Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Das folgende Protokoll soll die Isolierung eines primären Astrozyten aus dem Gehirn von Rattenwelpen zeigen, um einen Sauerstoff-Glukose-Entzug oder OGD durchzuführen. Die Exposition von gereinigten Astrozyten gegenüber einer Umgebung mit Sauerstoffglukosemangel ist ein Modul, das es uns ermöglicht, die Reaktion auf einige der Bedingungen zu testen, die bei ischämischen Schlaganfällen auftreten. Methodische Veränderungen nach Exposition gegenüber Sauerstoffglukosemangel können mit selektiven Astrozytenmarkern wie GFAP beobachtet und gemessen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese isolierten Zellen, die ischämischen Bedingungen ausgesetzt sind, verwendet werden können, um neue Teilwege zu testen, die unter hypoxischen Bedingungen aktiviert werden, und andere Medikamente, die vor ischämischen Schlaganfällen schützen. In diesem Teil des Protokolls werden Astrozyten aus der Kortex von Jungtier-Ratten isoliert. Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, eine primäre astrozytäre Zellkultur zu erhalten, um Experimente mit Sauerstoff-Glukose-Entzug durchzuführen.

Die Materialien für dieses Verfahren sind die folgenden: Autoklavieren Sie alle Materialien, bevor Sie sie in diesem Verfahren verwenden. Und setzen Sie die Haube mindestens 20 Minuten lang UV-Licht aus, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen. Um dieses Verfahren zu starten, pipettieren Sie drei bis fünf Milliliter des vollständigen DME-Mediums in jede Platte.

Es wird wie folgt aufgeteilt, eins für jedes Mäusegehirn, zwei für alle Kortikale und drei für alle Kortexe ohne die Hirnhäute. Enthaupten Sie einen Welpen nach der Desinfektion mit 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt beginnend vom Hinterkopf in Richtung Nase.

Entfernen Sie den Schädel mit einer gekrümmten Pinzette und kratzen Sie das Kleinhirn vorsichtig heraus, wodurch die Rinde freigelegt wird. Entfernen Sie die freiliegenden Gehirne mit einer Pinzette und legen Sie das Gehirn in die erste Petrischale mit dem Medium. Wiederholen Sie diese Schritte für alle anderen Welpen.

Trennen Sie die Gehirnhälften, indem Sie sie mit dem scharfen Ende der Mikropräparierzange vorsichtig entlang der Mittellinienfissur teilen. Schälen Sie die Kortikale, indem Sie die weiße Substanz und den Hippocampus mit der Pinzette mit einer Kneifbewegung entfernen und zurücklassen. Übertragen Sie die Schalenrinde in die Petrischale mit der Aufschrift Nummer zwei.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Gehirne, indem Sie alle präparierten Kortexe in der Petrischale kombinieren. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um das Medium gleichmäßig auf alle Kortikale zu verteilen. Verwenden Sie das Präpariermikroskop, um die Hirnhäute zu identifizieren, die die geschälten Kortikale auskleiden.

Hirnhäute sind eine sehr dünne transparente Schicht, die durch die Suche nach den kleinen roten Kapillaren, die das Gewebe umgeben, identifiziert werden kann. Untersuchen und entfernen Sie sorgfältig die Hirnhäute, die die Kortikale auskleiden, und schälen Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette auf beiden Seiten jeder Rinde von den einzelnen Kortikallappen ab. Lege die sauberen Kortikale in eine neue Petrischale mit der Aufschrift Nummer drei.

Für die Dissoziation des Gewebes mit der Magen- oder Mixermethode gießen Sie die sauberen, geschälten Kortikale und das Medium aus der Petrischale in einen sterilen Mixerbeutel. Und fügen Sie so viel Medium hinzu, dass das Gesamtvolumen des Beutels auf fünf Milliliter kommt. Legen Sie den Beutel in den Stomacher 80, so dass etwa zwei Zentimeter des Beutels über der geschlossenen Tür sichtbar bleiben.

Die Zelldissoziation erfolgt bei diesem Instrument nach 2,5 Minuten bei hoher Geschwindigkeit. Alternativ kann die Gewebedissoziation erfolgen, indem der sterile Beutel verschlossen und das Gewebe mit einem Becherglas in der Haube vorsichtig geschlagen wird, bis die Gewebepartikel zu einer feinen Suspension geworden sind. Achten Sie darauf, ein Tuch zwischen Beutel und Becherglas zu verwenden, um Reibung und Bruch des Beutels zu vermeiden.

Gießen Sie die Zellsuspension mit der Maschenzahl 60 in die Mitte der Hülse. Gießen Sie die gefilterten Zellen in die Mitte eines Netzes mit der Nummer 100, damit es durch die Schwerkraft gefiltert werden kann. Gießen Sie die gefilterte Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Zellensuspension wird bei 200 mal G in einer Mittelzündung vorzugsweise mit einer Schwenkschaufelfräse fünf Minuten lang zentriert. Den Überstand entfernen und in einem Becherglas entsorgen. Fügen Sie der Zellpalette komplette frische Medien hinzu.

Mit einer serologischen Pipette resuspendieren und dissoziieren Sie die Zellpalette in maximal fünf Millilitern Medium. Die gewünschte Menge der Zellsuspension auf einen Kolben geben und mit dem Medium vervollständigen. Geben Sie die resuspendierte Palette in den Kolben mit Medium.

Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig im Kolben und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Denken Sie daran, das Medium alle drei Tage zu wechseln. Die folgende Methodik zielt darauf ab, den Zellen in einer kontrollierten Umgebung Sauerstoff und Glukose zu entziehen.

Der Zweck dieses Modells ist es, die Reaktion von Astrozyten in einem ischämischen Schlaganfallzustand zu untersuchen. Die für dieses Verfahren verwendeten Materialien sind: Spülen Sie das glukosefreie Medium durch Einführen einer serologischen Pipette, die an das Gassystem angeschlossen ist. Blasen Sie die Lösung 10 Minuten lang mit dem Gasgemisch bei einem Durchfluss von 10 bis 15 Litern pro Minute.

Stellen Sie nach Ablauf der 10 Minuten den pH-Wert des OGD-Mediums auf 7,4 ein. Filtrieren Sie das gespülte glukosefreie Medium mit dem 50-Milliliter-Rohrfiltersystem. Es ist wichtig, für jedes Experiment immer ein frisches OGD-Medium herzustellen.

Dadurch wird sichergestellt, dass das Medium von Sauerstoff befreit wird. Entfernen Sie das Astrozytenmedium und waschen Sie es zweimal mit zellulärem PBS, um Glukose aus den Zellen zu entfernen. Fügen Sie das OGD-Medium zu den Vertiefungen hinzu.

Stellen Sie die Multi-Well-Schale mit offenem Deckel in die Hypoxiekammer. Schließen Sie das Gasgemisch an das Einlassventil an und lassen Sie das Auslassventil offen. Spülen Sie die Kammer fünf bis sieben Minuten lang mit dem Gasgemisch mit 10 bis 15 Litern pro Minute.

Stoppen Sie den Gasfluss und schließen Sie zuerst die Klemme am Auslassventil. Schließen Sie dann die Klemme am Schlauch des Gaseintrittsventils. Stellen Sie die hypoxische Kammer für die gewünschte Zeit in der OGD bei 37 Grad Celsius in den Zellkultur-Inkubator.

Nach Ablauf der Inkubationszeit aspirieren Sie das OGD-Medium und fügen Sie den Zellen vorsichtig vollständiges DMEM hinzu, um den normoxischen Zustand zu erreichen. Bringen Sie die Zellen für null 24 und 48 Stunden unter normoxischen Bedingungen in den Kulturinkubator zurück. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Astrozyten aus der Rinde neonataler Ratten.

Nach der Validierung der Reinheit der Primärkulturen wurden OGD-Experimente durchgeführt. In diesem ischämischen Modell induzierte Glukose- und Sauerstoffmangel eine phologische Veränderung, die durch die Immunfluoreszenz mit astrozytären Markern wie GFAP oder Proliferationsmarkern wie PCNA überwacht wurde. Einer der Vorteile dieses Modells besteht darin, dass es uns ermöglicht, eine bestimmte Zelltypantwort zu untersuchen.

Die Einschränkung bei dieser Technik ist jedoch der Mangel an Zell-zu-Zell-Interaktion aufgrund der Isolierung von Astrozyten. Eine der Möglichkeiten, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, Astrozyten Bedingungsmedien aus anderen Zelltypen oder einer Co-Kultur auszusetzen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Methode des Sauerstoffglukoseentzugs in einem isolierten Zellsystem es uns ermöglicht, die Wirkung verschiedener neuronaler schützender oder neurotoxischer Moleküle direkt zu testen.

Außerdem ist es ein gültiges Werkzeug, um die Biologie der Astrozyten zu studieren. Schließlich bildet dieses Modell eine solide Grundlage für die Untersuchung von Entwicklungsmedikamenten unter experimentellen Bedingungen unter Verwendung von in vivo-Modellen.