Analyse von Cap-bindende Proteine in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt
December 28th, 2016
Hier präsentieren wir menschliche Zellkulturprotokolle zur Analyse von Translationsinitiationsfaktoren, die die 5'-Kappe von mRNA unter physiologischen Sauerstoffbedingungen binden. Diese Methode verwendet ein Agarose-gebundenes m7GTP Kappenanalogon und eignet sich zur Untersuchung von Kappenbindungsfaktoren und deren interagierenden Partnern.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Cap-bindende Proteine unter Bedingungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt zu erfassen. Bei dieser Methode wird ein Agarose-gebundenes Sieben-Methyl-Guanosin-Kappenanalogon verwendet, um Kappenbindungsfaktoren und ihre Interaktionspartner zu untersuchen. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Proteinsynthese zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung neuer sauerstoffregulierter Faktoren, die an der kappenabhängigen Translation beteiligt sind.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen bis zum Zeitpunkt der Lyse an einem Hypoxie-Arbeitsplatz aufbewahrt werden. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Krebstherapie, da Krebszellen innerhalb eines Tumors einem sehr geringen Sauerstoffgehalt ausgesetzt sind und die Translationskontrolle eine Schlüsselrolle bei der Tumorprogression spielt. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir eine kürzlich erschienene Veröffentlichung von Corona-Kollegen lasen, in der berichtet wurde, dass die Sauerstoffversorgung des Gewebes tatsächlich näher an dem liegt, was wir Hypoxie nennen, als an der Normaxie, in der Zellen routinemäßig kultiviert werden.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Zellkultur, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Zählung der Zellen mit einem Hämozytometer füttern Sie 150 Millimeter kultivierte Schalen mit 15 Millilitern vollständigem Medium, um eine Zelldichte von 2500 bis 5000 Zellen pro Quadratzentimeter zu erhalten. Verwenden Sie zwei 150-Millimeter-Schalen für jeden Kappenbindungsassay.
Stellen Sie die ausgesäten Kulturschalen bei 37 Grad Celsius und einer Atmosphäre von fünf Prozent Kohlendioxid in den Inkubator. Nachdem die Zellen mindestens 24 Stunden inkubiert haben, legen Sie die Zellen für die gewünschte Zeit an einen Hypoxie-Arbeitsplatz. Stellen Sie dann die Workstation auf die entsprechende Physioxie ein.
Erwärmen Sie eine X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Trypsin in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Minuten. Aliquotieren Sie 980 Mikroliter Lysepuffer in ein 1,5-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen für jeden durchgeführten Kappenbindungsassay. 10 Mikroliter 100X Proteasehemmer-Cocktail und 10 Mikroliter 4-Benzolsulfonylfluoridhydroclorid auf die 980 Mikroliter Lysepuffer auf Eis.
Entsorgen Sie die Medien aus jeder 150-Millimeter-Schale in einem Abfallbehälter in der Hypoxie-Arbeitsstation. Waschen Sie dann die Zellen mit drei bis vier Millilitern warmem X PBS und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Geben Sie einen Milliliter warmes 05-prozentiges Trypsin-EDTA in jede Schale und lassen Sie die Schalen zwei Minuten ziehen oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haften.
Mit einer Pipette werden die Zellen einer Platte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, sodass jede Zellplatte in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 mal g für 90 Sekunden, um die Zellen zu pelletieren.
Nach der Zentrifugation wird das Trypsin mit einer Pipette abgesaugt, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit warmem One X PBS, indem Sie vorsichtig 200 Mikroliter PBS in das Röhrchen direkt über dem Pellet pipettieren. Saugen Sie dann das PBS an, ohne das Pellet zu stören.
Pipettieren Sie anschließend 500 Mikroliter aus der einen Milliliter vorbereiteten Lysepufferlösung auf das erste zelluläre Pellet. Suspendieren Sie das Pellet vollständig, indem Sie es auf und ab pipettieren. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit dem zweiten Zellenpellet und suspendieren Sie das zweite Pellet durch Auf- und Abpipettieren.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Pellets für jede Probe kombiniert und wieder suspendiert wurden. Kombinieren Sie anschließend das Lysat mit den restlichen 500 Mikrolitern Lysepuffer in einem 1,5-Liter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entnehmen Sie die Proben aus der Hypoxie-Arbeitsstation.
Lysieren Sie die Zellen unter leichtem Rühren, indem Sie die Proben 1,5 bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius drehen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die lysierten Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1200 mal g, um Zelltrümmer zu entfernen. Füllen Sie das Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen um und entsorgen Sie das Pellet.
Reservieren Sie einen Teil des Überstands für die Verwendung als Ganzzell-Lysat-Eingangskontrolle für die Western-Blot-Analyse. Zur Vorbereitung des Kappenbindungsassays entfernen Sie mit einer Schere die Spitze der Pipette, um das Auffangen der Bead-Aufschlämmung zu erleichtern. Für jeden Probentransfer werden 50 Mikroliter der blinden Agaroseperlenkontrollaufschlämmung und 50 Mikroliter der m7GTP Agarose C10-verknüpften Kügelchenaufschlämmung zur Trennung von 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
Pelletieren Sie dann die Kügelchen, indem Sie die Aufschlämmung 30 Sekunden lang bei 500 mal g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie die Kügelchen wieder in 500 Mikrolitern TBS. Nachdem Sie diese Schritte wiederholt haben, pelletieren Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang bei 500 mal g und entfernen Sie den Überstand.
Übertragen Sie dann den Überstand mit dem Lysat in das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die leeren Agarosekügelchen enthält. 10 Minuten bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Nach 10 Minuten pelletieren Sie die blanken Agarosekügelchen, indem Sie sie 30 Sekunden lang bei 500 mal g zentrifugieren.
Nach der Zentrifugation übertragen Sie das Lysat, das nicht an die Kügelchen bindet, in das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit den m7GTP-Agarose-C10-verknüpften Kügelchen. Waschen Sie die leeren Agarosekügelchen, indem Sie die Kügelchen in 500 Mikrolitern Lysepuffer resuspendieren, die Kügelchen pelletieren, indem Sie 30 Sekunden lang bei 500 mal g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie dies viermal für insgesamt fünf Wäschen.
Suspendieren Sie die leeren Agarosekügelchen in einem X SDS-PAGE-Probenpuffer. Und die Kügelchen 90 Sekunden bei 95 Grad Celsius kochen. Lagern Sie die Probe bei 20 Grad Celsius für zukünftige Western-Blot-Analysen, um zu beobachten, ob das Protein von Interesse unspezifisch an die Kugel bindet.
Inkubieren Sie das Lysat mit den m7GTP-Agarose-C10-verknüpften Kügelchen unter sanftem Rühren für eine Stunde bei vier Grad Celsuis, um Cap-bindende Proteine einzufangen. Nach dem Rühren werden die m7GTP Agarose C10-verknüpften Kügelchen pelletiert, indem sie 30 Sekunden lang bei 500 g zentrifugiert werden. Nach dem Entsorgen des Überstands die m7GTP Agarose C10-verknüpften Kügelchen wie zuvor waschen.
Suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 600 Mikrolitern Lysepuffer und fügen Sie GTP bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu. Inkubieren Sie die m7GTP Agarose C10-verknüpften Kügelchen plus ein millimolares GTP unter sanftem Rühren für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Dadurch werden Proteine dissoziiert, die unspezifisch mit m7GTP interagieren.
Pelletieren Sie die m7GTP Agarose C10-verknüpften Kügelchen durch Zentrifugieren bei 500 g für 30 Sekunden. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 Mikroliter vier X SDS-PAGE-Probenpuffer hinzu. Nachdem Sie die Kügelchen wie zuvor gewaschen haben, suspendieren Sie die Kügelchen wieder in einem X SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen Sie sie 90 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius.
Hier sind repräsentative Western Blots einer typischen m7GTP-Affinitätsreinigung von zwei wichtigen Cap-bindenden Proteinen als Reaktion auf Sauerstofffluktuationen in primären humanen proximalen Tubulus-Epithelzellen dargestellt. Die Zelllysate wurden 24 Stunden lang acht Prozent, fünf Prozent, drei Prozent oder ein Prozent Sauerstoff ausgesetzt. Die Spuren umfassen 10 Prozent des gesamten Zelllysats als Input, ein gewaschenes GTP zur Messung der Spezifität für m7GTP und die Proteine, die nach dem GTP-Waschen an m7GTP-Kügelchen gebunden sind.
Die Daten von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden durch Bild J quantifiziert und als relative Dichteeinheiten relativ zu 10 Prozent des Gesamtzelllysats ausgedrückt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass menschliche Zellen, die unter physiologischem Sauerstoff kultiviert wurden, zwei Kappen-bindende Proteine verwenden, um unterschiedliche mRNAs für die Translation zu rekrutieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Cap-bindende Proteine unter sauerstoffarmen Bedingungen einfängt.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen bis zum Zeitpunkt der Lyse in der Hypoxie-Workstation zu halten, da Sauerstoff die biochemischen Eigenschaften dieser Translationsinitiationsfaktoren schnell verändern kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Polysomenfraktionierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Cap-bindenden Proteine mit der aktiven Translation unter sauerstoffarmen Bedingungen assoziiert sind.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Analyse von Translationsinitiierungsfaktoren vor, die unter niedrigen Sauerstoffbedingungen an die 5' Kappe der mRNA binden. Unter Verwendung eines an Agarose gebundenen m7 GTP Kappenanalogons zielt diese Technik darauf ab, neue, sauerstoffregulierte Faktoren zu identifizieren, die an der kappenabhängigen Translation beteiligt sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Proteinsynthese
Hintergrund
- Kappenbindende Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Translationsinitiierung.
- Zellen in Tumoren erfahren oft hypoxische Bedingungen.
- Das Verständnis der Translation unter niedrigen Sauerstoffbedingungen kann die Krebstherapie beeinflussen.
- Jüngste Studien deuten darauf hin, dass die Gewebeoxygenierung oft näher an Hypoxie als an Noroxie liegt.
Zweck der Studie
- Kappenbindende Proteine unter niedrigen Sauerstoffbedingungen zu erfassen.
- Die Interaktion von Kappenbindungsfaktoren und ihren Partnern zu untersuchen.
- Neue Faktoren zu identifizieren, die die Translation unter hypoxischen Bedingungen regulieren.
Verwendete Methoden
- Nutzung eines an Agarose gebundenen m7 GTP Kappenanalogons.
- Zellkultur in einer Hypoxie-Workstation bis zur Lyse.
- Analyse von Proteininteraktionen unter kontrollierten Sauerstoffbedingungen.
- Anwendung der Methode zur Untersuchung der Translationskontrolle in Krebszellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erfassung von kappenbindenden Proteinen unter hypoxischen Bedingungen.
- Identifizierung neuer, sauerstoffregulierter Faktoren, die an der Translation beteiligt sind.
- Einblicke in die Rolle der Translationskontrolle bei der Tumorprogression.
- Validierung der Effektivität der Methode zum Studium der Proteinsynthese.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz zum Studium von Translationsinitiierungsfaktoren.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf das Verständnis der Krebsbiologie haben.
- Weitere Forschung könnte therapeutische Strategien zur Behandlung hypoxischer Tumoren verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
