Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Autophagie bei Mäusen durch erzwungenes oder freiwilliges Laufen physiologisch zu aktivieren und dann das Ausmaß der Autophagie in bestimmten Geweben zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Autophagie zu beantworten, insbesondere dazu, wie Autophagie und Wirkung zu den positiven Effekten beitragen, die durch Aerobic-Übungen vermittelt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass körperliche Betätigung ein schneller aerobes Schwanken zwischen der Autophagie in vivo mit Mäusen ist.

Beginnen Sie für dieses Experiment mit acht bis zwölf Wochen alten C57-Black-Six-Mäusen, die ein Trans-Gen zum Nachweis von belastungsinduzierter Autophagie in vivo besitzen, bekannt als GFP-LC3. Einzelheiten zur Verwendung von Mäuselaufbändern finden Sie in der folgenden JoVE-Publikation. Stellen Sie den elektrischen Reiz des Laufbandes auf niedrige Intensität ein.

Akklimatisieren Sie die Mäuse in den ersten beiden Sitzungen an ein zehn Grad bergauf führendes offenes Laufband. Trainieren Sie die Mäuse am ersten Tag fünf Minuten lang, während das Laufband mit acht Metern pro Minute läuft. Am zweiten Tag lassen Sie die Mäuse zehn Minuten lang laufen, zunächst mit acht Metern pro Minute, und erhöhen Sie nach fünf Minuten die Geschwindigkeit auf zehn Meter pro Minute.

Lassen Sie die Mäuse am dritten Tag volle 90 Minuten lang laufen. Starten Sie das Laufband bei zehn Metern pro Minute und ermutigen Sie die Mäuse mit sanften Anstößen zum Laufen, um wiederholte Fußstöße zu vermeiden. Es ist wichtig, die Mäuse zu beobachten und zu manipulieren, damit sie während des 90-minütigen Laufs nicht zu viele Elektroschocks erhalten.

Verwenden Sie während des gesamten Laufs Ihre Finger, um die Mäuse zu ermutigen, auf dem Laufband zu bleiben. Erhöhen Sie nach 40 Minuten 6 die Geschwindigkeit um einen Meter pro Minute. Erhöhen Sie nach 50 Minuten die Geschwindigkeit wieder um einen Meter pro Minute.

Erhöhen Sie nach 60 Minuten die Geschwindigkeit um einen weiteren Meter pro Minute. Beginnen Sie nach 70 Minuten, die Geschwindigkeit alle fünf Minuten zu erhöhen, sodass die letzten fünf Minuten des 90-minütigen Laufs 17 Meter pro Minute betragen. Nach Beendigung des Versuchs werden die Mäuse auf Wunsch sofort zur Gewebeentnahme eingeschläfert.

Für diesen Test halten Sie die Mäuse einzeln. Verwenden Sie den gleichen Stamm wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie ein Maus-Laufrad mit einem Durchmesser von 11,4 Zentimetern und einem daran befestigten Fahrradkilometerzähler vor.

Jede Umdrehung sollte einen Verfahrweg von 358 Millimetern messen. Schieben Sie die Maus in den Käfig, in dem sich das Rad befindet, und lassen Sie die Maus es zwei Wochen lang frei benutzen. Notieren Sie alle 24 Stunden die mit der Maus zurückgelegte Strecke vom Kilometerzähler.

Entnehmen Sie nach den zwei Wochen bei Bedarf Gewebe zur Analyse. Um den Autophagiefluss zu messen, behandeln Sie die Mäuse drei Tage lang mit dem Autophagiehemmer Chloroquin. Lösen Sie das Chloroquin in PBS bei fünf Milligramm pro Milliliter auf und injizieren Sie es intraperitoneal in einer Dosis von 50 Mikrogramm pro Gramm in Mäuse.

Geben Sie den Mäusen an drei aufeinanderfolgenden Tagen täglich eine Injektion und entnehmen Sie drei Stunden nach der letzten Injektion Gewebe. Beginnen Sie bei den auf dem Laufband trainierten Mäusen den 90-minütigen Lauf 90 Minuten nach der Injektion am dritten Tag, sodass der Lauf drei Stunden nach der Injektion endet. Dann werden die Mäuse eingeschläfert und sofort ihr Gewebe entnommen.

Bereiten Sie sich darauf vor, ein Tier innerhalb von 90 Minuten nach dem Training zu überschwemmen, indem Sie das Fixiermittel vorbereiten. Laden Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 15 bis 20 Millilitern frisch hergestelltem vierprozentigem Paraformaldehyd und verbinden Sie die Spritze mit einer 20-Gauge-Katheternadel. Setzen Sie die beladene Spritzenpumpe ein und stellen Sie sie auf 90 Milliliter pro Stunde kontinuierlichen Durchfluss ein.

Schneiden Sie mit dem Tier auf einer sauberen Arbeitsfläche in Rückenlage die Brusthöhle durch das Zwerchfell auf, um das Herz freizulegen. Führen Sie nun die Katheternadel in die rechte Herzkammer ein. Machen Sie als Nächstes einen kleinen Schnitt an der Leber, um das Blut abzulassen und die Pumpe zu starten.

Injizieren Sie das Fixiermittel, bis Lunge und Leber vollständig blass werden. Normalerweise reichen 15 Milliliter Fixiermittel aus. Entfernen Sie nach der Infusion die Nadel und sammeln Sie das gewünschte Gewebe.

Um Skelettmuskulatur zu sammeln, präparieren Sie den Vastus lateralis. Ziehen Sie die Haut des Beins kurz nach hinten, um die Muskeln freizulegen und den Quadrizeps femoris zu lokalisieren. Präparieren Sie dann den Vastus lateralis, den äußeren Muskel, der am oberen Teil des Oberschenkelknochens befestigt ist.

Zur weiteren Fixierung und Dehydrierung legen Sie das entnommene Gewebe für 24 Stunden bei vier Grad Celsius in vier Prozent Paraformaldehyd. Am nächsten Tag überträgst du das Gewebe auf 15 Prozent Saccharose PBS und lässt es über Nacht bei vier Grad Celsius einweichen oder bis es sich in der Lösung abgesetzt hat. Übertragen Sie dann das Gewebe über Nacht oder länger auf 30 Prozent Saccharose PBS bei vier Grad Celsius.

Halten Sie das Taschentuch während dieser Bäder so weit wie möglich im Dunkeln. Legen Sie anschließend die Taschentücher in ein Einbettmedium wie OCT und schneiden Sie sie bei Bedarf in kleinere Stücke. Lassen Sie sie dann einige Minuten in einer kleinen Petrischale akklimatisieren.

Übertragen Sie sie anschließend in Kryoformen mit genügend OCT zum Abdecken. Richten Sie in den Formen die Schnittflächen nach unten aus und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Frieren Sie dann die Proben in einem abgedeckten, mit Trockeneis gefüllten Schaumkühler ein, bis das OCT weiß wird.

Wickeln Sie nun einzelne Proben in beschriftete Folien ein, verschließen Sie sie in einer Plastiktüte und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie verarbeitet werden können. Unter Verwendung von GFP-markiertem LC3 als Reportersystem wurde eine Autophagie-Induktion bei Mäusen beobachtet, die wie beschrieben trainiert wurden. Nach der Autophagie-Stimulation translozierte LC3 in punktuellen Strukturen vom Zytosol zum Autophagosom.

Trainierte Mäuse hatten viel mehr GFP-LC3-Punkte sowohl in der Skelettmuskulatur als auch in der Großhirnrinde im Vergleich zu Mäusen im Ruhezustand. Die Western-Blot-Analyse mit einem LC3-Antikörper zeigte, dass Bewegung die Bildung von lipidkonjugativem LC3-II signifikant induzierte, was darauf hindeutet, dass es zu einer erhöhten Umwandlung von zytosolischem LC3-I in LC3-II kam. Als nächstes wurde der Abbau des autophagischen Frachtrezeptors p62 gemessen.

90 Minuten Laufbandaktivität verursachten einen höheren Abbau von p62 in der Skelettmuskulatur als der Ruhezustand. Dieser Effekt wurde durch eine Injektion von Chloroquin vor dem Training gerettet. Da Chloroquin ein Inhibitor des lysosomalen Abbaus ist, deuten diese Daten darauf hin, dass das beobachtete Phänomen eher auf einen erhöhten autophogen Fluss als auf eine Blockade des Autophagosomenabbaus zurückzuführen ist.

Nach ihrer Entwicklung hatte diese Technik Vorläufer auf dem Gebiet der Autophagie, um die Auswirkungen auf den Mechanismus des Trainings bei der Verschlechterung des Stoffwechsels und des Verhaltens von Tieren zu untersuchen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mäuse zu überwachen, während sie laufen. Nach diesem Verfahren folgen die Methoden wie die elektrische Mikroskopie.

Die Tiermikroskopie kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Bewegung in ausgewählten Autophagie-Signalwegen wie Mitophagie und Lipophagie zu beantworten.