Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mit Hilfe einer fortschrittlichen dorsalen Hautfaltenkammer die Entwicklung tumorassoziierter Gefäße im Mausmodell im Detail zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Krebs zu beantworten, wie z.B. die Verbesserung der Therapie und das Verständnis des Tumorverlaufs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Prozesse im richtigen Kontext, im wahren Leben, untersucht werden und dass diese Prozesse im Laufe der Zeit untersucht werden können.

Dieses Verfahren wird von Dr. Ann Seynhaeve, der leitenden Forscherin in meinem Labor, demonstriert. Von einer nicht-transgenen Spendermaus wird ein nicht-nekrotisches Tumorfragment mit einem Durchmesser von 10 mm für die Implantation in die dorsale Fensterkammer der Empfängermaus entnommen. Verwenden Sie einen normalen Mausspender für einen syngenen Tumor oder einen immundefizienten Mausspender für ein Xenotransplantat.

Die Empfängermaus muss mindestens 12 Wochen alt sein und zwanzig oder mehr Gramm wiegen. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter aseptischen Bedingungen durch. Autoklavieren Sie zum Beispiel die chirurgischen Instrumente und Kammermaterialien.

Nachdem Sie die Empfängermaus sediert haben, entfernen Sie die Haare von der gesamten Rückenseite mit einem elektrischen Trimmer und verwenden Sie dann Haarentfernungsgel. Spülen Sie die Haut sauber ab und trocknen Sie sie. Zum Schluss schrubben Sie die enthaarte Haut mit Ethanol sauber.

Markiere nun eine horizontale Mittellinie entlang des Rückens. Positionieren Sie dann das Sichtfenster mindestens 2 mm unterhalb der Linie und markieren Sie den Umfang des Fensters auf der Haut. Entfernen Sie anschließend mit einem Skalpell und einer Schere vorsichtig die Haut innerhalb der Umfangslinie, ohne die darunter liegende Faszie zu beschädigen.

Ziehe dann die Hautfalte nach oben und führe mit einem Ohrlocher 1 mm Löcher auf beiden Seiten des Fensterbereichs für die Schrauben ein, die das Fenster an Ort und Stelle halten. Positionieren Sie den hinteren Rahmen an der Maus und befestigen Sie den Rahmen, indem Sie die Muttern auf die Schrauben setzen. Ziehen Sie dann die Haut zwei bis drei Millimeter über den Rahmen, um sicherzustellen, dass sie passt.

Wenn ja, stechen Sie 23 Gauge-Nadeln durch die beiden Nahtlöcher am oberen Rand des Rahmens. Sichern Sie den Rahmen, indem Sie die Muttern festziehen und mit Klemmnadelhaltern festhalten, ziehen Sie die Muttern nicht zu fest an und verhindern Sie, dass sich die Haut um die Schrauben dreht. Ersetzen Sie als Nächstes die Nadeln durch Nähte, um den Rahmen auf der Haut zu befestigen.

Drehen Sie nun die Maus zur Seite. Aus diesem Blickwinkel stellen Sie ein dickes Stück Füllglas und ein Standard-12-Millimeter-Deckglas vor. Befestigen Sie beide mit einem Sicherungsring, so dass die Blende dicht an der Scheibe anliegt.

Der nächste Schritt besteht darin, das Fenster mit 0,9 % Natriumchlorid zu hydratisieren. Lassen Sie ein paar Tropfen auf den Sichtbereich fallen und saugen Sie den Überschuss auf. Verwenden Sie nun direkt unter dem Fenster eine 25-Gauge-Nadel mit einer 90-Grad-Biegung, um eine tiefe Tasche in die Faszie zu bohren, die einen Kubikmillimeter Tumorgewebe aufnehmen kann.

Führen Sie dann das Tumorgewebe in die Tasche ein. Schließen Sie abschließend den Sichtbereich des Fensters mit einem handelsüblichen 12-Millimeter-Deckglas und einem Sicherungsring. Eventuelle Luftblasen lösen sich innerhalb einer Stunde auf.

Bevor Sie die Maus sedieren, erwärmen Sie eine speziell angefertigte temperaturgesteuerte Plattform auf 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Maus sediert haben, positionieren Sie sie auf der erwärmten Plattform. Befestigen Sie einen Nasenkonus, um Isofluran zu verabreichen, und wenn die Untersuchung länger als fünf Minuten dauert, vereinbaren Sie einen ophthalmologischen Termin.

Verschrauben Sie nun die Kammer mit den Schrauben des Fensters an einem maßgefertigten Halter und befestigen Sie den Halter an der Plattform. Reinigen Sie dann die Glasscheibe mit Wasser und Watte. Überprüfen Sie nun am Mikroskop die Gefäßentwicklung im Tumor mit dem 10-fachen Objektiv unter Hellfeld- und Fluoreszenzlicht.

Schalten Sie nach der groben Untersuchung die konfokalen Laser ein. Stellen Sie das Bedienfeld des Mikroskops auf eine intelligente Verstärkung von 100 Volt pro Umdrehung ein. Ein intelligenter Versatz von 10 % pro Umdrehung, mittlerer Zoom für mittlere X- und Y-Positionierung und 100 Mikrometer Z-Position pro Umdrehung.

Stellen Sie den Erfassungsmodus auf XYZ oder XYZT ein. Wählen Sie eine Auflösung aus. Wählen Sie eine Erfassungsgeschwindigkeit von zwei oder 400 Hertz.

Stellen Sie die Lochblende auf eine luftige Einheit ein. Und wählen Sie die bidirektionale X-Option. Wenn Sie mehrere Fluorophore mit einem möglichen überlappenden Spektralbereich bewerten, wählen Sie einen sequenziellen Scan zwischen den Frames, um ein Durchscheinen zu verhindern, und stellen Sie die richtigen Strahlengänge ein.

Legen Sie den Liniendurchschnitt auf vier fest, und wählen Sie abschließend einen neuen Datensatz für das Experiment aus. Konzentrieren Sie sich nun auf das Gewebe, das Sie dabei interessiert, verwenden Sie am besten trockene Linsen mit höheren numerischen Aperturen. Verwenden Sie als Nächstes den schnellen Live-Scan, um das bestmögliche Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, indem Sie die Verstärkung und den Offset so anpassen, dass keine Überbelichtung vorliegt.

Wählen Sie nun den Z-Stapel auf der Registerkarte "Erfassen" aus. Führen Sie einen schnellen Z-Scan durch. Entscheiden Sie sich beim schnellen Scan für die Anfangs- und Endposition des vollständigen Scans.

Stellen Sie dann die Z-Schrittgröße entsprechend der Lochblendengröße ein und fahren Sie mit dem vollständigen Scan fort. Wirtsmäuse, die fluoreszierende Markierungen exprimieren, wurden nach der Tumorimplantation unter Verwendung des beschriebenen Protokolls abgebildet. Die eNOStag-GFP-Markierung exprimiert im Golgi und in der Zellmembran von Endothelzellen.

Die ROSAmT/mG-Markierung exprimiert die rote Fluoreszenz ubiquitär und die grüne Fluoreszenz in Cre-Recombinase-exprimierenden Zellen. Eine Anwendung dieser Technologie ist die Untersuchung der Gefäßentwicklung, da alle Stadien in Tumoren zu sehen sind. Zum Beispiel kann man sehen, wie Endothelfronten in unvaskularisierte Bereiche sprießen.

Tumoren haben auch geschädigte Gefäße und etablierte Gefäßbetten mit reifen verzweigten Gefäßen. Eine weitere Anwendung ist die Untersuchung der Lumenbildung, des Blutflusses und der Extravasation durch das Aufbringen von Markierungen auf das Blut, wie z. B. fluoreszierende Nanopartikel. So kann der Blutfluss im Lumen von Gefäßtuben und in der Nähe von Endothelspitzenzellen beobachtet werden.

In den Spitzenzellen ist die Bildung eines Lumens des Stammes zu beobachten. Mit der Intravitalmikroskopie kann auch die Wirkung von Chemotherapeutika untersucht werden. Zum Beispiel verblieben die Nanopartikel 24 Stunden nach der Injektion von Nanopartikeln in ein eNOStag-GFP-Tier im Gefäßsystem mit minimaler Extravasation in das Tumorinterstitium.

Bei der Verabreichung von Nanopartikeln in Kombination mit TNF wurde jedoch eine Extravasation in das Tumorinterstitium beobachtet. Dies ist ein Beleg für eine Zunahme der intertumoralen Wirkstoffabgabe. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine dorsale Hautfaltenfensterkammer installiert und wie man tumorbezogene Prozesse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersucht.