auf dem Nacht Monitor angezeigt. </li><li> Wenn in der RV, leicht die Kanüle und Katheter zurückziehen zu messen die mittlere Druck im rechten Vorhof (RAP). Die Kurve sollte die RAP - Kurve in 2A entsprechen. NEINTE: In diesem Protokoll werden die Ratten nach der Katheterisierung Protokoll durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens während der Narkose eingeschläfert. </li></ol></li></ol> 6. Morphologie Beurteilung und Morphometry HINWEIS: In diesem Protokoll wird das Tier durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens, während sie unter Anästhesie eingeschläfert. Ratten in jeder Phase der Progression der PAH und Steuerung kann in diesem Protokoll verwendet werden. <ol><li> Nach der Tötung nehmen die Lungen aus durch die Luftröhre etwa 5 mm über die bronchiale Bifurkation Schneiden und die Gefäße, die die Lunge zum Herzen zu verbinden. Setzen Sie die Lungen in kalter Kochsalzlösung. Präparieren Sie die linke Lunge. Schneiden Sie die linke Hauptbronchus an der Bifurkation. </li><li> Füllen eines 50-ml-Spritze mit 4% Paraformaldehyd, ein Rohr mit einer Kanüle an der Spritze befestigen, und hängen die Spritze über einen Meter über dem Arbeitstisch. Setzen Sie die Kanüle in der linken Hauptbronchus zu passiv in die Lunge mit Paraformaldehyd zu füllen.Griff Paraformaldehyd mit Vorsicht zu genießen. </li><li> Inkubieren Sie die linke Lunge in Paraformaldehyd für 48 Stunden. </li><li> Dehydratisieren der linken Lunge von sie nacheinander in 70% Ethanol (1 h), 80% Ethanol (1 h), 90% Ethanol (1 h), 100% Ethanol (3 h), Xylol (2 h) Inkubieren und Paraffin ( 2 h). </li><li> Einbetten der linken Lunge in Paraffin, mit dem Lungenhilus die Kassette zugewandt ist. </li><li> Stain , die in Paraffin eingebettet, 4 um Lungenschnitten unter Verwendung eines Verhoeff oder Elastica-van Gieson - Färbung, als den Anweisungen des Herstellers 29. Stellen Sie sicher , dass die elastischen Schichten sind gut differenziert (wie in Abbildung 3). Scannen Sie die gefärbten Schnitten bei 40-facher Vergrößerung. </li><li> Teilen Sie die Lunge in vier Quadranten. In jedem Quadranten finden 10 Schiffe mit einem äußeren Durchmesser von &lt;50 &amp; mgr; m (intra-acinar) und 10 Schiffe mit einem Außendurchmesser von&gt; 50 &amp; mgr; m (pre-acinar). Machen Sie ein Foto (2 x 40 Bilder pro Lunge). Zoom in zufällig bis zu 20-facher Vergrößerung und zu fotografieren jedes Schiffin diesem Blickfeld Selektionsbias zu minimieren. </li><li> Ausschließen Schiffe, die eine längste / kürzeste Durchmesser-Verhältnis von&gt; 2, eine unvollständige Kreisform, oder einen Zusammenbruch von mehr als einem Viertel der Gefäßwand haben. Hinweis: Ein Beispiel für ein ausgeschlossen Schiff ist in Abbildung jedes Bild 3b Stellen auf der gleichen Vergrößerung (40X) und eine Skala , Bar. </li><li> Öffnen Sie ImageJ und das erste Bild. Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste im Bild der Skala einstellen über &quot;Analyse&quot; und &quot;Set - Skala.&quot; Für &quot;bekannte Strecke&quot; , verwenden Sie den Wert auf der Skala bar Fotos hoch . Verwenden Mikrometer (&amp; mgr; m) als die Längeneinheit. Stellen Sie die Skala auf globaler Ebene. </li><li> Mit &quot;freihändig Auswahlen&quot; ziehen Sie eine Linie auf dem inneren Rand des luminalen Bereich (Abbildung 3), und verwenden &quot;messen&quot; (Crtl m) diesen Bereich zu messen. Dann ziehen Sie eine Linie um den äußeren elastic Lamina (Abbildung 3) , um den gesamten Gefäßbereich zu messen. </li><li> Berechne den luminalen und Außendurchmesser ( <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq1.jpg" /> ) unter Verwendung von <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq2.jpg" /> . </li><li> Berechnen Wandstärke unter Verwendung von <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq3.jpg" /> . </li><li> Berechnen Sie die Wand / Lumen-Verhältnis unter Verwendung von <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq4.jpg" /> . </li><li> Berechnen Sie die Okklusion-Score <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq5.jpg" /> . </li><li> Ergebnis , das Schiff auf Muskularisierung (nein, teilweise oder total Muskularisierung) (3B). HINWEIS: Gefäße mit einem Doppel Elastica für mehr als die Hälfte des Umfangs definiert sind als vollkommen muskularisierten. Schiffe, die mit einem doppelten Elastica weniger als die Hälfte des Umfangs definiert sind, wie teilweise muskularisierten. </li><li> Ergebnis, das Schiff auf der Anwesenheit eines neointima (ja oder nein) (3C). HINWEIS: Die Schiffe ohne klar definierte interne elastische Lamina kombiniert mit (oft exzentrisch) Luminal Okklusion als neointimale Läsionen definiert. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Verfahren beschreibt das chirurgische Verfahren eines aorto-Kava-Shunt bei Ratten mit MCT vorbehandelt strömungsinduzierten PAH und die Techniken zu schaffen, das Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu bewerten, die PAH und dieses Modell zu charakterisieren. Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls und Fehlerbehebung Chirurgie und nach der Operation. Während der aorto-Kava-Shunt-Chirurgie, der wichtigste Schritt ist die Dissektion der...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein reproduzierbares Modell für schwere, strömungsinduzierten pulmonaler arterieller Hypertonie in Ratten zu erzeugen und ihr Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu messen. Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist ein klinisches Syndrom, das eine progressive Zunahme des pulmonalen Gefässwiderstands führt zu Rechtsherzversagen und Tod umfasst. Innerhalb des übergeordneten Krankheitsspektrum der Lungenbluthochdruckerkrankungen (PH) ist PAH die schwerste Form und eine , die 1 ohne Heilung bleibt. Die zugrunde liegende Arteriopathie in PAH wird durch eine typische Form der Gefäßumbau gekennzeichnet, dass das Gefäßlumen verschliesst. Muskularisierung von normalen , nicht muskularisierte Gefäße und Hypertrophie des medialen Gefäßschicht als frühe Krankheitserscheinungen bei PAH angesehen werden, werden auch in anderen Formen der PH 2 und sind gedacht , gesehen 3 reversibel. Als PAH eindvances beginnt die Intima - Schicht umzubauen, schließlich charakteristische neointimalen Läsionen bilden 2. Neointima-Typ pulmonalen Gefäßumbau ist exklusiv für PAH und wird derzeit unumkehrbar 4 zu betrachten. Als PAH eine seltene Krankheit ist, geht in seiner pathobiologischen Verständnis und Entwicklung von neuartigen Therapien haben sich stark auf Tiermodelle verlassen. Die monocrotalin (MCT) Modell bei Ratten ist ein einfaches Single - Hit - Modell , das war und ist immer noch, häufig verwendet. MCT ist ein Toxin , die eine Schädigung der Lungen Arteriolen und regionalen Entzündung 5 verursacht. 60 mg / kg MCT führt zu einer Erhöhung des mittleren Lungenarteriendruck (mPAP), pulmonaler vaskulärer Widerstand (PVR) und rechte ventrikuläre Hypertrophie (RVH) nach 3 - 4 Wochen 6. Die Histomorphologie wird durch isolierte mediale Hypertrophie ohne neointimalen Läsionen 5 gekennzeichnet. Der MCTso Rattenmodell stellt eine moderate Form von PH, und nicht die PAH, obwohl es allgemein als das letztere präsentiert wird. Bei Kindern mit PAH in Verbindung mit angeborenem Links-Rechts - Shunt (PAH-CHD), erhöhte Lungenblutung als wesentliche Auslöser für die Entwicklung der neointimalen Läsionen 7, 8, 9 betrachtet wird. Bei Ratten erhöhte Lungenblutfluss kann durch die Schaffung eines Shunt zwischen der abdominalen Aorta und Vena cava, eine Technik erstmals 1990 beschrieben , 10 induziert werden. Alternativen erhöht zu schaffen Lungenfluss sind durch einseitige pneumonectomy oder durch subclavian zu Lungenarterie Anastomose 11. Conceptual Nachteile dieser Modelle bestehen aus Potentialausgleichs Wachstum der verbleibenden Lunge und adaptive Signalweg-Aktivierung durch die pneumonectomy induziert oder der iatrogenen Schädigung des Lungengefäßsystems durchzu Lungenarterie Anastomose, verwirrende sowohl die Auswirkungen der erhöhten Lungenblutung. Wenn ein aorto-Kava-Shunt erzeugt und Lungenblutung erhöht wird als ein zweiter Treffer in MCT-behandelten Ratten induziert, treten charakteristische neointimalen Läsionen und eine schwere Form der PAH und Rechtsherzversagen assoziiert (RVF) entwickeln 3 Wochen nach der erhöhten 12 strömen. Die hämodynamische Progression von PAH in diesem Modell kann in vivo durch Echokardiographie und Rechtsherzkatheter zu beurteilen. Das vaskuläre Histomorphologie, Gefäßwanddicke, dem Grad der arteriolar Okklusion und Parameter für Rechtsherzversagen bilden die Säulen der ex vivo Charakterisierung von PAH. Diese Methode beschreibt detaillierte Protokolle für die aorto-Kava-Shunt (AC-Shunt) Chirurgie, Rechtsherzkatheter und qualitative und quantitative Bewertung der vaskulären Histomorphologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Shunt Surgery</td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears Augensalbe</td><td>Alcon</td><td>10380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorid-Hexidin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histoacryllischer Gewebekleber</td><td>B. Braun Medical</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 Nähte schwarz nicht resorbierbar</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Safil 4-0 Nähte violett resorbierbar</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel</td><td>Luer</td><td>NN1838R</td><td>BD-Spitze in 45 Grad Öffnung nach außen gebogen</td></tr><tr><td>Gazen 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Temgesic Buprenorphin</td><td>RB Pharmaceuticals</td><td>5429</td><td>subkutan Injektion</td></tr><tr><td>Natriumchlorid 0,9%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beatmungsmaske Ratte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biemer Klemme 18 mm, 5 mm Öffnung &nbsp;</td><td><ein href="https://www.google.nl/url?sa=i&amp; rct=j& q=& esrc=s& Quelle=Bilder& cd=& cad=rja& uact=8& ved=0ahUKEwitqICpkITNAhWiL8AKHe6iCC8QjhwIBQ& url=http%3A%2F%2Fwww.agnthos.se%2Fquote%2Fquote%2Fcaturl%2Fid%2F242%2FBiemer& psig=AFQjCNEnfRXuMQ6Doi4_-2KMYu3qeRovMA& ust=1464777707579746">AgnTho</a></td><td>64-562</td><td></td></tr><tr><td>Heizmatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kocher Klemme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasiermaschine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Rechtsherzkatheterisierung</td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Duratears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorid-Hexidin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gazen 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 Nähte schwarz nicht resorbierbar</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Nadel 20 G</td><td>Luer</td><td></td><td>Tip leicht nach innen gebogen</td></tr><tr><td>Kanüle 20 G</td><td>Luer</td><td></td><td>zum Einbringen des Katheters, Spitze in 20 Grad vorgeformt</td></tr><tr><td>Silastic Katheter 15 cm lang</td><td></td><td></td><td>0,5 mm Kugel 2 mm von der Spitze</td></tr><tr><td>Druckwandler</td><td>Ailtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bedside Monitor Cardiocap/5</td><td>Datex-Ohmeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasiermaschine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid 0,9%</td><td></td><td></td><td>zum Spülen</td></tr><tr><td colspan="4">Vascular Morphology</td></tr><tr><td>50 mL Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G Kanüle mit Schlauch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verhoef Färbeset</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><ein href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&amp; region=NL">HT254</a></td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Digitaler Diascanner</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastic (Bindegewebsfleck)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150667</td><td>http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html 
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(Webseite).pdf</td></tr></tbody></table>

shunt-chirurgie, rechtsherzkatheter und gefäß morphometry in einem rattenmodell für durchfluss-induzierte pulmonale arterielle hypertonie

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

In diesem Protokoll wird PAH durch die Kombination einer 60 mg/kg Monocrotalin (MCT) Injektion mit erhöhtem pulmonalem Blutfluss durch einen Aorto-Kaval-Shunt (MCT+Flow) induziert. Der Shunt wird erzeugt, indem eine 18-G-Nadel aus der Bauchschlagader in die benachbarte Kavalvene eingeführt wird. Es wurde gezeigt, dass ein erhöhter pulmonaler Fluss ein wesentlicher Auslöser für eine schwere Form der PAH mit unterschiedlichen Phasen des Fortschreitens der Erkrankung ist, die durch eine frühe mediale Hypertrophie gefolgt von neointimalen Läsionen und dem fortschreitenden Verschluss der kleinen Lungengefäße gekennzeichnet ist. Um die Hämodynamik des rechten Herzens und der Lunge in diesem Modell zu messen, wird die Rechtsherzkatheteruntersuchung durchgeführt, indem eine starre Kanüle mit einem flexiblen Kugelkatheter über die rechte Halsvene in den rechten Ventrikel eingeführt wird. Anschließend wird der Katheter in die Haupt- und die distalere Lungenarterie vorgeschoben. Die Histopathologie des Lungengefäßsystems wird qualitativ beurteilt, indem die prä- und intraazinären Gefäße nach dem Grad der Bemuskelung und dem Vorhandensein einer Neointima bewertet werden, und quantitativ durch die Messung der Wanddicke, der Wand-Lumen-Verhältnisse und des Okklusionsscores.

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, Merkmale von MCT + FLOW in Lewis-Ratten in den folgenden Gruppen: Kontrolle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) und MF-RVF ( n = 10). Statistische Analysen wurden unter Verwendung der ANOVA Einweg mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt. 60 mg / kg MCT und erhöhter Lungenblutfluss führen zu einem durchsch...

Dieses Protokoll beschreibt ein chirurgisches Verfahren zur Erstellung eines Modells für flussinduzierte pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) bei Ratten und die Verfahren zur Analyse der wichtigsten hämodynamischen und histologischen Endpunkte in diesem Modell.

Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäß Morphometry in einem Rattenmodell für Durchfluss-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, ein Modell für die flussinduzierte pulmonale arterielle Hypertonie bei Ratten zu erstellen und ihre wichtigsten hämodynamischen und histologischen Endpunkte durch Rechtsherzkatheterisierung und Gefäßmorphometrie zu analysieren. Wir stellen die Erstellung eines Rattenmodells für flussassoziierte pulmonale Hypertonie vor, das durch einen neuen vaskulären Umbau vom Intimaltyp ähnlich der humanen pulmonalen arteriellen Hypertonie gekennzeichnet ist und durch einen klinisch gut anerkannten Auslöser, nämlich einen erhöhten pulmonalen Blutfluss, induziert wird. Diese Eigenschaften werden die Übertragbarkeit der Erkenntnisse aus diesem Modell auf die menschliche Krankheit verbessern.Wir zeigen auch standardisierte Methoden zur hämodynamischen Bewertung und Charakterisierung der Histopathologie mittels quantitativer Morphometrie. Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Entdeckung und Bewertung neuartiger Behandlungsstrategien und ermöglichen die Bewertung der spezifischen Auswirkungen auf die pulmonale Hämodynamik und die Gefäßmorphologie. Die Verfahren werden von Annemieke Smit-Van Oosten und Michel Weij, Mikrochirurgen dieses Labors, vorgeführt.Vor Beginn der Operation schrubben Sie die Haut einer anästhesierten Ratte zur Desinfektion mit Chloridhexaden und injizieren Sie Buprenorphin subkutan zur postoperativen Analgesie. Als nächstes machst du mit einer Schere einen Schnitt in der Mittellinie entlang des Bauches, der einen Zentimeter unterhalb des Zwerchfells beginnt und sich bis knapp über die Genitalien erstreckt. Übertragen Sie den Darm auf eine sterile Gaze, die mit 0,9 % Kochsalzlösung angefeuchtet ist, auf die linke Seite des Tieres und bedecken Sie das Organ mit einer feuchteren, sterilen Gaze.Verwenden Sie neue Tupfer, um die Membranen zu trennen, die die Bauchschlagader und die Hohlvene unterhalb des umgebenden Gewebes verbinden. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine Splitterzange, um das perivaskuläre Aortenfett direkt über der Bifurkation auf der rechten Seite der Aorta zu entfernen, in die die Nadel eingeführt wird. Trennen Sie dann die Aorta und die Hohlvene von zwei Millimetern oberhalb der Stelle, der Nadeleinstichstelle, um Platz für eine Beamerklemme zu schaffen.Legen Sie nun eine lose 5-O-Naht um die Aorta und platzieren Sie eine Kocher-Klemme auf der Naht, um Spannung auf die Ligatur oberhalb des Schnitts zu erzeugen. Platzieren Sie die Beamerklemme knapp oberhalb der Naht und verwenden Sie einen neuen Austausch, um die Hohlvene so distal wie möglich zu komprimieren, um den Fluss zu behindern. Biegen Sie dann eine 18-Gauge-Nadel in einen 45-Grad-Winkel, wobei die Fase nach außen zeigt, halten Sie die Nadel 90 Grad zum Tier und führen Sie die Nadelspitze in die Aorta direkt über der Bifurkation ein, wobei die Fase nach links zeigt.Präparieren Sie die Membranen, die die Aorta und die Hohlvene umschließen, gerade so weit, dass der Einführbereich für den Shunt gut sichtbar ist, da eine Überdissektion dazu führt, dass der Shunt undicht wird. Bewegen Sie die Spitze der Nadel nach links und führen Sie die Nadel in die Hohlvene ein, bis sie im Gefäß zu sehen ist. Um eine Thrombose zu verhindern, drücken Sie mit einem neuen Wattestäbchen das restliche Blut durch die Einstichstelle aus der Aorta und trocknen Sie den Bereich um den Shunt mit einer sterilen Gaze ab.Entfernen Sie die Nadel und tragen Sie sofort einen Tropfen Gewebekleber auf die Einstichstelle auf. Entfernen Sie dann die Klemme von der Aorta und lösen Sie die Ligatur an der Aorta promixal manuell zum Shunt. Die Hohlvene distal des Shunts sollte hellrot werden und Turbulenzen an der Shuntstelle erzeugen.Nachdem Sie den Shunt überprüft haben, führen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle zurück und verwenden Sie resorbierbare 4-0-Nähte, um die Muskel- und Hautschichten zu schließen. Beatmung des Tieres dann mit 100 % Sauerstoff für die Wiederherstellung der Anästhesie. Desinfizieren Sie bei der Rechtsherzkatheteruntersuchung den Hals mit Chloridhexaden und verwenden Sie eine Skalpellklinge mit der Nummer 10, um einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt in der rechten ventralen Seite des Halses vom rechten Schlüsselbein bis zum Unterkieferknochen zu machen.Verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop eine Schere, um das Gewebe zu spreizen, und ziehen Sie es dann mit einer Pinzette vorsichtig auseinander, bis die Halsvene zum Vorschein kommt. Präparieren Sie die Membranen um die Halsvene mit einer Splitterzange. Legen Sie dann eine lose 5-O-Naht um das Gefäß und kleben Sie die Ligatur mit der Beatmungsmaske zusammen, um die Spannung auf die Vene zu erhöhen.Platzieren Sie stromabwärts der Einstichstelle eine lose Ligatur um das Gefäß. Biegen Sie anschließend mit den Zangengriffen die Spitze einer 20-Gauge-Nadel leicht mit der Fase nach innen und führen Sie die Spitze der Nadel in die Vene ein. Legen Sie schnell eine Kanüle mit einem Katheter in das Gefäß und entfernen Sie die Nadel, indem Sie die nachgeschaltete Ligatur um die Kanüle schließen, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten.Führen Sie nun die Kanüle und den Katheter in die Halsvene und manövrieren Sie die Kanüle unter dem Schlüsselbein hindurch, um in den rechten Vorhof zu gelangen. Richten Sie die Spitze der Kanüle auf das Herz, um in den rechten Ventrikel einzudringen. Auf dem Monitor am Krankenbett sollte eine Druckkurve des rechten Ventrikels angezeigt werden.Wenn die Druckkurve des rechten Ventrikels konstant ist, notieren Sie den systolischen und diastolischen rechtsventrikulären Druck und manipulieren Sie die Spitze der Kanüle nach links und oben. Schieben Sie den Katheter innerhalb der Kanüle vor und schieben Sie den Katheter dann in die Lungenhauptarterie vor. Wenn die Druckkurve der Lungenarterie konstant ist, notieren Sie den systolischen, diastolischen und mittleren Lungenarteriendruck.Schieben Sie dann den Katheter innerhalb der Kanüle vor, bis sich die Kugel an der Spitze des Katheters in einer Lungenarterie verkeilt. Der Abfall der Druckkurve sollte auf dem Monitor am Krankenbett beobachtet werden. Wenn die Keildruckkurve konstant ist, zeichnen Sie den systolischen, diastolischen und mittleren Keildruck auf.Ziehen Sie dann den Katheter langsam zurück und erfassen Sie, geleitet von den Kurven auf dem bettseitigen Monitor, die jeweiligen Werte für PA- und RV-Druck. Wenn der Katheter den rechten Ventrikel erreicht, ziehen Sie die Kanüle und den Katheter leicht zurück und messen Sie den mittleren rechten Vorhofdruck. In diesem repräsentativen Experiment wird 28 Tage nach MCT-Verabreichung und einer erhöhten pulmonalen Durchblutung ein mittlerer Anstieg des systolischen rechten ventrikulären, der systolischen Pulmonalarterie und des mittleren pulmonalarterischen Drucks beobachtet.Das Verhältnis von rechtsventrikulärem, linksventrikulärem und septalem Gewicht nimmt ab dem 14. Tag nach der Behandlung bis zum Stadium des rechtsventrikulären Versagens signifikant zu, was auf eine Hypertrophie des rechten Ventrikels hinweist. Das Nass-Trocken-Verhältnis der Leber ist auch im Stadium des rechtsventrikulären Versagens signifikant erhöht, was auf ein Ödem der Leber sowie auf ein kongestives rechtsventrikuläres Versagen hinweist. Die Muskularisierung der interazinären Gefäße nimmt während des Fortschreitens der pulmonalarteriellen Hypertonie progressiv zu, wobei fast die Hälfte der Gefäße am Tag 14 nach der Behandlung in fast allen Arteriolen, die im Endstadium der Erkrankung muskularisiert sind, eine totale Muskelmasse aufweist.Darüber hinaus werden neo-intimale Läsionen erstmals am Tag 21 beobachtet, wobei etwa 65% aller Arteriolen am Ende des Krankheitsverlaufs eine neo-intimale Schicht aufweisen. Dies führt zu einem fortschreitenden Gefäßverschluss, bei dem im Endstadium der Erkrankung bis zu 60 % des Lumens verschlossen sind. Einmal gemeistert, können diese Techniken in 20 Minuten pro Technik abgeschlossen sein.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Echo-Kardiographie oder Druckvolumen-Looping durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur rechtsventrikulären Funktion zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pulmonalen arteriellen Hypertonie, um die Auswirkungen eines erhöhten Blutflusses auf das Lungengefäßsystem zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Modell für die flussinduzierte pulmonale arterielle Hypertonie bei Ratten erstellt und wie man seine wichtigsten hämodynamischen und histologischen Endpunkte analysiert.

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Medicine

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Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die echokardiographische Beurteilung der Rechtsherzgröße und Lungenhochdruck bei Mäusen. Die Anwendungen umfassen Phänotyp Bestimmung und Serienbewertung in transgenen und Toxin-induzierten Maus-Modellen der Kardiomyopathie und Lungengefäßerkrankung.

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Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine Erkrankung der Lungenarteriolen, die zu deren Obliteration und der Entwicklung eines rechtsventrikulären Versagens führt. Nagetiermodelle der PAH sind entscheidend für das Verständnis der Pathophysiologie der PAH. Hier zeigen wir die hämodynamische Charakterisierung mit Rechtsherzkatheterisierung und Echokardiographie bei Maus und Ratte.

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Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur Durchführung der mehrfachen intravenösen Bolusdosisverabreichung und invasiven hämodynamischen Überwachung bei Mäusen. Forscher können dieses Protokoll für zukünftiges therapeutisches Wirkstoff-Screening auf pulmonalarterielle Hypertonie verwenden.

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Die Rechtsherzinsuffizienz (RHF) ist gekennzeichnet durch eine rechtsseitige Herzdilatation und Hypertrophie, die zu ventrikulären und atrialen Fehlfunktionen führt. Herz-Lungen-Erkrankungen im Zusammenhang mit RHF gehen mit einem erhöhten Risiko für Herzrhythmusstörungen einher. In diesem Artikel wird ein standardisiertes Modell der durch Lungenarterienbanding induzierten RHF beschrieben, das mit einer verstärkten ventrikulären und atrialen Arrhythmogenese einhergeht.

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Die Präsentation detaillierter Methoden zur Bewertung der Funktion des rechten Ventrikels wird die Qualität und Zuverlässigkeit der Forschung zur pulmonalen Hypertonie verbessern, einen robusten Rahmen für zukünftige Studien bieten und die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Laboratorien verbessern.

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Das Protokoll bietet eine detaillierte Einführung in die Erfahrung der Anwendung der richtigen Herzkatheterisationsmethode zur Erkennung des Lungenarteriendrucks bei Ratten, was hilft, genauere Daten effizienter zu erhalten und die Erfolgsrate des Experiments zu verbessern. Diese Methode verbessert auch die Reproduzierbarkeit von Experimenten in verschiedenen Laboren.

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Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäß Morphometry in einem Rattenmodell für Durchfluss-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie (Video) | JoVE Journal

Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäß Morphometry in einem Rattenmodell für Durchfluss-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie

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