Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Auswirkungen von ergänzenden Nährstoffen in einem Mausmodell der durch Dextransulfat-Natrium induzierten Kolitis zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Darmimmunologie über die Entwicklung der klinischen Wissenschaft in der gesamten Richtung des Colitis-Modellexperiments zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie kostengünstig ist, keine ausgeklügelte Ausrüstung erfordert und eine klare Analyse der Morphologie des gesamten Dickdarms ermöglicht.

Diese Methode kann verwendet werden, um oxidativen Stress im Dickdarm als Folge einer übermäßigen Rekrutierung von Neutrophilen zu bewerten. Bei der Verabreichung von Nahrungsergänzungsmitteln über eine Sonde halten Sie die Maus zuerst manuell am Genick fest und platzieren Sie den Schwanz zwischen dem dritten Finger und der Basis des Daumens. Halten Sie dann die Maus in der aufrechten Position, führen Sie die Sondennadel in die linke Seite des Mauls des Tieres ein und folgen Sie vorsichtig dem Gaumen, um die Speiseröhre zu lokalisieren.

Wenn kein Widerstand auftritt, schieben Sie die Nadel in Richtung Magen. Geben Sie langsam das gesamte Volumen des Nahrungsergänzungsmittels ab, entfernen Sie die Spritze vorsichtig und messen Sie das Körpergewicht des Tieres. Weisen Sie eine Punktzahl von null bis vier entsprechend dem prozentualen Gewichtsverlust zu, entnehmen Sie dann eine frische Stuhlprobe und tragen Sie mit den bereitgestellten Applikatoren einen dünnen Abstrich der Probe auf einen Objektträger aus einem Testkit für okkultes Blut im Guajakstuhl auf.

Schließen Sie die Abdeckung an der Vorderseite des Kits und öffnen Sie das hintere Fenster, um zwei Tropfen der Entwicklerlösung auf die Rückseite der Probenstelle aufzutragen. Lesen Sie die Ergebnisse nach 30 Sekunden ab und weisen Sie je nach Signalstärke eine Punktzahl von null bis vier zu. Beobachten Sie dann eine zweite frische Stuhlprobe, um die Stuhlkonsistenz zu beurteilen, und weisen Sie gegebenenfalls eine Punktzahl von null bis vier zu.

Um die intestinale Epithelpermeabilität in vivo zu bestimmen, bringen Sie ein anästhesiertes Tier in Rückenlage und machen Sie einen Mittellinienschnitt, um den Darm freizulegen. Lokalisieren Sie den Blinddarm und machen Sie einen kleinen Schnitt im proximalen Segment der Dickdarm-Aszendenten. Führen Sie dann eine 22-Gauge-Zuführnadel ein und befestigen Sie die Nadel mit einer üblichen Seidenfadenligatur

Spülen Sie vorsichtig eine reichliche Menge PBS durch die Nadel, um den gesamten Kot aus dem Dickdarm zu spülen, gefolgt von der Installation der Evans-Blau-Lösung, bis der Farbstoff den Anus erreicht. Spülen Sie die Sonde nach 15 Minuten mit einem überschüssigen Volumen PBS, bis die perianale Auswaschung klar ist. Entfernen Sie dann den Dickdarm und spülen Sie das Gewebe mit mehr PBS, gefolgt von einem Milliliter sechs millimolaren N-Acetylcystein, um jeglichen Farbstoff zu entfernen, der am Dickdarmschleim haftet.

Schneiden Sie nun den Dickdarm in Längsrichtung ein und spülen Sie das Gewebe noch einmal mit PBS und N-Acetylcystein aus, erfassen Sie dann das Gewicht und die Länge des Dickdarms und legen Sie das Gewebe in zwei Milliliter N,N-Dimethylformamid bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren, um den restlichen Farbstoff zu extrahieren, wobei Sie am nächsten Morgen die Farbstoffkonzentrationen spektrophotometrisch bei 610 Nanometern messen. Nach sieben Tagen Dextransulfat-Natrium- oder DSS-induzierter Kolitis wird der gesamte Dickdarm präpariert und seine Länge aufgezeichnet. Bei Schweizer Brötchen öffnen Sie den Dickdarm in Längsrichtung, entfernen vorsichtig alle Fäkalien und rollen das Gewebe mit einem dünnen, runden Holzstab oder einer feinen Pinzette mit der Schleimhaut nach innen.

Legen Sie dann das Gewebe vorsichtig in eine Einbettkassette und fixieren Sie es anschließend mit fünf Millilitern 10%igem Formaldehyd bei Raumtemperatur. Es ist wichtig, den Dickdarm fest aufzurollen, ohne ihn zu falten, um Probleme bei der Gewebeschnittung zu vermeiden, die zu einer klinischen Gewebeschädigung und einer falschen Interpretation als Colitis-assoziierte Schädigung führen könnten. Waschen Sie die Probe nach 48 Stunden 18 Stunden lang mit Leitungswasser, gefolgt von einer Dehydrierung durch eine Ethanolserie.

Nach dem letzten absoluten Ethanol-Eintauchen behandeln Sie das Gewebe mit vier einstündigen Inkubationen in Xylol. Nach dem letzten Eintauchen in das Xylol wird die Probe für eine 17-stündige und eine dreistündige Inkubation in 50 Milliliter flüssiges Paraffin gelegt. Tauchen Sie die Probe am Ende der dreistündigen Inkubation 24 Stunden lang in eine 22 Kubikmillimeter große quadratische Kunststoffform in acht bis 10 Milliliter frisches flüssiges Paraffin.

Wenn das Paraffin erstarrt ist, verwenden Sie ein Mikrotom, um fünf Mikrometer dicke Gewebeschnitte zu entnehmen, tauchen Sie dann die Querschnitte kurz in ein Ein-Liter-Wasserbad mit 0,3 % Gelatine und montieren Sie die Proben sofort auf Objektträger, die mit Polylysin für die H&E-Färbung behandelt wurden. Für die Analyse des oxidativen Stresses erstellen Sie zunächst mit einem hydrophoben Stift eine Barriere um das Gewebe. Inkubieren Sie anschließend Kryo-Querschnitte von acht Mikrometern in fünf mikromolaren DHE, die 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln in Wasser gelöst wurden.

Auf die Inkubation folgen drei 15-minütige Waschgänge in PBS unter sanftem Rühren bei Raumtemperatur. Trocknen Sie die Proben an der Luft und fügen Sie einen Tropfen Einbettmedium hinzu, um die Fluoreszenz zu schützen. Beobachten Sie dann die oxidierte Ethidiumfluoreszenz an einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.

Die DSS-Behandlung führt erwartungsgemäß zu einem kontinuierlich steigenden Krankheitsaktivitätsindex, der am siebten Tag nach der Induktion eine maximale Punktzahl erreicht. Eine entzündungshemmende Nahrungsergänzung verzögert das frühe Auftreten von Kolitis, während die schützende Wirkung zu späteren Zeitpunkten nur marginal ist. Diätetische Interventionen können auch eine DSS-induzierte Erhöhung der Darmepithelpermeabilität sowie eine Verkürzung der Dickdarmlänge verhindern.

Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung von paraffineingebettetem distalem Dickdarmgewebe zeigt, dass Kontrollproben eine normale Morphologie aufweisen, während Tiere, die mit DSS behandelt wurden, die typischen Anzeichen einer Kolitis aufweisen. Bemerkenswert ist, dass die parallele Behandlung mit einer Nahrungsergänzung die Colitis-induzierten morphologischen Veränderungen deutlich lindert, mit einer Gesamtmorphologie, die der der Kontrollgruppe ähnelt. Die Immunfluoreszenzfärbung des distalen Dickdarmgewebes deutet auch darauf hin, dass die Moleküle der engen Inadhären-Verbindung während der DSS-induzierten Kolitis internalisiert werden und dass die Kolokalisation dieser Proteine an den Kontakten der kryptischen Epithelzellen teilweise verloren geht.

Wichtig ist, dass diese Internalisierung reduziert wird, wenn DSS-behandelte Mäuse das entzündungshemmende und antioxidative Nahrungsergänzungsmittel erhalten. Darüber hinaus wird der robusten Rekrutierung von Neutrophilen in den Dickdarm als Reaktion auf DSS-induzierte Kolitis durch eine Nahrungsergänzung entgegengewirkt, was zu einer gleichzeitigen Verbesserung des Neutrophilen-induzierten oxidativen Stresses und einer leichten Verringerung der entzündlichen Zytokinproduktion führt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Sickerkammermessungen, durchgeführt werden, um den elektrischen Widerstand der Epithelbarriere im Dickdarm zu analysieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kolitisforschung und der Erforschung des molekularen Mechanismus der Pathogenese der Colitis ulcerosa in einem reproduzierbaren Mausmodell. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Entwicklung von Colitis und die positiven Auswirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die Funktionen der Darmepithelbarriere analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Tieren die Einhaltung hoher ethischer Standards erfordert, um unnötiges Leid zu vermeiden.