Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Autophagie bei Mäusen durch erzwungenes oder freiwilliges Laufen physiologisch zu aktivieren und anschließend die Autophagie-Level in bestimmten Geweben zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Autophagie zu beantworten, insbesondere, wie Autophagie und Aktivität zu den vorteilhaften Effekten beitragen, die durch aerobe Bewegung vermittelt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass körperliche Bewegung eine schnelle aerobe Modulation der Autophagie in vivo unter Verwendung von Mäusen darstellt.

Beginnen Sie für dieses Experiment mit acht bis zwölf Wochen alten C57 Black Six-Mäusen, die ein Transgen zur Detektion von durch Bewegung induzierter Autophagie in vivo tragen, bekannt als GFP-LC3. Weitere Einzelheiten zur Verwendung von Mäuse-Laufbändern finden Sie in der folgenden JoVE-Publikation. Stellen Sie den elektrischen Reiz des Laufbandes auf geringe Intensität ein.

Gewöhnen Sie die Mäuse in ihren ersten beiden Sitzungen an ein offenes Laufband mit einer Steigung von zehn Grad. Am ersten Tag bewegen Sie die Mäuse fünf Minuten lang bei einer Laufbandgeschwindigkeit von acht Metern pro Minute. Am zweiten Tag laufen die Mäuse zehn Minuten lang, zunächst mit acht Metern pro Minute, und erhöhen nach fünf Minuten die Geschwindigkeit auf zehn Meter pro Minute.

Am dritten Tag laufen die Mäuse volle 90 Minuten. Beginnen Sie mit einer Geschwindigkeit von zehn Metern pro Minute auf dem Laufband und ermutigen Sie die Mäuse durch sanfte Stupser zum Laufen, um wiederholte Fußschläge zu vermeiden. Es ist entscheidend, die Tiere zu beobachten und gegebenenfalls zu beeinflussen, damit sie während des 90-minütigen Laufs nicht zu viele elektrische Schocks erhalten.

Während des gesamten Laufs verwenden Sie Ihre Finger, um die Mäuse dazu zu ermutigen, auf dem Laufband zu bleiben. Nach 40 Minuten erhöhen Sie die Geschwindigkeit um einen Meter pro Minute. Nach 50 Minuten erhöhen Sie die Geschwindigkeit erneut um einen Meter pro Minute.

Nach 60 Minuten die Geschwindigkeit um einen weiteren Meter pro Minute erhöhen. Nach 70 Minuten die Geschwindigkeit alle fünf Minuten erhöhen, sodass die letzten fünf Minuten des 90-minütigen Laufs 17 Meter pro Minute betragen. Am Ende des Versuchs die Mäuse gegebenenfalls unverzüglich zur Gewinnung von Gewebeproben euthanasiert werden.

Stellen Sie die Mäuse für diesen Test einzeln unter. Verwenden Sie den zuvor beschriebenen Stamm. Bereiten Sie ein Laufrad für Mäuse mit einem Durchmesser von 11,4 Zentimetern, das mit einem Fahrradtachometer ausgestattet ist, vor.

Jede Umdrehung sollte eine Wegstrecke von 358 Millimetern messen. Setzen Sie die Maus in den Käfig mit dem Laufrad und lassen Sie die Maus dieses zwei Wochen lang frei nutzen. Notieren Sie alle 24 Stunden die vom Zähler angezeigte Laufstrecke der Maus.

Nach den zwei Wochen gewinnen Sie die Gewebe nach Bedarf zur Analyse. Um den autophagischen Fluss zu messen, behandeln Sie die Mäuse drei Tage lang mit dem Autophagiehemmer Chloroquin. Lösen Sie das Chloroquin in PBS mit einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter auf und injizieren Sie es den Mäusen intraperitoneal in einer Dosis von 50 Mikrogramm pro Gramm.

Verabreichen Sie den Mäusen drei aufeinanderfolgende Tage lang täglich eine Injektion und entnehmen Sie die Gewebe drei Stunden nach der letzten Injektion. Bei den Mäusen, die auf dem Laufband trainiert wurden, beginnen Sie den 90-minütigen Lauf 90 Minuten nach der Injektion am dritten Tag, sodass der Lauf drei Stunden nach der Injektion endet. Danach werden die Mäuse euthanasiert und ihre Gewebe unverzüglich entnommen.

Bereiten Sie die Perfusionslösung für ein Tier innerhalb von 90 Minuten nach der Belastung vor, indem Sie das Fixativ zubereiten. Füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 15 bis 20 Milliliter frisch hergestelltem vierprozentigem Paraformaldehyd und verbinden Sie die Spritze mit einer Katheternadel der Größe 20. Befestigen Sie die geladene Spritzenpumpe und stellen Sie sie auf einen kontinuierlichen Fluss von 90 Millilitern pro Stunde ein.

Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine saubere Arbeitsfläche und öffnen Sie die Brusthöhle durch einen Schnitt am Zwerchfell, um das Herz freizulegen. Führen Sie nun die Katheternadel in den rechten Ventrikel ein. Danach machen Sie einen kleinen Schnitt an der Leber, um das Blut abfließen zu lassen, und starten die Pumpe.

Spritzen Sie das Fixierungsmittel ein, bis Lunge und Leber vollständig blass geworden sind. In der Regel reichen 15 Milliliter Fixierungsmittel aus. Entfernen Sie nach der Perfusion die Nadel und sammeln Sie die gewünschten Gewebeproben.

Um die Skelettmuskulatur zu gewinnen, dissezieren Sie den Musculus vastus lateralis. Ziehen Sie die Haut des Beins kurz zurück, um die Muskulatur freizulegen und den Musculus quadriceps femoris zu lokalisieren. Anschließend wird der Musculus vastus lateralis, der äußere Muskel, der am oberen Teil des Femurs angeheftet ist, herauspräpariert.

Platzieren Sie das gewonnene Gewebe zur weiteren Fixierung und Dehydrierung 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in vierprozentigem Paraformaldehyd. Am nächsten Tag überführen Sie das Gewebe in 15-prozentige Saccharose-PBS-Lösung und lassen es über Nacht oder bis zum Absinken in der Lösung bei vier Grad Celsius einweichen. Anschließend überführen Sie das Gewebe in 30-prozentige Saccharose-PBS-Lösung bei vier Grad Celsius für mindestens eine Nacht oder länger.

Halten Sie die Gewebe während dieser Bäder so viel wie möglich im Dunkeln. Anschließend bringen Sie die Gewebe in ein Einbettmedium wie OCT und schneiden sie gegebenenfalls in kleinere Stücke. Lassen Sie sie danach einige Minuten lang in einer kleinen Petrischale akklimatisieren.

Anschließend in Kryoschneideformen überführen und mit ausreichend OCT bedecken. Im Formenblock die Schnittflächen nach unten ausrichten und die Bildung von Blasen vermeiden. Danach die Proben in einem abgedeckten Styroporkühler mit Trockeneis einfrieren, bis das OCT weiß wird.

Verpacken Sie nun einzelne Proben in beschriftete Folien, verschließen Sie sie in einer Plastiktüte und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie verarbeitet werden können. Unter Verwendung von GFP-markiertem LC3 als Reportersystem wurde eine Autophagieinduktion bei Mäusen beobachtet, die wie beschrieben trainiert wurden. Nach der Autophagie-Stimulation translozierte LC3 aus dem Cytosol in die Autophagosomen in Form punktförmiger Strukturen.

Bei trainierten Mäusen waren sowohl im Skelettmuskel als auch im zerebralen Kortex deutlich mehr GFP-LC3-Punkte sichtbar als bei ruhenden Mäusen. Eine Western-Blot-Analyse mit einem LC3-Antikörper zeigte, dass die Bildung des lipidkonjugierten LC3-II durch die körperliche Betätigung signifikant induziert wurde, was auf eine erhöhte Umwandlung des zytosolischen LC3-I in LC3-II hindeutet. Anschließend wurde der Abbau des autofagischen Frachtrezeptors p62 gemessen.

90 Minuten Laufbandaktivität führten zu einem stärkeren Abbau von p62 im Skelettmuskel im Vergleich zur Ruhebedingung. Dieser Effekt wurde durch eine Injektion mit Chloroquin vor der körperlichen Betätigung aufgehoben. Da Chloroquin ein Inhibitor des lysosomalen Abbaus ist, deuten diese Daten darauf hin, dass das beobachtete Phänomen auf einem erhöhten autophagosomen Fluss und nicht auf einer Blockade des Autophagosomenabbaus beruht.

Nach ihrer Entwicklung hatte diese Technik Vorläufer im Bereich der Autophagie, um die Auswirkungen der Mechanismen der körperlichen Betätigung auf den Stoffwechselabbau und das Verhalten von Tieren zu untersuchen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mäuse während des Laufens zu überwachen. Nach diesem Verfahren folgen Methoden wie die Elektronenmikroskopie.

Mittels Tiermikroskopie können zusätzliche Fragen beantwortet werden, beispielsweise zur Beteiligung von selektiven Autophagiewegen wie der Mitophagie und Lipophagie beim Training.