Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

Hallo, mein Name ist Dimitry Samigullin, ich arbeite im Labor für Biophysik synaptischer Prozesse des Kasaner Instituts für Biochemie und Biophysik der Russischen Akademie der Wissenschaften. In unserem Labor untersuchen wir umfangreiche Wege der Kalzium-Signalisierung in der Neuromuskulären Verbindung. Eine der zugänglichsten Methoden zur Messung des synaptischen Kalziumspiegels ist eine optische Aufzeichnung.

Hier beschreiben wir die Methode der Beladung eines calciumsensitiven Farbstoffs durch einen Nervenstumpf in die Nervenenden des Frosches. Außerdem stellen wir das Protokoll zur Messung und Analyse eines großen Calciumtransienten in Froschterminals vor. Mit dieser Methode ist es möglich, den Einfluss von Wirkstoffen auf das präsynaptische Niveau des Kalziums während der synaptischen Aktivität zu untersuchen.

Vorbereitung der Farbladelösung. Der Calciumfarbstoff Oregon Green BAPTA von Fluorescein kommt in 500 Mikrolitern über eine kleine Menge von 500 Mikrogramm Pulver. Fügen Sie dem Pulver 14 Mikroliter Lösung hinzu, die HEPES enthält.

Ladelösung vertexen und nach unten schleudern, um gründlich zu mischen. Wickeln Sie die Durchstechflasche mit der Ladelösung mit Folie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Lagern Sie die Ladelösung bei minus 20 Grad Celsius in einem Gefrierschrank.

Verfahren zum Laden von Farbstoffen. Präparieren Sie einen kutanen Brustmuskel vom Tier. Montieren Sie das präparierte Gewebe in eine mit Silber ausgekleidete Petrischale.

Dehnen Sie das Taschentuch mit feinen Edelstahlnadeln. Geben Sie Ringer's Solution in die Petrischale. Schneide mit einer Rasierklinge ein kleines Stück, etwa 2 Millimeter des zehn Mikroliter Pipettenröhrchens vom dünnen Ende ab.

Bereiten Sie ein Stück Knetmasse vor, um die Füllpipette auf der Petrischale zu halten. Verbinden Sie die Füllpipette mit einer Kunststoffspritze durch einen Silikonschlauch und Adapter aus Pipettenröhrchen. Entfernen Sie die temporäre Ringer-Lösung mit einer Plastikpipette aus der Petrischale.

Trockene Zubereitung mit einer Spritze. Dadurch wird verhindert, dass die Lösung in der Füllpipette angesaugt wird. Nehmen Sie die Durchstechflasche mit der Ladelösung aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort auftauen.

Mit einer feinen Pinzette und einer Schere unter visueller Kontrolle und mit einem sterilen Mikroskop den Nerv in der Nähe des Muskels durchtrennen. Lassen Sie etwa zwei Millimeter Nervenstumpf übrig. Befestigen Sie die Füllpipette mit einem Schlauch und der Spritze mit Plastilin auf der Petrischale.

Bewegen Sie es in die Nähe des Nervenastes. Saugen Sie den Nervenstumpf vorsichtig in der Füllpipette an. Entfernen Sie das Saugrohr vom stumpfen Ende der Füllpipette.

Trocknen Sie den Nervenstumpf in der Füllpipette mit der Spritze. Schieben Sie die Füllpipette mit dem Nervenstumpf nach oben. Isolieren Sie den Nervenstumpf von außen mit Vaseline.

Trocknen Sie den Nervenstumpf in der Füllpipette noch einmal mit der Spritze ab. Ziehen Sie den Nullpunkt, fünf Mikroliter Ladelösung, mit einer Pipette mit einer langen Pipettenspitze. Führen Sie die Pipettenspitze mit der Ladelösung vorsichtig in die Füllpipette ein.

Werfen Sie die Mischung direkt auf den Nervenstumpf aus. Verschließen Sie das offene Ende der Füllpipette mit Vaseline. Geben Sie eine kleine Menge Lösung in die Petrischale.

Inkubieren Sie das Präparat bei Raumtemperatur an einem abgedunkelten und feuchten Ort für fünf Stunden. Nehmen Sie nach dem Inkubationsvorgang das Präparat und entfernen Sie die Füllpipette mit der Ladelösung. Geben Sie das Präparat in ein Bad und waschen Sie es mit Ringer-Lösung aus.

Bewahren Sie das Bad mit der Zubereitung über Nacht im Kühlschrank bei acht Grad Celsius Temperatur auf. Bereiten Sie das Gewebe für die Mikroskopie vor. Nehmen Sie das Präparat aus dem Bad.

Präparat in eine mit Silber ausgekleidete Kammer montieren und das Gewebe leicht dehnen. Spülen Sie das Tuch mit frischer Ringer-Lösung aus. Nehmen Sie die Saugstimulationselektrode.

Platzieren Sie die Stimulations-Saugelektrode in der Kammer, wobei sich die Spitze nahe am abgeschnittenen Ende des Nervs befindet. Ziehe den Nerv zur Elektrode. Die Konstruktion der Elektrode wird in Khazokoffs Artikel beschrieben, ein Link zum Artikel befindet sich in den Materialien.

Befestigen Sie die Präparationskammer auf dem Mikroskoptisch. Platzieren Sie den Temperaturfühler. Schließen Sie die Zulaufschläuche an ein Netzkabel für das Peltier-Element in der Vorbereitungskammer an.

Platzieren Sie den Abflussschlauch in der Vorbereitungskammer. Schalten Sie eine Perfusionspumpe ein. Schalten Sie den Begriff Controller-Einheit ein.

Stellen Sie die Temperatur an der Controller-Einheit auf 20 Grad Celsius ein. Installieren Sie einen UV-Schutzschild. Stellen Sie die Verzögerungsdauer und den Zeitraum auf dem Stimulator ein.

Verbinden Sie einen Draht von der Saugelektrode mit dem Stimulator. Schalten Sie es ein. Überprüfen Sie unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung die Muskelkontraktion, indem Sie den Stimulus einschalten.

Füllen Sie das Perfusionssystem mit einer Ringer-Lösung mit niedrigem Kalzium- und hohem Magnesiumgehalt. Stellen Sie die Perfusionsrate von etwa zwei Millilitern pro Minute ein. Setzen Sie das Objektiv für eine 40-fache Vergrößerung wieder ein.

Schalten Sie die Polychrome V ein.Wählen Sie die Emissionswellenlänge und die Dauertaktbeleuchtung. Öffnen Sie den Verschluss. Objektiv mit weniger als 40-facher Vergrößerung, im Fluoreszenzmodus sorgen Beleuchtungen dafür, dass die Anschlüsse belastet werden.

Suchen Sie das Terminal und fokussieren Sie sich darauf. Der belastete Nerv und die gut geladenen motorischen Nervenendigungen sind in der Abbildung dargestellt. Videoaufnahme mit der Red-Short Neuro CCD-Kamera.

Führen Sie die Turbo-SM-Software aus. Wählen Sie "Einstellungen ändern" aus. Die eingegebene Anzahl der Frames beträgt 500.

Geben Sie den Namen des Experiments ein. Die Grundkonfiguration beträgt 1000 Bilder pro Sekunde. 80 mal 80.

Wählen Sie einen externen Trigger. Geben Sie die Zeit vor dem Auslösen ein. Minus zehn Millisekunden.

Geben Sie die Anzahl der Wiederholungen ein, 20. Wählen Sie in der Polychrome-Software den externen Trigger-Beleuchtungsmodus aus. Führen Sie die Clampex-Software aus.

Protokoll zur Stimulation der Belastung. Das Protokoll steht zum Download auf unserer Laborseite auf der Website der Föderalen Universität Kasan zur Verfügung. Nehmen Sie vor der Aufnahme ein dunkles Bild in der Turbo-SM-Software auf.

Wählen Sie auf dem trinokularen Würfel die Lichtwegaustauschstufen aus. 100 Prozent für die Kamera. Führen Sie das Stimulationsprotokoll aus.

Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und überprüfen Sie das Signal. Als Reaktion auf die Nervenstimulation erfassen wir eine Änderung der Fluoreszenzintensität, die den Eintritt von Kalzium in die Nervenendigung widerspiegelt. Datenanalyse.

Wählen Sie in der Turbo-SM-Software Datei aus. Wählen Sie dann den Durchschnitt der Dateien aus. Wählen Sie Dateien aus.

Geben Sie den Namen der durchschnittlichen Datei ein und mitteln Sie sie. Speichern Sie die durchschnittliche Datei als Anpassungsdatei. Auswählen, als Anpassungsdatei speichern.

Geben Sie den Dateinamen ein und speichern Sie ihn. Führen Sie Image J aus und öffnen Sie die folgenden Instrumente. Analyse, Tools, ROI-Manager.

Suchen Sie die gespeicherte durchschnittliche Datei im Anpassungsformat. Ziehen Sie es per Drag & Drop auf Bild J.Zoomen Sie das Fenster, um eine bessere Ansicht zu erhalten. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse über dem aus, was Sie für den Hintergrund halten.

Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu. Wählen Sie im ROI-Manager mehr aus. Mehrfach. Laden Sie den Mittelwert herunter.

Kopieren von Daten, Exportieren nach Excel. Verwenden Sie in Excel die Durchschnittsfunktion, um den Durchschnittswert des Hintergrunds für ein Verhältnis zu berechnen. Ohne Excel zu schließen, kehren Sie zum Bild J zurück.Schließen Sie das Fenster mit Hintergrundberechnung, ohne zu speichern.

Verwenden Sie den ROI-Manager, löschen Sie die rechteckige Hintergrundzeichnung. Offenes Instrument Prozess, Mathematik, Subtraktion. Geben Sie den berechneten gemittelten Wert des Schwellenwerts aus Excel ein, und subtrahieren Sie den Boden von den Stapeln.

Wählen Sie einen rechteckigen Bereich um eine Nervenendigung aus. Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu. Wählen Sie im ROI-Manager mehr, Mehr, Multi-Measure, Laden herunter, Mittelwert.

Kopieren und Einfügen in das Excel-Fenster. Verwenden Sie ein Excel-Instrumentendiagramm. Wählen Sie einen flachen Bereich, bevor Sie das Signal starten.

Laden Sie das Diagramm mit den Details von den ersten Werten der Fluoreszenz am Rest bis zum Anfang des Signals. Bestimmen Sie dann die Anzahl der Punkte, um die Ruhefluoreszenzwerte zu mitteln. Mitteln Sie diese Werte und ermitteln Sie dann die durchschnittliche Anzahl der Fluoreszenz im Rest.

Teilen Sie die Signale durch Fluoreszenz auf den Rest. Subtrahieren Sie eins und multiplizieren Sie mit 100 Prozent. Zeichnen Sie das Signal auf und berechnen Sie die Amplitude der Kalziumtransiente.

Die Zeitparameter von Fluoreszenzsignalen hängen von der Geschwindigkeit der Vorwärts- und/oder Rückwärtsreaktionen der Bildung von Calcium-Farbstoff-Komplexen ab. Die Anstiegszeit des Calciumsignals stellt die Dynamik des Calciumeintrags dar. Es ist die Diffusion im Terminal und die Wechselwirkung von Kalzium mit dem Farbstoff.

Der Zerfall von Calcium transient hängt von der Farbstoffaffinität und der Geschwindigkeit der Calciumpufferung und deren Entzug ab. Die Analyse der transienten Amplitude des Kalziums kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Wirkstoffe auf den Kalziumeintritt zu untersuchen, die an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt sind. Diese Belastungstechnik eignet sich gut für die Darstellung von Veränderungen des zytosomalen Kalziums.

Mit fluoreszierenden Indikatoren und der sowohl Einzelnervenstimulation als auch rhythmischer synaptischer Aktivität. Die Analyse der transienten Amplitude von Kalzium kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Kalziumeintritt zu untersuchen, der an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt ist. Es gibt einige wichtige Punkte, auf die wir achten wollen.

Das Inkubationsverfahren umfasst zwei Schritte. Inkubation bei Raumtemperatur und im Kühlschrank. Es ist wichtig, die Inkubationszeit mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur zu kontrollieren.

Abhängig von der Länge des Nervenstumpfes, dem Farbstoff und der Temperatur im Raum kann die Inkubationszeit variieren. Wenn Sie die präoperativen Endverschlüsse und proximalen Teile in der Nähe des Nervenstumpfes überbelichten, kann es zu einer Überlastung kommen. Durch die lange Inkubation im Kühlschrank verteilt sich der Farbstoff gleichmäßig entlang der Nervenenden.

Es ist wichtig, den Nerv innerhalb weniger Minuten nach dem Schneiden in die Farbstoffladelösung zu legen, damit der Farbstoff in den Nerv eindringen kann, da längere Zeitintervalle eine ineffektive Belastung erzeugten, vermutlich aufgrund des Empfangs eines geschlossenen Nervs. Um die Kompartimentierung des Farbstoffs zu reduzieren, ist es möglich, die verlängerte Form des Farbstoffs zu verwenden. Es ist sehr wichtig, die lange fluoreszierende Beleuchtung des Gewebes zu verhindern, da sie sein Überleben beeinträchtigt.

Wir verwenden Nomarski-Optiken im sichtbaren Lichtkanal, um nach den Anschlüssen zu suchen. Während der Aufnahme begrenzen wir die beleuchtete Sicht, durch die Blende. Die lange Dauer des Belastungsprozesses kann durch den Verschlussstempel des Nervs reduziert werden.

In diesem Fall kann ein Glas-Mikro-Bypass verwendet werden.