Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Umsetzung eines orthotopischen Modell des Nierenzellkarzinoms in immunkompetenten Mäusen liefert den Ermittler ein klinisch relevantes System durch das Vorhandensein einer primären Nierentumor und Lungenmetastasen im gleichen Tiere definiert. Dieses System kann verwendet werden , um präklinisch eine Vielzahl von Behandlungen in vivo zu testen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Etablierung von orthotopen Nierentumoren der Maus durch intrarenale Implantation von Tumorzellen zur Untersuchung des Tumorwachstums und der Metastasierung sowie der Wirksamkeit von Antitumortherapien. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der urologischen Onkologie beantworten, z. B. wie wirksam eine neuartige Therapie in einem präklinischen Modell für Nierenkrebs ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die intrarenale Tumorimplantation einen primären lungenmetastasierenden Nierentumor etabliert, der die Pathogenese des klinischen Nierenzellkarzinoms nachahmt.

Zur Vorbereitung der Renca-Tumorzellen wird zunächst die Zellkultur mit 0,25%Trypsin und HBSS abgelöst, nachdem sie mit PBS gespült wurde. Neutralisieren Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit Complete RPMI Medium. Übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches Röhrchen und suspendieren Sie das Pellet wieder in frischem HBSS.

Nach der Zählung stellen Sie das Volumen auf zwei mal zehn für die Konzentration von sechs Zellen pro Milliliter in HBSS ein und ziehen Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Legen Sie anschließend ein steriles OP-Tuch über ein Heizkissen und bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenkneifen. Entfernen Sie die Haare von der linken Flanke der Maus und tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf.

Tupfen Sie dann die Implantationsstelle mit einem 5%igen Povidon-Jod-Antiseptikum ab und machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen einzigen Ein- bis eineinhalb Zentimeter großen Schnitt an der linken Flanke, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht in das Peritoneum eindringen. Trennen Sie mit einer Schere die Dermis vom Bauchfell und tupfen Sie die Inzisionsstelle mit steriler Baumwollgaze ab, um jegliches Blut zu entfernen. Fassen Sie dann mit der linken Hand den Kopf und stützen Sie mit der rechten Hand die Flanke, um die Milz durch das Bauchfell zu lokalisieren.

Berühren Sie die Maus mit einem Finger der rechten Hand von unten. Die Niere sollte sichtbar werden. Halten Sie das Tier fest im Griff, um das Peritoneum und die Niere unter Spannung zu setzen, und lassen Sie einen Assistenten langsam 0,1 Milliliter der Renca-Zellen durch das intakte Peritoneum in das Zentrum der Niere abgeben.

Halten Sie die Nadel fünf bis 10 Sekunden lang an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Zellen zu reduzieren. Verschließen Sie dann den Einschnitt mit einer dünnen Schicht Cyanacrylat-Gewebekleber. Am experimentellen Endpunkt machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in der Mittellinie, beginnend in der Mitte des Bauches durch den Brustkorb, den Hals und die Speicheldrüsen.

Entfernen Sie mit Schere und Pinzette vorsichtig die Rippen, ohne das Lungengewebe zu beeinträchtigen, und entfernen Sie das Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen. Füllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 10% Tusche und PBS. Fädeln Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig eine Seidennaht unter die Luftröhre und binden Sie dann einen losen Knoten.

Führen Sie dann die Nadel vorsichtig in die Luftröhre ein und blasen Sie die Lunge langsam mit ein bis eineinhalb Millilitern der Tuschelösung auf. Ziehen Sie den Knoten fest um die Luftröhre, um den Rückfluss der Tinte zu hemmen, entfernen Sie dann die Nadel und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe ab, um die aufgeblähte Lunge zu entfernen. Die Lunge wird in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Fekete-Lösung in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur fixiert.

Nach 24 bis 48 Stunden entfernen Sie die intakten, entfärbten Lungen und ziehen die Lappen vorsichtig in einer 35 x 10 Millimeter großen Petrischale auseinander. Zählen Sie dann die Anzahl der weißen Tumorknötchen unter einem Präpariermikroskop. Eine erfolgreiche intrarenale Renca-Zellimplantation in der Maus führt zur Tumorentwicklung in der Niere und zur Metastasierung in die Lunge bei tumortragenden Tieren, was eine robuste Tumorlast zeigt, gemessen am erhöhten Gewicht der tumorimplantierten Nieren.

Wie beobachtet, können Renca-Tumoren durch immunhistochemische Färbung für Cytokeratin 8 und 18 identifiziert werden. Die Implantation einer Luciferase-exprimierenden Renca-Zelllinie ermöglicht die Verfolgung der Tumorlast in der Niere und der Metastasierung in die Lunge durch biolumineszierende Bildgebung, wie durch die indische Verbindung Lungeninflation weiter bestätigt wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als fünf Minuten pro Maus abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Niere durch das Peritoneum eindeutig zu identifizieren, um eine genaue intrarenale Tumorimplantation zu gewährleisten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. präklinische Wirkstofftests, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. inwiefern ein neuartiges Medikament das Wachstum oder die Metastasierung von intrarenalen Tumoren beeinflusst? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine intrarenale Tumorzellimplantation zur Etablierung orthotoper Nierentumoren in der Maus durchführen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Tieren und chirurgischen Instrumenten gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Befolgen der Richtlinien für den Umgang mit Tieren in Einrichtungen und die Aufrechterhaltung eines sterilen Operationsbereichs und von sterilen Instrumenten.