Name: Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Lernen Sie die orthotope Implantation von Renca-Tumorzellen in die Niere immunkompetenter Mäuse zur Untersuchung von Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell ermöglicht die quantitative Bewertung präklinischer Therapien.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (R15CA173657 zu AW und R01CA109446 zu TSG) unterstützt, die Simmons Cancer Institute (AW) und die University of Minnestoa Climb 4 Kidney Cancer Foundation (TSG). Wir danken Dr. Kristin Anderson für die Unterstützung bei der Immunofluoreszenz.

Das folgende Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren zum Induzieren und Überwachen des Wachstums von experimentellen orthotopischen Nierentumoren und möglichen spontaner Metastasen. Alle folgenden Verfahren werden in Einklang mit dem institutionellen Richtlinien und anerkannten Verfahren im Hinblick auf die humane Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. 1. Wartung von Zelllinien <ol><li> Pflegen murine renal-Adenokarzinom-Zelllinie, Renca, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert, 1% Penicillin-Streptomycin und 1 mM jeweils von nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin und Natriumpyruvat (als komplettes RPMI bezeichnet). Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Wie bei jeder etablierten Zelllinie, ist es empfehlenswert, niedrige Passage-Nummer Renca-Zellen für die Transfektion und nachfolgende Implantation zu verwenden, um alle phänotypischen oder genetische Veränderungen zu minimieren, die nach Langzeit Kult auftreten könntenure. <ol><li> Verwenden, um ein Transposon-System Renca-Zellen zu konstruieren, in stabiler Weise der grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Glühwürmchen-Luciferase zu exprimieren. <ol><li> Verwendung eine kationischen Liposomen basierende Transfektionsreagenz, co-transfizieren Renca-Zellen mit einem Transposase-Expressionsvektor (pPGK-SB11) und eine Transposon-Vektor-Codierung für die Expression der Firefly Luciferase, sowie eine Fusions-Gen-Kodierung für GFP und die Zeocin-Resistenz-Gene , die beide unter der transkriptionellen Kontrolle eines bidirektionalen Promotor (PKT2 / Lubig) 19. </li><li> Zwei Tage später Platte der transfizierten Zellen bei einer Grenzverdünnung und damit die Zellen expandieren in komplettem RPMI mit Zeocin ergänzt (300 ug / ml). Bestätigen GFP-Expression in jedem Klon mittels Durchflusszytometrie. Diese Zellen werden Renca-GL bezeichnet. HINWEIS: Die Begrenzung Verdünnung Klonen die ausgewählten Zellen erlauben, aus einer einzelnen Zelle abgeleitet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Einzupflanzen i Renca-Zellen intrarenally, bereiten Renca-Zellennto einer Einzelzellsuspension bei 2 x 10 6 Zellen / ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). <ol><li> Entfernen anhaftende Renca-Zellen aus dem Gewebekulturflasche unter Verwendung von 0,25% Trypsin in HBSS. Nach ~ 5 min, fügen kompletten RPMI in den Kolben um das Trypsin und übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen zum Waschen zu neutralisieren. Zentrifuge die Zellen bei 300 g Relativzentrifugalbeschleunigung Kraft (RCF xg) für 5 min bei 25 ° C. </li><li> Man dekantiert den Überstand und die Zellen in HBSS. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und die Lautstärke mit HBSS , um 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Zeichnen Sie die Zellen in eine 1-ml-Spritze, ausgestattet mit einer 18-Gauge-Nadel Scherspannung auf den Zellen zu verhindern. Ersetzen die 18-Gauge-Nadel mit einer 28-Gauge-Nadel vor der Injektion der Tumorzellen. Eine Injektion von 0,1 mL liefert 2 x 10 5 Zellen in der Niere. </li></ol></li></ol> 2. OP-Bereich Vorbereitung <ol><li> Vorbereiten eines sterilen chirurgischenGebiet in einem biologischen Sicherheit Kabinett durch ein steriles chirurgisches Abdecktuch über ein Heizkissen platzieren. Sammeln Sie alle Verbrauchsmaterialien, einschließlich Pinzetten, Skalpell, Schere, Augentropfen, 5% Povidon-Jod antiseptisch, und sterile Gaze. Autoclave alle Instrumente vor dem Gebrauch. </li><li> Führen Sie die Operation eine aseptische Spitzentechnik. Resterilisieren Instrumente zwischen den Tieren mit einem Wulst Sterilisator. Tragen sterile Handschuhe, einen Laborkittel und eine Gesichtsmaske. </li></ol> 3. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Anesthetize die Mäuse mit Ketamin / Xylazin (87,5 mg / kg und 12,5 mg / kg bzw. ip) nach institutionellen Richtlinien. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch eine Zehen Prise durchführen. </li><li> Wenn das Tier nicht reagiert , in Betracht gezogen, bereitet die Injektionsstelle (zB linke Flanke) an Balb / c - Mäusen durch Rupfen (mit Fingern) oder Rasieren (mit Clippers) , um das Fell. </li><li> Bewegen , um die Mäuse vor der Operation Vorbereitungsbereich (zB der Gehäusekäfig) zu dem Operationsbereich und wenden vet Salbe auf demAugen Trockenheit zu verhindern. Liberally Tupfer die vorbereitete Inzisionsstelle mit 5% Povidon-Jod antiseptisch. </li><li> Einzuspritzen Bupivacain-Hydrochlorid (0,1 ml einer 2,5 mg / ml Lösung, sc) in den Bereich, wo der Schnitt wird als präoperative Analgesie durchgeführt werden. </li><li> Führe einen einzigen Einschnitt (~ 1,0 bis 1,5 cm) auf der linken Flanke des Tieres ein steriles Skalpell oder eine Schere vorsichtig, um nicht das Peritoneum zu durchdringen. Trenne die Dermis aus dem Peritoneum mit einer sterilen Schere. Dab die Inzisionsstelle mit sterilen Baumwollgaze kein Blut zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Maus mit beiden Händen, die linke Hand mit dem Kopf und die rechte Hand zu halten, um die Flanke zu unterstützen. </li><li> Identifizieren der Milz durch das Peritoneum und mit einem Finger der rechten Hand, palpiert die Maus von unten; sein die Niere sollte nun sichtbar durch das Peritoneum. Halten Sie einen festen Halt des Tieres Spannung durch das Peritoneum und Niere zu liefern. </li><li> Eine zweite Person soll den Tumor ce injizierenLLS (hergestellt in Abschnitt 1.2.) durch die intakte Peritoneum in die Mitte der Niere einer 1-ml-Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel ausgerüstet werden. Liefert langsam 0,1 ml (2 x 10 5) der Zellen. Sobald die Zellen injiziert werden, hält die Nadel an Ort und Stelle für die von 5 bis 10 s um den Rückfluss von Zellen zu reduzieren. Es ist wichtig, die Notwendigkeit extreme Vorsicht bei diesem Schritt zu beachten, da die Person, die die Zellen injizieren wird die Nadel in unmittelbare Nähe zu den Fingern der Person bringt die Maus hält. </li><li> Entfernen Sie die Nadel und Schließen des Einschnitts mit einer dünnen Schicht aus Cyanoacrylatkleber. </li><li> Legen Sie das Tier wieder in einen sauberen Käfig mit einem sterilen Papiertuch. Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen. Lassen Sie nicht die unbeaufsichtigten Tiere während der Erholungsphase. Die Tiere nicht zur Standardwohnbedingungen zurück, bis sie aufrecht und sternalen sind. Folgen Sie Richtlinien des Instituts in allen Verfahren unter Verwendung von Labortieren. </li></ol> 4. BioLeucht Imaging <ol><li> Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung. HINWEIS: Verfahrensdetails für Biolumineszenz - Bildgebung durchführen können von Lim et al erhalten werden. 20 Das Luciferase - Signal kann bereits 24 h nach der Tumorzellimplantation nachgewiesen werden. Da es kein von außen sichtbarer Tumor in diesem Modell ist, ist es wichtig, das Tumorwachstum regelmäßig zu überwachen. Je nach geplantes Experiment kann orthotopen Tumorwachstum gehen für längere oder kürzere Zeiträume. Ein Vorteil der Verwendung der Luciferase-exprimierenden Renca-Zellen besteht darin, dass das Tumorwachstum kann wiederholt im gleichen Tiere in regelmäßigen Abständen für die Dauer des Experiments überwacht werden, und eine spezifische Abfrage von tumortragenden und tumorfreien Organen kann an einen getan werden definierten Endpunkt. <ol><li> Einzuspritzen Luciferin (0,1 ml einer 15 mg / ml-Lösung in sterilem PBS) ip und läßt es für 10 Minuten zirkulieren, bevor die Maus in das Biolumineszenz-Abbildungssystem setzt. Legen Sie den mo<html> verwenden, um mit seiner dorsalen Seite nach oben gerollt leicht auf der Seite, um nach oben zeigt die injizierte Niere zu haben. </li><li> Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten Bereichs von Interesse (ROI) unter Verwendung der Bildanalyse-Software. </li></ol></li><li> Die quantitative Bestimmung der Tumorlast in einzelnen Organen. HINWEIS: Die quantitative Bestimmung kann zu bestimmten Zeitpunkten in einzelnen Organen nach der Entfernung aus eingeschläfert Mäusen durchgeführt werden. <ol><li> Injizieren Sie die Mäuse mit Luciferin, wie in Schritt 4.1. </li><li> Nach 10 min einschläfern die Mäuse ein genehmigtes Verfahren. </li><li> Seziert die Organe von Interesse (zB, die Nieren und die Lunge, siehe Abschnitt 5). Übertragen, um das Gewebe zu 35 x 10 mm-Petrischalen und legen sie in das Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. </li><li> Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten ROI unter Verwendung von Bildanalysesoftware. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. Organ-Ernte <ol><li> Zu einem definierten Endpunkt für das einzelne Experiment euthanize tumortragenden Mäuse gemäß bevorzugte institutionellen Richtlinien (zB CO 2, zervikale Dislokation, Anästhesie - Überdosis). Allerdings vermeiden Zervikaldislokation wenn Lungen nach Tusche Inflation werden gesammelt sind. </li><li> Führen Sie eine grobe Bewertung des primären Nierentumorwachstums in der injizierten Niere durch das nasse Organgewicht zu messen. <ol><li> Um die Tumormasse zu bestimmen (in g), Isolat 21 und wiegt die tumortragenden Niere und die kontralaterale Niere von der gleichen Maus, wo der Unterschied in Nierengewicht die Tumormasse definiert. seziert sorgfältig all Fremd Bindegewebe aus den ausgeschnittenen Nieren entfernt, bevor sie ihre Gewichte zu messen. </li></ol></li><li> Beurteilen Sie den Grad der Tumormetastasierung in die Lunge durch die Lungen mit Tusche Aufblasen vor der Exzision und sofort zur Festsetzung der Lunge in Fekete-Lösunglass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Manuelle Berechnung der metastatischen Läsionen auf der Lungenoberfläche kann dann durchgeführt werden. <ol><li> Machen Sie einen Mittelschnitt mit einer Schere in der Mitte Bauch, durch den Brustkorb, und nach oben durch die Hals / Speicheldrüsen beginnen. den Brustkorb Schere und Pinzette, ohne die Verwendung von Lungengewebe sorgfältig entfernen. </li><li> Setzen Sie die Luftröhre durch das Bindegewebe zu entfernen. </li><li> Bereiten eine 3 ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel mit 10% Tusche Lösung in HBSS gefüllt. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig fädelt eine Seidennaht unter der Trachea. Dies wird verwendet werden, um die Luftröhre abzubinden einmal aufgeblasen. </li><li> Schieben Sie die Nadel nach unten die Luftröhre und drücken Sie langsam die Spritze in die Lunge mit der Tusch Lösung aufzublasen. Etwa 1 bis 1,5 ml Tusch Lösung wird vollständig in die Lunge aufzublasen. </li><li> Pinch die Trachea verschlossen durch mehrere Knoten zu binden, mit der Naht unter der Nadel um den Rückfluss der Tinte zu hemmen. </li><li> Remove die Nadel und sorgfältig das Bindegewebe wegschneiden die aufgeblähte Lunge zu entfernen. </li><li> In einem Laborabzug, legen die Lungen in eine 15 ml konischen Röhre 5 ml Fekete-Lösung enthält (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml Formaldehyd und 2,5 ml Eisessig in eine 100 ml Glasflasche) 23. </li><li> Lassen Sie die Lungen beheben / destain für 24 bis 48 h bei Raumtemperatur vor manuell auf den entfärbten Tumorknötchen zu zählen. </li><li> Entfernen Sie die intakte Lunge nach Entfärben und sorgfältig die festen Lungen durch Lappens in einem 35 x 10 mm Petrischale sezieren. Zähle die Anzahl der Tumorknoten (weißen Knötchen) auf jeden Lappen unter einem Binokular. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Wir präsentieren ein Protokoll für ein orthotoper RCC Mausmodell. Implantation von Maus-Nieren-Adenokarzinom-Tumorzellen in der Maus Niere stellt ein klinisch relevantes Modell der mRCC. Dieses Modell führt zu einem Primärtumor in der Niere und die Fernmetastasen in der Lunge, die beiden Merkmale des fortgeschrittenen RCC sind. Die Beschreibung hierin präsentierte ist spezifisch für die Renca-Zelllinie in immunokompetenten Balb / c-Mäusen. Unter Verwendung dieses orthotopische Modell haben wir gezeigt , dass die Renca -...

Das Nierenzellkarzinom (RCC) ist für die Mehrzahl der bösartigen Nieren Neoplasmen und etwa 3% aller Erwachsenen malignen Erkrankungen weltweit 1, 2. Wegen dem Mangel an Symptomen, Fehldiagnose und unzureichende Screening - Tools für RCC, fast 30% der Patienten mit metastasierendem RCC (mRCC) zum Zeitpunkt der Diagnose, mit einem zusätzlichen 20 bis 30% der Patienten mit einem metastasierenden Stadium 2 voran präsentiert. Diese Fälle führen zu ~ 13.500 Todesfällen pro Jahr 1, 3. Obwohl frühere Erkennung und Behandlung von primären RCC verbessert haben, fährt die Rate der RCC-Todesfälle zu erhöhen, was darauf hindeutet , dass metastatische Erkrankung für die Mortalität 3 weitgehend verantwortlich ist. Therapieentwicklung für RCC hat sich in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung und Umsetzung von gezielten Therapien und Immuntherapien fortgeschritten. Leider progressionsfreie survival und das Gesamtüberleben von fortgeschrittenen Fällen sind immer noch gut unter 2 Jahren für die Mehrheit der Patienten 4, 5, 6. Diese Statistiken rechtfertigen die Notwendigkeit für die weitere Forschung in die Identifizierung und Entwicklung von wirksamen Behandlungen für RCC. angemessen zu therapeutischen Interventionen für mRCC, translational-relevanten vorklinischen Modellen der Krankheit voran zunächst erforderlich. Entwicklung einer relevanten und konsistentes Modell der menschlichen Zustand der fortgeschrittenen RCC rekapitulieren sollte einige wichtige Fragen beantworten: 1) Ist das Modell anatomisch relevant; 2) Ist den Tumorfortschritt ähnlich wie bei der menschlichen Pathologie; 3) Sind Metastasen aus dem Primärtumor entstehen; und 4) Kann primäre und metastatischen Tumorprogression im Laufe der Zeit überwacht werden? In Abhängigkeit von der Art der Behandlung untersucht, Maus RCC Tumorzellinien, menschliche Tumorzelllinien RCC und humanen RCC Patienten stamm xenogFlöße können bei immunkompetenten oder immungeschwächten Mäusen verwendet werden. Ein Wirt , der mit einem intakten und funktionalen Immunsystem ist für jene Studien erforderlich , einige Aspekte der Immuntherapie Auswertung, was die Verwendung der gut beschriebenen Renca Zelllinie aus einem spontanen renalen Adenokarzinom abgeleitet von Balb / c - Mäusen 7. Die meisten Studien injizieren Renca - Zellen subkutan (sc), die einen einfach zu messen lokalen Tumor bildet oder intravenös (iv) in Balb / c - Mäuse Versuch Lunge &quot;Metastasen&quot; zu erzeugen , 8, 9, 10, 11, 12. Verwendung eines sc-implantierten Tumor Renca menschliche RCC Modell hat eine Anzahl von Einschränkungen, einschließlich ungenauer Innervation Vaskulatur 13, Unterschiede in der Mikroumgebung , 14, 15, und ein Mangel an Organ- / Tumorzell Communication 13, 16. Zusätzlich metastasieren viele sc Tumoren (insbesondere Renca) nicht zu distalen Organen, die Untersuchung eines Ereignisses Hemmung , die ein gemeinsames klinisches Merkmal 17 ist. Zur Untersuchung mRCC können Renca-Zellen iv injiziert werden, um Tumorbelastung in der Lunge am primären Ort von Metastasen in RCC Patienten herzustellen. Die IV - Injektionsverfahren metastatischen Tumoren zu initiieren, jedoch erlaubt es nicht , die Untersuchung , wie, wann und warum die Zellen aus dem Primärorgan (dh die Niere) an den entfernten Ort migriert. Ein Modell mit sowohl primärer und metastatischen Krankheit offensichtlich im gleichen Tiere ist entscheidend für die Progression und Behandlung von fortgeschrittener Erkrankung zu untersuchen, besonders wenn man bedenkt, dass Metastasen typischerweise die Ursache für die Sterblichkeit bei diesen Patienten ist. Unser Labor hat ein Mausmodell für mRCC entwickelt, die oben umrissenen alle Funktionen enthält. Um festzustellen, primary, orthotopischen Tumoren werden Renca-Zellen direkt in die Niere des Tieres durch die transluzente Peritoneum implantiert. Ein kleiner Schnitt in der linken Flanke ermöglicht die Visualisierung der Milz (als Orientierungspunkt) und die linken Niere. Unter Verwendung einer kleinen Nadel, sind Renca-Tumorzellen für orthotopische Implantation direkt in die Niere durch das Peritoneum injiziert. Im Vergleich zu anderen Methoden der Renca - Zellen unter die Nierenkapsel 18 ist diese Methode der Implantation Implantation ermöglicht einen höheren Durchsatz, da es ziemlich nicht-invasive, nicht Vernähen erforderlich ist , ist eine niedrige Schmerz Klasse und ist zeitsparend , wenn geübt. Diese gut charakterisierten Modellergebnisse in reproduzierbarer Primärtumorbelastung (~ 99% Aufnahmerate) in der injizierten Niere sowie metastatischen Tumorbelastung in der Lunge. Die wesentlichen Vorteile dieses Modells sind seine syngenen Natur, für die Immuntherapie Untersuchungen zu ermöglichen; seine spontanen Metastasen, zu studieren, um eindvanced Krankheit; und seine orthotope Implantation, die anatomische Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf und die Behandlung zu modellieren. stark profitieren von der Nutzung dieses Modells während der präklinischen Entwicklung gezielt Therapien RCC auf Targeting würde.

<table><tbody><tr><td>Künstliche Tränen Augensalbe</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Gewebekleber</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Betadin-Lösung (Povidon-Jod, 5%)</td><td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Marcain (Bupivavain HCl-Injektion)</td><td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin &nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Ausgewogene Salze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dornröschen (SB) Transposon-System</td><td>Neuromics</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

ein syngenetische maus-modell von metastasierendem nierenzellkarzinom für quantitative und longitudinal beurteilung der vorklinischen therapien

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Das Nierenzellkarzinom (RCC) beeinflusst&gt; 60.000 Menschen in den Vereinigten Staaten jährlich und ~ 30% der RCC-Patienten hat mehrere Metastasen zum Zeitpunkt der Diagnose. Metastasierendem RCC (mRCC) unheilbar ist, mit einer medianen Überlebenszeit von 18 Monaten. Immune basierte Interventionen (zB Interferon (IFN) und Interleukin (IL) -2) induziert dauerhaft Reaktionen in einem Bruchteil mRCC Patienten, und Multi - Kinase - Inhibitoren (zB Sunitinib oder Sorafenib) oder anti-VEGF - Rezeptor - monoklonalen Antikörper (mAb) sind weitgehend palliativ, als komplette Remissionen sind selten. Solche Mängel in den derzeitigen Therapien für mRCC Patienten bieten die Gründe für die Entwicklung neuer Behandlungsprotokolle. Eine Schlüsselkomponente in der präklinischen Testung neuer Therapien für mRCC ist ein geeignetes Tiermodell. Vorteilhafte Merkmale, die die menschliche Erkrankung sind einen primären Nierentumor, Nierentumor Metastasen und ein intaktes Immunsystem zu untersuchen jede Therapie-driven immune effecto rekapitulierenr Reaktionen und die Bildung von tumorinduzierten immunsuppressiven Faktoren. Dieser Bericht beschreibt eine orthotoper mRCC Mausmodell, das alle diese Eigenschaften hat. Wir beschreiben eine intrarenalen Implantationstechnik der Mausnieren Adenokarzinom-Zelllinie unter Verwendung von Renca, gefolgt von der Beurteilung des Tumorwachstums in der Niere (primäre Standort) und die Lunge (metastatische Stelle).

<html> Die erfolgreiche Implantation von Renca-Zellen wird in der Niere und Metastasen in den Lungen der Mäuse bei der Tumorentstehung führen. Nach der Exzision der tumortragenden und den kontralateralen Nieren wurden Feuchttuchgewichte (g) gemessen , um die Tumorbelastung zu demonstrieren , basierend auf einem erhöhten Gewicht (Abbildung 1). Renca - Tumoren können durch Immunhistochemie durch Zytokeratin 8 und 18 Anfärbung (Figur 2) identifiziert werden....

Umsetzung eines orthotopischen Modell des Nierenzellkarzinoms in immunkompetenten Mäusen liefert den Ermittler ein klinisch relevantes System durch das Vorhandensein einer primären Nierentumor und Lungenmetastasen im gleichen Tiere definiert. Dieses System kann verwendet werden , um präklinisch eine Vielzahl von Behandlungen in vivo zu testen.

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der intrarenalen Implantation von Tumorzellen orthotopische Nierentumoren bei Mäusen zu erzeugen, um das Tumorwachstum und die Metastasierung sowie die Wirksamkeit von antitumoralen Therapien zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der urologischen Onkologie zu beantworten, beispielsweise wie wirksam eine neuartige Therapie in einem präklinischen Modell des Nierenkarzinoms ist. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass die intrarenale Tumorimplantation einen primären, lungemetastasierenden Nierentumor erzeugt, der der klinischen Pathogenese des Nierenzellkarzinoms nachahmt.Um die Renca-Tumorzellen vorzubereiten, lösen Sie zunächst die Zellkultur mit 0,25 % Trypsin und HBSS nach Spülen mit PBS ab. Neutralisieren Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit komplettem RPMI-Medium. Überführen Sie die Zellen in ein konisches Reagenzglas zur Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in frischem HBSS.Nach der Zellzählung das Volumen auf eine Konzentration von zwei mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter in HBSS einstellen und die Zellen in eine Eins-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Kanüle aufziehen. Als Nächstes ein steriles chirurgisches Tuch über eine Heizplatte legen und die angemessene Sedierungstiefe durch Zehenquetschung überprüfen. Das Fell von der linken Flanke der Maus entfernen und Augensalbe auf die Augen auftragen.Desinfizieren Sie anschließend die Implantationsstelle mit 5 % Povidon-Iod und führen Sie mit einem sterilen Skalpell einen einzelnen ein bis eineinhalb Zentimeter langen Schnitt in der linken Flanke durch, wobei darauf zu achten ist, dass die Bauchhöhle nicht durchstoßen wird. Trennen Sie mit einer Schere die Dermis von der Bauchhöhle und tupfen Sie die Schnittstelle mit steriler Watte, um etwaiges Blut zu entfernen. Greifen Sie dann mit der linken Hand den Kopf und stützen Sie die Flanke mit der rechten Hand, um die Milz durch die Bauchhöhle hindurch zu ertasten.Palpieren Sie die Maus mit einem Finger der rechten Hand von unten. Die Niere sollte sichtbar werden. Halten Sie das Tier fest, um eine Spannung über das Peritoneum und die Niere zu erzeugen, und lassen Sie einen Assistenten langsam 0,1 Milliliter der Renca-Zellen durch das intakte Peritoneum in die Mitte der Niere injizieren.Halten Sie die Nadel fünf bis zehn Sekunden lang an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Zellen zu verringern. Schließen Sie die Inzision anschließend mit einer dünnen Schicht aus Cyanoacrylat-Gewebeklebstoff. Zum experimentellen Endpunkt machen Sie mit einer Schere einen medianen Schnitt, beginnend im mittleren Bauchbereich über das Brustbein, den Hals bis hin zu den Speicheldrüsen.Entfernen Sie mithilfe von Schere und Pinzette vorsichtig die Rippen, ohne das Lungengewebe zu beschädigen, und entfernen Sie das Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen. Füllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 10 % Indiaink und PBS. Führen Sie dann mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig einen Seidenfaden unter die Luftröhre und knoten Sie eine lose Schleife.Als Nächstes führen Sie die Nadel vorsichtig in die Luftröhre ein und pumpen die Lungen langsam mit ein bis eineinhalb Milliliter der Tuschlösung auf. Ziehen Sie den Knoten fest um die Luftröhre, um das Zurückfließen der Tinte zu verhindern, entfernen Sie dann die Nadel und schneiden Sie das Bindegewebe vorsichtig ab, um die aufgepumpten Lungen zu entnehmen. Fixieren Sie die Lungen in einem 15-Milliliter-Kegelrohr, das fünf Milliliter Feketes Lösung enthält, im chemischen Abzug bei Raumtemperatur.Nach 24 bis 48 Stunden die intakten entfärbten Lungen entfernen und die Lappen vorsichtig in einer 35 mal 10 Millimeter großen Petrischale auseinanderziehen. Anschließend die Anzahl der weißen Tumorknoten unter einem Stereomikroskop zählen. Eine erfolgreiche intrarenale Implantation von Renca-Zellen bei Mäusen führt zur Tumorbildung in der Niere und Metastasierung in die Lunge, wobei die tumortragenden Tiere eine ausgeprägte Tumormasse aufweisen, gemessen am erhöhten Gewicht der tumorimplantierten Nieren.Wie beobachtet, können Renca-Tumoren durch immunhistochemische Färbung für Cytokeratin acht und 18 identifiziert werden. Die Implantation einer Renca-Zelllinie, die Luciferase exprimiert, ermöglicht die Verfolgung der Tumorlast in der Niere sowie von Lungenmetastasen mittels biolumineszenzbasierter Bildgebung, was durch die indische Tinten-Inflation der Lunge weiter bestätigt wird. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als fünf Minuten pro Maus abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Niere durch das Peritoneum klar zu identifizieren, um eine genaue intrarenales Tumorimplantation sicherzustellen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie präklinische Wirkstofftests, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise inwieweit ein neuartiger Wirkstoff das Wachstum oder die Metastasierung intrarenaler Tumore beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die intrarenales Tumorzellimplantation zur Erzeugung orthotoper Nierentumore bei der Maus durchgeführt wird.Beachten Sie, dass die Arbeit mit lebenden Tieren und chirurgischen Instrumenten gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie beispielsweise die Einhaltung der institutionellen Richtlinien zum Umgang mit Tieren sowie die Aufrechterhaltung eines sterilen chirurgischen Bereichs und steriler Instrumente, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video entwickeln wir ein orthotopes Mausmodell des Nierenzellkarzinoms. Dieses Modell führt zu reproduzierbaren Primärtumoren in der injizierten Niere und metastasierten Tumoren in der Lunge, was die Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der Behandlung ermöglicht.

Generierung eines Nierenzellkarzinommodells: Ein Protokoll zur Entwicklung eines orthotopen RCC-Mausmodells durch intrarenale Implantation von Krebszellen

Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Modelle der spontanen metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) den Krankheitsverlauf kann für die Bewertung Behandlungen in einer klinisch relevanten Einstellung verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt verschiedene Verfahren für orthotope Nierentumorzellimplantation, richtige Nephrektomie und schließlich skizziert eine Obduktion Führer für visuelle und Biolumineszenz-Scoring von metastasierendem Belastung und Lokalisierung.

Modellierung Spontane metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) in Mäusen nach Nephrektomie

Eine präklinische, Mausmodell der Lebermetastasen über eine hemispleen Injektionstechnik durchgeführt.

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums.

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

Metastasierendes blutestes Nierenzellkarzinom ist eine Krankheit ohne umfassendes Tiermodell für eine gründliche präklinische Untersuchung. Dieses Protokoll veranschaulicht zwei neuartige Tiermodelle für die Krankheit: das orthototisch implantierte Mausmodell und das Hähnchen-Chorioallanto-Membranmodell, die beide Lungenmetastasen zeigen, die klinischen Fällen ähneln.

Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Dies ist eine effektive Methode, um nach Suppressoren oder Treibern von Krebsmetastasen zu suchen. Zellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert werden, werden in das Gefäßsystem der Chorioallanto-Membran des Huhns injiziert, um metastatische Kolonien zu bilden. Kolonien mit verminderter oder erhöhter Invasivität werden herausgeschnitten, erweitert, neu injektiert, um ihren Phänotyp zu bestätigen, und schließlich mit Hochdurchsatzsequenzierung analysiert.

Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Eine große Herausforderung bei der Entwicklung neuer Therapien für Lungenkrebs besteht darin, die Mikroumgebung des Tumors zu modellieren, wenn die regionale Erkrankung zu einer metastasierenden Erkrankung fortschreitet. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Etablierung eines orthotopen syngenen Modells von Lungenkrebs, das eine In-vivo-Verfolgung der Krankheit im Zeitverlauf ermöglicht.

Eine minimalinvasive Methode zur Generierung eines syngenen orthotopen Mausmodells für Lungenkrebs

Lernen Sie die orthotope Implantation von Renca-Tumorzellen in die Niere immunkompetenter Mäuse zur Untersuchung von Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell ermöglicht die quantitative Bewertung präklinischer Therapien.

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Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

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