Name: Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Lernen Sie die Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs in Froschnervenendungen über einen Nervenstumpf. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung schneller Kalziumtransienten an neuromuskulären Endplatten.

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Diese Forschung wurde unter dem Programm der Russischen Regierung für das wettbewerbsorientierte Wachstum der Kazan Federal University und ein Stipendium der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983) durchgeführt. Wir danken vier anonymen Rezensenten für hilfreiche Kommentare zu früheren Entwürfen des Manuskripts. Wir danken Yuliya Aratskaya für die Voice Recording. Wir danken Dr. Victor Ilyin für die vielen hilfreichen Kommentare und die Hilfe bei der finale Bearbeitung des Manuskripts.

Experimente wurden an isolierten Nervenmuskelpräparaten des Musculus-Hautpectoris aus dem Rana-Ridibund- Frosch durchgeführt. Die Größe der Tiere beider Geschlechter betrug etwa 5-9 cm. Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Verwendung von Labortieren der Kazan Federal University und der Kazan Medical University in Übereinstimmung mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das experimentelle Protokoll erfüllte die Anforderungen der Richtlinie 86/609 / EWG der Europäischen Gemeinschaften und wurde vom Ethischen Komitee der Kazan Medical University genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösungen <ol><li> Vorbereitung der Ringer-Lösung. <ol><li> Vorbereitung der Ringer-Lösung: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO 3 und 1,8 mM CaCl 2 . Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. </li><li> Ringer-Lösung mit einem niedrigen Ca 2+ vorbereiten </Sup&gt; und hoher Mg 2+ -Gehalt: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO 3 , 6,0 mM MgCl 2 , 0,9 mM CaCl 2 . Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Farbstoff-Beladungslösung <ol><li> Die wasserbasierte Lösung, die HEPES-Na enthält, bei 10 mM (pH 7,2-7,4) vorbereiten. </li><li> Zugabe von 14 μl der HEPES-Lösung zu einer Durchstechflasche mit dem Farbstoff 30 . HINWEIS: Der Ca 2+ Indikatorfarbstoff kommt in eine 500 μl Durchstechflasche mit 500 μg Pulver. </li><li> Vortex und Spin unten, um gründlich zu mischen. </li><li> Verdünnen Sie die Lösung, um die Endkonzentration des Ca 2+ Indikators auf 30 mM zu bringen. Vermeiden Sie Licht und lagern bei -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Dye-loading Vorgehensweise <ol><li> Dissect den Haut Pectoris Muskel mit einem Stück der Pectoralis Proprius Nerv. HINWEIS: Das Sektionsverfahren steht zur VerfügungIn einem kostenlosen Download der Zeitung von Blioch et al. , 1968 31 . <ol><li> Für die Dissektion Verfahren, verwenden Sie zwei feine Pinzette und Hornhaut Schere (siehe die Tabelle der Materialien ). Übertragen Sie das seziertes Gewebe in eine mit Ringer-Lösung vorgefüllte, mit Silicium-Elastomer beschichtete Petrischale und fixieren Sie das Gewebe mit feinen Edelstahl-Stiften, so dass es leicht in der Schale gedehnt wird. </li><li> Die Petrischale mit einem frischen Aliquot der Ringer-Lösung wieder auffüllen. Entfernen Sie das Bindegewebe. Beschädige den Nerv nicht. </li></ol></li><li> Die Abfüllpipette vorbereiten: Mit einer Rasierklinge ein 2 mm langes Stück des konischen Teils einer handelsüblichen Plastik 10 μl Pipettenspitze ausschneiden. </li><li> Bereiten Sie ein Stück Modellier-Ton vor, um die Füllpipette auf der Petrischale zu montieren. </li><li> Verbinden Sie die Rückseite der Füllpipette mit einer Plastikspritze über Silikonschlauch und Kunststoff-Anschlussadapter aus Pipettenspitzen. </li><li> Vor dem dSie laden die Ringer-Lösung aus der Petrischale mit einer Plastikpipette. Trocknen Sie die Muskel-Nerv-Vorbereitung mit einer feinen Spritze; Dadurch wird die Verdünnung des Ca 2+ -Farbstoffes bei der nachfolgenden Beladung der Füllpipette verhindert. </li><li> Entfernen Sie die Ca 2+ Indikator-Durchstechflasche aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort auftauen. </li><li> Unter Stereomikroskop-Steuerung mit geringer Vergrößerung (10 ×), erkennen die Verbindung zwischen dem Muskel und dem Nerv. Mit feinen Pinzetten und Scheren, schneide den Pectoralis Proprius Nerv in der Nähe der Muskeloberfläche (siehe Schritt 2.1). Lassen Sie einen Nervenstumpf ca. 2 mm lang. </li><li> Fixieren Sie die mit dem Schlauch versehene Füllpipette und die Spritze auf der Petrischale mit dem Modellieren von Ton. </li><li> Bewegen Sie die Spitze der Pipette in die Nähe des Nervenstumpfes. </li><li> Ohne ihn zu kneifen, den Nervenstumpf sanft in die Spitze der Füllpipette zu strecken. </li><li> Den Saugschlauch vom Blun entfernenT Ende der Füllpipette. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Lösung aus der Füllpipette mit einer Spritze mit langer Nadel (siehe Tabelle der Materialien ). Kneipen Sie nicht den Nervenstumpf. </li><li> Die Spitze der Füllpipette leicht vertikal anheben und den Nervenstumpf in die Spitze stecken lassen. </li><li> Isolieren Sie den angesaugten Teil des Nervenstumpfes von der Außenseite der Füllpipettenspitze mit Petroleumgelee. </li><li> Den Nervenstumpf, der bei Bedarf in der Füllpipette isoliert ist, abtrocknen: den Überlauf der Lösung aus der Füllpipette vorsichtig mit einer Spritze mit langer Nadel abspülen. </li><li> Zeichnen Sie 0,5 μl der Farbstoff-Beladungslösung (siehe Schritt 1) ​​mit einer Pipette mit einer langen Pipettenspitze. </li><li> Die Pipettenspitze vorsichtig in die Füllpipette legen. Die Mischung direkt auf den Nervenstumpf auswerfen. </li><li> Das offene Ende der Füllpipette mit Vaseline abdichten. </li><li> Füge ein kleines Aliquot von Ringer&#39;s hinzuAuf die Petrischale, um die Zubereitung nass zu halten. </li><li> Inkubieren Sie die Zubereitung bei Raumtemperatur unter dunklen und nassen Bedingungen für 5 h. </li><li> Entfernen Sie die Füllpipette mit der Beladungslösung, spülen Sie die Zubereitung mit der Ringer-Lösung aus und bewahren Sie sie über Nacht im Kühlschrank bei 8 ° C auf. </li></ol> 3. Vorbereitung des Gewebes für die Mikroskopie <ol><li> Montieren Sie das Präparat in die Silicium-Elastomer-beschichtete Kammer und fixieren Sie es mit Stahl-Mikronadeln, so dass es leicht gestreckt wird. </li><li> Spülen Sie das Gewebe mit einem Aliquot der frischen Ringer-Lösung. </li><li> Verwenden Sie eine Saug-Elektrode, um den Nerv zu stimulieren; Aufbau der Elektrode ist ab dem kostenlosen Download des Papiers von Kazakov et al. , 2015 32 . Positionieren Sie die Elektrodenspitze nahe an das geschnittene Ende des Nervs und saugen Sie den Nervenstumpf in die Elektrodenöffnung ein. </li><li> Montieren Sie die Vorbereitungskammer auf der Mikroskopstufe. PlacE die Temperatursonde und die Einlass- und Auslassbrände in der Kammer. </li><li> Verbinden Sie das Netzkabel mit dem Peltier-Element. </li><li> Um die Vorbereitung zu überbrücken, verwenden Sie ein einfaches Schwerkraft-System. Um die überschüssige Lösung zu entfernen, schalte die Perfusions-Saugpumpe ein. </li><li> Schalten Sie die Thermo-Controller-Einheit ein. </li><li> Stellen Sie die Temperaturregelung auf 20 ° C ein. </li><li> Den Ultraviolettschutzschild montieren. </li><li> Verbinden Sie die stimulierende Drahtelektrode mit dem elektrischen Stimulator und beobachten Sie die Muskelkontraktionen unter dem Mikroskop mit einem 4fach Objektiv. </li><li> Füllen Sie das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg 2+ -Gehalt auf. HINWEIS: Diese Lösung wird verwendet, um Muskelkontraktionen zu verhindern. Eine Abnahme der Konzentration von externem Calcium und eine Erhöhung des externen Magnesiums führt zu einer Verringerung der Amplitude von Ca 2+ -Transienten. Auf der Grundlage früherer Erfahrungen wurden jedoch 0,9 mM CaCl <sub&gt; 2 und 6 mM MgCl 2 reichen noch aus, um die Amplitude der Ca 2+ -Transienten zuverlässig aufzulösen. Es ist erwähnenswert, dass es einige andere Möglichkeiten gibt, Muskelkontraktionen zu verringern, ohne die Ca 2+ -Konzentration zu reduzieren. Zum Beispiel würde die Verwendung von d-Tubocurarin oder alpha-Bungarotoxin, spezifische Blocker von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, ganz oder teilweise Muskelzuckungen blockieren 17 , 27 , 28 , 30. Jedoch kann die Zugabe dieser Toxine auch den präsynaptischen Calciumeintrag beeinflussen. Um dies zu vermeiden, kann μ-conotoxin GIIIA verwendet werden 27 . </li><li> Schalten Sie die Pumpe ein und starten Sie die Superfusion der Präparation mit der Ringer-Lösung mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg 2+ . </li><li> Wechseln Sie zum 40 × Objektiv auf dem Mikroskop. </li><li> Schalten t<html> Er Monochromator (siehe Tabelle der Materialien ). </li><li> Wählen Sie eine Emissionswellenlänge von 488 nm und eine kontinuierliche Beleuchtungsart in der Monochromator-Steuerungssoftware. </li><li> Bei hoher Vergrößerung im Fluoreszenzmodus ist darauf zu achten, dass die Nervenklemmen mit dem Farbstoff beladen wurden. </li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Nerven und Klemmen mit geladenem Ca 2+ Indikator. ( A ) Nerv gefüllt mit Ca 2+ Indikator nach dem Ladevorgang. Maßstab = 200 μm. ( B ) Nervenendigungen mit Ca 2+ Indikator gefüllt Maßstab = 20 μm. ( C ) Ca 2+ -indikator-Fluoreszenz ist deutlich sichtbar im Nervenende. Maßstab = 20 μm._blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="17"><li> Man läßt die Zubereitung für mindestens 30 min in der Niedrig-Ca 2+ und der Hoch-Mg 2+ -Lösung äquilibrieren. </li></ol> 4. Videoaufnahme mit der Digital CCD Kamera Anmerkung: Die Details der Erfassung von Fluoreszenzsignalen sind für jedes Mikroskop und Kameratyp spezifisch, aber die Hauptbetrachtung ist die Bildaufnahmegeschwindigkeit. <ol><li> Verwenden Sie 1 kHz als minimale Aufnahmefrequenz für Aufnahmen von einzelnen Ca 2+ Transienten im NMJ. HINWEIS: Für die Fluoreszenz-Bildgebung sind schnelle digitale CCD-Kameras erforderlich (siehe Tabelle der Materialien ). Das Datenerfassungssystem und die Software (siehe Tabelle der Materialien ) wurden hier für die Synchronisation von Kamera, Monochromator und Stimulator verwendet. Kurz gesagt, erlaubt dieses Protokoll die Erzeugung von Synchronisationsimpulsen an digitalen Ausgängen der DatenErfassungssystem, um den Verschluss zu öffnen, das Videosignal zu erfassen und Stimulation zu initiieren. Alle zeitlichen Parameter können in den Protokollen und / oder auf den Geräten eingestellt werden. Ein typisches Protokoll ist eine Serie von 500 Bildern, die bei 1 kHz (80 x 80 Pixel) aufgenommen wurden. Die Beleuchtung mit Anregungslicht kann den Ca 2+ Indikator ausbleichen und das Zellgewebe photodamieren. So vermeiden Sie lange Belichtungsrisiken. In diesem Protokoll ist der Shutter nur für die Zeit geöffnet, die benötigt wird, um das Video zu erfassen. Erwerben Sie zwanzig Serien pro spezifischem Nervenendgerät. Ziel ist es, die gleichen Standorte in der Kontrollgruppe und nach der Medikamentenabgabe zu überwachen. </li><li> Unter dem 4X Objektiv eines Mikroskops verwenden Sie das Hellfeldregime, um die Muskel- und Nervenzweige zu visualisieren. </li><li> Wechseln Sie auf die 40X Objektivlinse und suchen Sie mit dem Epifluoreszenzregime und einer Anregungswellenlänge von 488 nm nach farbstoffbeladenen Nervenendungen. Identifizieren Sie eine nervenende Region von Interesse. </li><li> Auf dem trinokulären Rohr oF das Mikroskop, wähle die Lichtweg-Austauschstufen: 100% Licht zur Kamera. </li><li> Starten Sie die Erfassungssoftware für die CCD-Kamera. </li><li> Unter &quot;Live&quot; -Modus finden Sie den ROI und passen Sie den Fokus an. </li><li> Wählen Sie das Menü &quot;Ändern&quot;. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Grundkonfiguration&quot; bei 1.000 Bildern pro Sekunde (fps) mit einer Auflösung von 80 x 80. </li><li> Stellen Sie die Anzahl der Eingabefelder auf 500 ein. </li><li> Geben Sie den Namen des Experiments ein. </li><li> Wählen Sie &quot;Externer Trigger&quot;. </li><li> Stellen Sie die Vor-Trigger-Zeit auf 10 ms ein. </li><li> Legen Sie die Anzahl der Wiederholungen auf 20 fest. </li><li> Wählen Sie in der Monochromator-Steuerungssoftware eine Emissionswellenlänge von 488 nm und den Modus &quot;externe Triggerbeleuchtung&quot; aus. </li><li> Führen Sie die Datenerfassungssoftware aus. </li><li> Laden Sie das Stimulationsprotokoll. </li><li> Bevor Sie das Video aufnehmen, erfassen Sie den dunklen Rahmen mit der Video-Erfassungssoftware. </li><li> Führen Sie das Stimulationsprotokoll aus. </li><li> Wählen Sie den ROI und checK das aufgezeichnete Signal. </li></ol> 5. Datenanalyse NoOTE: Für die Datenanalyse verwenden Sie die CCD-Kamera-Software und ImageJ; Die Daten werden als Kurve in einem Tabellenkalkulationsprogramm dargestellt. In der CCD-Kamera-Software, durchschnittlich 20 Wiederholungen und exportieren Sie die Ergebnisse in eine ImageJ-Support-Datei. Wählen Sie in ImageJ den ROI und den Hintergrund aus. Subtrahiere den Hintergrund vom ROI. Stellen Sie die Daten als Verhältnis dar: (ΔF / F 0 -1) x 100%, wobei ΔF die Intensität der Fluoreszenz während der Stimulation ist und F 0 die Intensität der Fluoreszenz in Ruhe ist. <ol><li> Klicken Sie in der Erfassungssoftware für die CCD-Kamera auf Datei&gt; Durchschnittliche Dateien. Wählen Sie die Dateien aus und bewerten Sie sie. </li><li> Speichern Sie die gemittelte Datei als .fit-Datei, indem Sie auf &quot;Save as Fit file&quot; klicken. </li><li> Führen Sie die ImageJ Software aus. Führen Sie die folgenden Schritte aus: </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast. </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Stapel&gt; Werkzeuge&gt;; Stapelsortierer </li><li> Klicken Sie auf Analysis&gt; tools&gt; ROI Manager. </li><li> Ziehen Sie die gemittelte .fit-Datei in das ImageJ-Fenster. </li><li> Vergrößere das Fenster für eine bessere Ansicht. </li><li> Wenn Sie den Cursor bewegen, wählen Sie den letzten Rahmen aus und löschen ihn (dies ist der dunkle Rahmen) </li><li> Wählen Sie einen rechteckigen ROI über dem Bereich, der als Hintergrund betrachtet wird. Füge es dem ROI-Manager hinzu </li><li> Messen Sie den Hintergrund, indem Sie auf Mehr&gt; Multi Measure klicken. Beachten Sie die MEAN. Kopiere die Daten, exportiere sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm und berechne den Mittelwert der Schwelle für ein Verhältnis. </li><li> Subtrahiere den Schwellenwert von den Stapeln, indem du auf Prozess&gt; Haupt&gt; Subtrahier klickst. Geben Sie den gemittelten Wert des Schwellenwerts ein. </li><li> Wählen Sie einen rechteckigen ROI um ein Nerven-Terminal. Füge es dem ROI-Manager hinzu. </li><li> Messen Sie durch Klicken auf Mehr&gt; Multi Messen. Beachten Sie die MEAN. Kopiere und exportiere sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm. </li><li> Durchschnitt der Offset der Signale. HINWEIS: Verwenden Sie dieZuerst mehrere Dutzend Punkte, die die Basisfarbstofffluoreszenz ohne Stimulation zeigen; Das ist die Fluoreszenz in Ruhe. </li><li> Teilen Sie die Signale durch die Fluoreszenz in Ruhe. </li><li> Subtrahiere &quot;1&quot; und multipliziere mit 100%. </li><li> Zeichnen Sie das Signal und berechnen Sie die Amplitude des Ca 2+ transienten. </li></ol>

<ol><li>Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">How does calcium trigger neurotransmitter release?</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li>
<li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+dynamics%2C+Ca2%2B+buffers+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li>
<li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li>
<li>Pang, Z. P., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Ca2%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li>
<li>Molgó, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li>
<li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li>
<li>Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2538708">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20194474">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li>
<li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Pflug+Arch+Eur+J+Phisiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627302005731">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li>
<li>Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRegehr%2C+WG+%22Imaging+in+neuroscience+and+development%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li>
<li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+loading+with+Patch+Pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li>
<li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li>
<li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen%2Fglucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li>
<li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2%2B+elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li>
<li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li>
<li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li>
<li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8893033">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li>
<li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li>
<li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://research-journal.org/en/biology-en/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).</li>
<li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li>
<li>Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li>
<li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li>
<li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152728">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li>
<li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17182774">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li>
<li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li>
<li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-016-0318-6">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit präsentierten wir die Methode der Durchführung von Ca 2+ -sensitiven Farbstoffbeladung in Froschnervenenden durch den Nervenstumpf. Am Ende des Ladevorgangs haben alle Terminals im proximalen Teil des Nervs signifikante Fluoreszenzwerte. Es wurde geschätzt, dass die intra-terminale Konzentration der Sonde zwischen 40 und 150 μM 17 variiert. Das Inkubationsverfahren wird in zwei Schritten durchgeführt: bei Raumtemperatur und dann bei einer niedrigeren Temperatur im Kühlschrank. Es ist wichtig, die Zeit der Gewebeinkubation mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur zu kontrollieren. Abhängig von der tatsächlichen Länge des Nervenstumpfes, dem spezifischen Farbstoff und der Temperatur kann die Inkubationszeit variieren. Wenn überbelichtet, können Terminals in den proximalen Teilen nahe dem Nervenstumpf überlastet werden. Doch im mittleren Teil des Nervs ist es immer noch möglich, Terminals zu finden, die zufriedenstellend beladen sind. Während thE lange Inkubation im Kühlschrank, der Farbstoff ist gleichmäßig über die Nervenenden verteilt. Unsere eigenen Beobachtungen 33 , 35 sowie die Daten anderer Forscher 30 beweisen das Fehlen eines nennenswerten Einflusses des Ladevorgangs auf die Amplitude der postsynaptischen Antwort oder auf die Häufigkeit der Miniatur-Endplattenpotentiale. Gute Langlebigkeit wurde in den geladenen Vorbereitungen dokumentiert. Es gibt einige wichtige Punkte, auf die wir uns freuen möchten. Es ist sehr wichtig, den Nervenstumpf innerhalb weniger Minuten nach der Exzision in die Farbstofflade-Lösung zu legen, damit der Farbstoff in die Axone des Schnittnervs eindringen kann; Verzögerungen können eine unwirksame Belastung verursachen, vermutlich aufgrund der Wiederverschließung der Nervenaxone 27 , 36 . Einige Ermittler tauchen den Nervenstumpf in 100 mM EDTA (ein Ca 2+ - und Mg 2+ -Gelator ein) Unmittelbar nach der Exzision des Nervs, um zu verhindern, dass die geschnittenen Axone wieder verschließen. Der Puffer wird nach 1-2 min entfernt und durch eine Farbstoffladelösung 37 ersetzt . Die Verwendung eines Petroleum-Jelly-Well anstelle von Plastikschläuchen für den Ladevorgang ermöglicht die Verwendung eines kürzeren Nervenstumpfes. Bei der Anwendung dieses Ansatzes wird der Nerv geschnitten, nachdem er in die HEPES-Lösung mit Farbstoff eingetaucht ist und die Axone aufgrund des Mangels an zweiwertigen Ionen in der Farbstofflösung 27 , 28 nicht wieder verschließen. In unserer Studie verwendeten wir die wasserlösliche Salzform des Ca 2+ Indikators anstelle von Dextran. Die Dextran-Konjugate diffundieren im Axon langsamer als die Salzformen. Die Verwendung des Dextran-Konjugats verringert jedoch die Farbstoffkompartimentierung und die Handhabung durch den Nerv und die NMJs. Calcium Green 1-3000 MW Dextran Konjugat hat eine gute Diffusionsrate und zeigt eine reduzierte Kompartimentierung <s<html> Up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. Es ist sehr wichtig, eine lange Zeit der Fluoreszenzbeleuchtung des Gewebes zu vermeiden, weil dies seine Gesundheit und sein Überleben beeinflusst. Wir verwenden Nomarski-Optik im sichtbaren Lichtkanal, um nach Nerven-Terminals zu suchen. Während der Aufnahme beschränken wir das beleuchtete Feld mit einer Membran. Es ist bemerkenswert, dass diese Belastungsmethode nur für Zubereitungen geeignet ist, die langen Inkubationen standhalten können. Um die Farbstoffbelastungszeit zu reduzieren, wenn Studien an zerbrechlicheren Geweben durchgeführt werden ( z. B. Synapsen von Warmblütern), ist es notwendig, die Nervenstumpflänge zu verkleinern und Mikropipetten zum Beladen zu verwenden 29 , 39 . Diese Ladetechnik eignet sich hervorragend für die Abbildung von Veränderungen in zytosolischem Ca 2+ mit fluoreszierenden Indikatoren sowohl bei der Nervenstimulation als auch bei der rhythmischen synaptischen AktivitätEf &quot;&gt; 17 , 27 , 35. Die Analyse der Ca 2+ -Transientenamplitude kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Calciumeintrag zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung 33 beteiligt ist .

Calciumionen (Ca 2+ ) beteiligen sich an vielen neuronalen Signalisierungsprozessen, einschließlich der Initiierung, Instandhaltung und Plastizität der Mediatorfreisetzung 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Bei der Ankunft des Aktionspotentials tritt extrazelluläres Ca 2+ in das Nervenendgerät ein und initiiert die Neurotransmitterfreisetzung. Bei einigen Synapsen kann der Calciumstrom direkt durch elektrophysiologische Methoden 6 , 7 , 8 gemessen werden. Im Falle des neuromuskulären Übergangs (NMJ) kann man aufgrund der geringen Größe der Nervenendigungen keine direkte Patch-Clamp- und Zwei-Elektroden-Spannungsklemme verwenden. Aufzeichnungen von nach innen gerichteten Ca 2+ Strömen aus den Nervenendigungen im NMJ können durch indirekte Elektrophys durchgeführt werdenIologische Methoden 9 , 10 . Diese Verfahren erfordern jedoch die Vorbehandlung der Synapse durch Natrium- und Kaliumionen-Kanalblocker. Optische Verfahren erfordern keine pharmakologische Trennung von Ionenströmen im Nervenendgerät und erlauben Aufnahmen von Ca 2+ -Einstrom, die durch Aktionspotentiale ausgelöst werden, und die anschließende Erhöhung von Ca 2+ -Ionen im Axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Diese Methoden basieren auf Aufzeichnungen von Veränderungen der Fluoreszenz von spezifischen Ca 2+ -sensitiven Farbstoffen bei der Bindung von freien Ca 2+ -Ionen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Ca 2+ Indikatoren können in die c geladen werdenElls durch eine Vielzahl von Methoden, je nach dem Zweck des Experiments. Forscher nutzen die Badanwendung von membranpermeablen Farbstoffformen 20 , 21 , Beladen über Patchpipette 22 oder Mikroinjektion 23 , 24 , 25 . Allerdings haben alle diese Methoden einige Einschränkungen im Falle des NMJ aufgrund seiner Besonderheiten in der synaptischen Architektonik. Für die NMJ ist die bequemste und erfolgreichste Methode, den Farbstoff durch den Nervenstumpf zu laden, ein Vorwärtsfüllverfahren 26 , 27 , 28 , 29 . Diese Technik kann zum Laden verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in die peripheren Nervenendigungen verwendet werden. Diese Methode wurde erfolgreich für Drosophila Nerven-Terminals 28 , die Eidechse Motor Nerv verwendet28 und Froschmotornervenanschlüsse 17 , 26 , 27 , 30 . Je nach Untersuchungsobjekt können methodische Details variieren. Eine Glas-Mikropipette kann für kleine Nerven von Larven 28 eingesetzt werden . Mehrere Forscher haben eine Methode 27 , 28 beschrieben , in der ein frisch geschnittenes Ende des Nervs, das einen Muskel innerviert, in eine mit einem Farbstoff vorgefüllte Vertiefung eingetaucht wird. Die Vorbereitung wird dann für mehrere Stunden belassen, um den Farbstoff einzuweichen. Der Farbstoff wird von den Axonen eingeweicht und zu den Nervenendigungen transportiert. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zum Beladen eines Fluoreszenzindikators in Frostmotornervenendigungen durch den Nervenstumpf. Unser Protokoll verwendet eine Plastikpipettenspitze für die Inkubation des Gewebes mit einem Farbstoff. Wir beschreiben auch, wie man Ca 2+ Fluoreszenz tra zu erwerben und zu analysierenNsients

<table><tbody><tr><td>Ca2+ Indikator</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 Hexakaliumsalz, O6806</td><td>500 &mu; g</td></tr><tr><td>Silikon-Elastomer</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184</td> Elastomer-Pipette <td></td></tr><tr><td></td><td>Biohit, Russland</td><td>720210</td><td>0,5-10&Mikro; L</td></tr><tr><td>Pipettenspitze</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>02-707-175</td><td>10&micro; L</td></tr><tr><td>Pipettenspitze</td><td>Biohit, Russland</td><td>781349</td><td>10&micro; L</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Feine Scince Werkzeuge, Kanada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Hornhaut-Mini-Schere</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>Juwelierzange</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>Juwelierzange</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>Modellierung Lokaler Tonproduzent</td><td></td><td></td><td>kann durch jeden lokalen Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Vaseline</td> lokaler <td>Hersteller</td><td></td><td>kann durch jeden lokalen Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&nbsp;</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multispin MSC 3000</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Injektionsnadeln</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0,4-fach; 40mm</td></tr><tr><td>Syrynge</td><td>lokaler Produzent</td><td></td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Mikroskop, BX51</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>pClamp Software, Version 10</td><td>Protokoll kann heruntergeladen werden unter: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>Bad- und Badtemperaturregler</td><td>Experimental Builder</td><td></td><td>Kann durch jede Kammer mit Temperaturregelung ersetzt werden. Zum Beispiel von https://www.warneronline.com/&nbsp;</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics, Germany</td><td>Polychrome V</td><td>nicht mehr lieferbar, kann durch andere ersetzt werden&nbsp; &nbsp; Stabile Lichtquelle 488 nm</td></tr><tr><td>Monochromator-Steuerungssoftware</td><td>Till Photonics, Deutschland</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>Digitale CCD-Kamera</td><td>Redshirt Imaging, USA</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Modell 2100 Isolierter Impulsstimulator</td><td>A-M Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erfassungssoftware für CCD-Kamera</td><td>Redshirt Imaging, USA</td><td>Turbo SM Software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Tabellenkalkulationsprogramm</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

laden eines kalziumfarbstoffs in froschnervenendungen durch den nervenstumpf: calciumübergangsregistrierung im frosch neuromuscular junction

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Eine der am meisten machbaren Methoden zur Messung von präsynaptischen Calciumspiegeln in präsynaptischen Nervenendigungen ist die optische Aufzeichnung. Es basiert auf der Verwendung von calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen, die ihre Emissionsintensität oder Wellenlänge in Abhängigkeit von der Konzentration an freiem Calcium in der Zelle verändern. Es gibt mehrere Methoden, um Zellen mit Kalziumfarbstoffen zu färben. Am häufigsten sind die Prozesse der Beladung der Farbstoffe durch eine Mikropipette oder Vorinkubation mit den Acetoxymethylesterformen der Farbstoffe. Allerdings sind diese Methoden nicht anwendbar auf neuromuskuläre Übergänge (NMJs) aufgrund methodischer Probleme, die entstehen. In diesem Artikel stellen wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf des Froschnervs in die Nervenendigungen vor. Da der Eintritt von externem Calcium in Nervenendigungen und die anschließende Bindung an den Calciumfarbstoff innerhalb der Millisekunden-Zeitskala erfolgt, ist es notwendig, ein schnelles Bildgebungssystem zu verwenden, um diese interactio aufzuzeichnenNs Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Aufzeichnung des Calcium-Transienten mit einer schnellen CCD-Kamera.

Nach der Farbstoffbeladung und bei der motorischen Nervenstimulation kann in den Nervenendigungen eine Erhöhung der Amplitude des Fluoreszenzsignals (Ca 2+ transient) detektiert werden (siehe Abbildung 2 ). Die Parameter der Ca 2+ -Transienten sind in Tabelle 1 dargestellt . Quantitativ sind die Parameter der Ca 2+ -Transienten, die in unserer Studie gemessen wurden, in der Nähe der Daten, die von anderen Wissenschaftlern bei Synapsen von kaltblütigen Tieren 15 , 34 erhalten wurden . Die Parameter der Ca 2+ -Transienten hängen von der Bindungsrate von Ca 2+ mit dem Farbstoff und der anschließenden Dissoziation ab. Die Eintrittsrate von Ca 2+ in die Nervenendung, die Wechselwirkung mit dem Farbstoff und die Diffusion im Cytoplasma beeinflussen die Anstiegszeit des Ca 2+ transienten. Die Abklingzeit des Fluoreszenzsignals hängt von der Affinität des Farbstoffs ab,Die Geschwindigkeit der Ca 2+ -Interaktion mit intrazellulären Puffern und die Entfernung durch Ionenpumpen 35 . Die Amplitudenanalyse von Ca 2+ -Transienten kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Calciumeintrag zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung 33 beteiligt ist . <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Die gemittelte Ca 2+ Transient gemessen im Frosch NMJ. Der Ca 2+ -Transient wurde auf der Basis des Durchschnitts der Signale von 13 Frosch-NMJs berechnet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> HauptΔF / F (%) </td><td> Anstiegszeit 20% -80% (ms) </td><td> Τ (ms) </td></tr><tr><td> 12,6 ± 1,1 (n = 13) </td><td> 4,6 ± 0,5 (n = 13) </td><td> 115,3 ± 8,3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Die gemittelten Parameter des Ca 2+ transienten. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt; N ist die Anzahl der Messungen in verschiedenen NMJs. Der Peak ΔF / F ist die gemittelte Amplitude von ΔF / F.

Hier beschreiben wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf in die Nervenendigungen. Wir stellen auch ein Protokoll für die Aufzeichnung und Analyse von schnellen Calcium-Transienten in den peripheren Nervenenden vor.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Hallo, mein Name ist Dimitry Samigullin, ich arbeite im Labor für Biophysik synaptischer Prozesse am Kasaner Institut für Biochemie und Biophysik der Russischen Akademie der Wissenschaften. In unserem Labor untersuchen wir vielfältige Mechanismen der Kalziumsignalisierung an der neuromuskulären Synapse. Eine der am besten geeigneten Methoden, um die Kalziumkonzentration auf synaptischer Ebene zu messen, ist die optische Aufzeichnung.Hier beschreiben wir die Methode der Beladung mit einem kalziumsensitiven Farbstoff über einen Nervenstumpf in den Froschnervenendigungen. Außerdem stellen wir das Protokoll zur Messung und Analyse eines breiten Kalziumtransienten in Froschendigungen vor. Mit dieser Methode ist es möglich, den Einfluss wirksamer Wirkstoffe auf die präsynaptische Kalziumkonzentration während der synaptischen Aktivität zu untersuchen.Herstellung der Farbstoff-Lösung. Der fluoreszierende Kalziumfarbstoff Oregon Green BAPTA liegt in Form von 500 Mikrogramm Pulver vor, geliefert in 500 Mikrolitern. Geben Sie 14 Mikroliter einer Lösung, die HEPES enthält, zum Pulver hinzu.Lösung kurz vortexen und zur vollständigen Vermischung kurz centrifugieren. Das Gefäß mit der Ladelösung mit Aluminiumfolie abdecken, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Die Ladelösung bei minus 20 Grad Celsius im Gefrierschrank lagern.Verfahren zur Farbstoffbeladung. Disponieren Sie einen Hautmuskel des Tieres. Montieren Sie das präparierte Gewebe in einer silberbeschichteten Petrischale.Dehnen Sie das Gewebe mit feinen Edelstahlnadeln. Geben Sie Ringer-Lösung in die Petrischale. Schneiden Sie mit einem Rasierklingenmesser ein kleines Stück von etwa 2 Millimetern aus dem zehn-Mikroliter-Pipettierrohr vom dünnen Ende ab.Bereiten Sie ein Stück Plastilin vor, um die Füllpipette auf der Petrischale zu befestigen. Verbinden Sie die Füllpipette über einen Silikon­schlauch und Adapter aus Pipettenspitzen mit einer Plastikspritze. Entfernen Sie die temporäre Ringer-Lösung aus der Petrischale mithilfe einer Plastikpipette.Trockene Vorbereitung mit einer Spritze. Dadurch wird verhindert, dass die Lösung in die Füllpipette gesaugt wird. Entfernen Sie das Fläschchen mit der Ladelösung aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur auftauen.Mit einer feinen Pinzette und einer Schere unter Sichtkontrolle mit dem sterilen Mikroskop den Nerv nahe am Muskel durchschneiden. Etwa zwei Millimeter des Nervenstumpfs stehen lassen. Die Füllpipette mit einem Schlauch und der Spritze mit Knetmasse auf der Petrischale fixieren.Bewegen Sie es nahe an den Nervenast heran. Aspirieren Sie vorsichtig den Nervenstumpf in der Füllpipette. Entfernen Sie das Saugrohr vom stumpfen Ende der Füllpipette.Trocknen Sie den Nervenstumpf in der Füllpipette mit der Spritze. Bewegen Sie die Füllpipette mit dem Nervenstumpf nach oben. Isolieren Sie den Nervenstumpf von außen mit Vaseline. Nochmals trocknen Sie den Nervenstumpf in der Füllpipette mit der Spritze. Mit einer Pipette und einer langen Pipettenspitze 0,5 µL der Ladelösung aufziehen. Die Pipettenspitze mit der Ladelösung vorsichtig in die Füllpipette einführen.Spritzen Sie die Mischung direkt auf den Nervenstumpf. Verschließen Sie das offene Ende der Füllpipette mit Vaseline. Geben Sie eine kleine Menge der Lösung in die Petrischale.Die Probe fünf Stunden bei Raumtemperatur an einem dunklen und feuchten Ort inkubieren. Nach der Inkubation die Probe entnehmen und die Füllpipette mit der Belösung entfernen. Die Probe in ein Bad geben und mit Ringer-Lösung ausspülen.Die Probe über Nacht bei einer Temperatur von acht Grad Celsius im Kühlschrank belassen. Das Gewebe für die Mikroskopie vorbereiten. Die Probe aus dem Bad entnehmen.Präparat in einer versilberten Kammer montieren und das Gewebe leicht dehnen. Das Gewebe mit frischer Ringer-Lösung spülen. Die Saugstimulationselektrode nehmen.Platzieren Sie die Stimulations-Saug-Elektrode in der Kammer, sodass ihre Spitze nahe am durchtrennten Nervenende liegt. Ziehen Sie den Nervenstrang in die Elektrode hinein. Der Aufbau der Elektrode wird in Khazokoffs Artikel beschrieben, ein Link zu dem Artikel befindet sich in den Materialien.Befestigen Sie die Präparationskammer auf dem Mikroskopständer. Platzieren Sie die Temperatursonde. Schließen Sie die Zulaufschläuche an ein Netzkabel für das Peltier-Element in der Präparationskammer an.Platzieren Sie das Ausflussrohr in der Präparationskammer. Schalten Sie eine Perfusionspumpe ein. Schalten Sie die Temperaturregelungseinheit ein.Stellen Sie die Temperatur am Steuergerät auf 20 Grad Celsius ein. Bringen Sie eine UV-Schutzabschirmung an. Richten Sie die Verzögerungsdauer und die Periode am Stimulator ein.Verbinden Sie einen Draht von der Saugnadelelektrode mit dem Stimulator. Schalten Sie ihn ein. Überprüfen Sie unter einem Objektiv mit niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung die muskul&auml;re Kontraktion, indem Sie den Reiz einschalten.Füllen Sie das Perfusionsystem mit einer Ringer-Lösung mit niedrigem Calcium- und hohem Magnesiumgehalt auf. Stellen Sie eine Perfusionsrate von etwa zwei Millilitern pro Minute ein. Wechseln Sie das Objektiv auf 40-fache Vergrößerung.Schalten Sie den Polychrome V ein. Wählen Sie die Emissionswellenlänge und die Dauerbeleuchtung. Öffnen Sie den Verschluss. Stellen Sie unter Verwendung eines Objektivs mit 40-facher Vergrößerung im Fluoreszenzmodus sicher, dass die Enden beladen sind.Suchen Sie das Endplattenareal und fokussieren Sie es. Die beladene Nervenfaser und die gut beladenen motorischen Nervenendigungen sind in der Abbildung dargestellt. Videokapitur mit einer Red-Short-Neuro-CCD-Kamera.Turbo-SM-Software ausführen. Auswählen, Einstellungen ändern. Eingabe der Anzahl der Einzelbilder beträgt 500.Geben Sie den Namen des Experiments ein. Die grundlegende Konfiguration beträgt 1000 Bilder pro Sekunde. 80 mal 80.Externen Trigger auswählen. Vortriggerzeit eingeben. Minus zehn Millisekunden.Geben Sie die Anzahl der Wiederholungen ein, 20. Wählen Sie im Polychrome-Software den externen Trigger-Beleuchtungsmodus aus. Führen Sie die Clampex-Software aus.Laden Sie das Stimulationsprotokoll. Das Protokoll kann von unserer Laborseite auf der Website der Kasaner Bundesuniversität heruntergeladen werden. Erfassen Sie vor der Aufnahme einen Dunkelrahmen in der Turbo-SM-Software.Wählen Sie am trinokularen Kubus die Umschaltstufen für den Lichtweg: 100 Prozent für die Kamera. Führen Sie das Stimulationsprotokoll aus.Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und überprüfen Sie das Signal. Als Reaktion auf die Nervenstimulation registrieren wir eine Änderung der Fluoreszenzintensität, die den Kalziumeinstrom in das Nervenende widerspiegelt. Datenauswertung.Wählen Sie in der Turbo-SM-Software die Datei aus. Anschließend wählen Sie „Dateien mitteln“ aus. Wählen Sie die Dateien aus.Geben Sie den Namen der Durchschnittsdatei ein und bilden Sie den Mittelwert. Speichern Sie die Durchschnittsdatei als Fit-Datei. Wählen Sie „Speichern unter Fit-Datei“ aus.Geben Sie den Dateinamen ein und speichern Sie ihn. Führen Sie Image J aus, und öffnen Sie die folgenden Instrumente: Analyse, Werkzeuge, ROI-Manager.Gespeicherte Durchschnittsdatei im Fit-Format finden. Ziehen Sie sie in Image J. Das Fenster vergrößern, um eine bessere Ansicht zu erhalten. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse über dem aus, was Sie als Hintergrund betrachten.Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu. Wählen Sie im ROI-Manager „Mehr“ und „Mehrfachmessung“. Laden Sie den Mittelwert herunter.Kopieren Sie die Daten und exportieren Sie sie nach Excel. Verwenden Sie in Excel die Mittelwertfunktion, um den Durchschnittswert des Hintergrunds für ein Verhältnis zu berechnen. Kehren Sie zurück zu Image J, ohne Excel zu schließen. Schließen Sie das Fenster mit der Hintergrundberechnung, ohne zu speichern.Verwenden Sie den ROI-Manager, um die rechteckige Hintergrundzeichnung zu löschen. Öffnen Sie den Instrumentenprozess „Mathematik“ und wählen Sie „Subtrahieren“. Geben Sie den berechneten, gemittelten Schwellenwert aus Excel ein und subtrahieren Sie den Hintergrund von den Stacks.Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse um ein Nervenendig aus. Fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu. Wählen Sie im ROI-Manager „Mehr“, „Mehrfachmessung“, „Herunterladen“, „Mittelwert“.Kopieren und in das Excel-Fenster einfügen. Verwenden Sie das Diagrammwerkzeug von Excel. Wählen Sie einen flachen Bereich vor Beginn des Signals aus.Laden Sie den Graphen mit den Details aus den ersten Fluoreszenzwerten in Ruhe bis zum Beginn des Signals. Bestimmen Sie dann die Anzahl der Punkte, über die die Ruhefluoreszenzwerte gemittelt werden sollen. Mitteln Sie diese Werte und ermitteln Sie anschließend den durchschnittlichen Fluoreszenzwert in Ruhe.Teilen Sie die Signale durch die Fluoreszenz im Ruhezustand. Subtrahieren Sie eins und multiplizieren Sie mit 100 Prozent. Tragen Sie das Signal auf und berechnen Sie die Amplitude des Kalziumtransienten.Die Zeitparameter von Fluoreszenzsignalen hängen von der Geschwindigkeit der Hin- und/oder Rückreaktionen der Calcium-Farbstoff-Komplexbildung ab. Die Anstiegszeit des Calciumsignals stellt die Dynamik des Calciumeinstroms dar, seine Diffusion im Terminal sowie die Wechselwirkung von Calcium mit dem Farbstoff.Der Abfall der Kalziumtransienten hängt von der Farbstoffaffinität, der Geschwindigkeit der Kalziumpufferung und des Kalziumabtransports ab. Die Analyse der Amplitude der Kalziumtransienten kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Wirkstoffe auf den Kalziumeinstrom zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt ist. Diese Beladungstechnik eignet sich gut zur Abbildung von Veränderungen des zytosomalen Kalziums.Mit fluoreszierenden Indikatoren sowie der Einzel- und rhythmischen synaptischen Aktivität durch Nervenstimulation. Die Analyse der Amplitude von Kalziumtransienten kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Kalziumeinstrom zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt ist. Es gibt einige wichtige Aspekte, auf die wir achten möchten.Das Inkubationsverfahren umfasst zwei Schritte: die Inkubation bei Raumtemperatur und im Kühlschrank. Es ist wichtig, die Inkubationszeit mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur genau zu kontrollieren.Je nach Länge des Nervenstumpfs, der verwendeten Farbstofflösung und der Raumtemperatur kann die Inkubationszeit variieren. Bei zu langer Belichtung können die präoperativen Endigungen und die dem Nervenstumpf benachbarten proximalen Abschnitte überladen werden. Aufgrund der langen Inkubation im Kühlschrank wird der Farbstoff gleichmäßig entlang der Nervenenden verteilt.Es ist entscheidend, den Nerv innerhalb weniger Minuten nach dem Durchtrennen in die Farbstoff-Lösung zu geben, damit der Farbstoff in den Nerv eindringen kann, da längere Zeitintervalle zu einer ineffektiven Beladung führen, vermutlich aufgrund eines geschlossenen Nervs. Um eine Kompartimentierung des Farbstoffs zu vermindern, kann die verlängerte Form des Farbstoffs verwendet werden. Es ist sehr wichtig, eine längere fluoreszierende Beleuchtung des Gewebes zu vermeiden, da diese dessen Überlebensfähigkeit beeinträchtigt.Wir verwenden Nomarski-Optik im sichtbaren Lichtkanal, um die Endigungen zu suchen. Während der Aufzeichnung begrenzen wir das beleuchtete Sichtfeld mittels der Blende. Die lange Dauer des Beladeprozesses kann durch Verwendung eines Verschlussimpulses des Nervs verringert werden.In diesem Fall kann ein Glas-Mikro-Bypass verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Calcium ist ein allgegenwärtiges Botenstoff im Nervensystem, wichtig für die Auslösung die Freisetzung von Neurotransmittern und Veränderungen der synaptischen Stärke. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Ca 2 +-Indikatoren in Drosophila Nervenendigungen. Wir zeigen auch die Herstellung der erforderlichen Geräte und betonen Punkte von entscheidender Bedeutung für die Technik für den Erfolg.

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Hier präsentieren wir die Methodik für schnelle und hochauflösende Fluoreszenz-Spannungs-sensitiven Farbstoff Bildgebung von detaillierten Aktivität von Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.

Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Quelle: Heredia, D. J., et. al. ex vivo Bildgebung des zellspezifischen Calcium-Signalwegs an der dreigliedrigen Synapse des Maus-Zwerchfells. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Calciumdynamik an neuromuskulären Junktionen (NMJs) in einer transgenen Maus, die genetisch kodierte Calciumindikatoren exprimiert. Eine NJM wird durch fluoreszenzmarkierte Acetylcholinrezeptoren im Zwerchfell mit dem Nervus phrenicus identifiziert. Ein Bildsplitter wird verwendet, um...

Fluoreszenzbildgebung der Kalziumdynamik an neuromuskulären Verbindungen im Zwerchfell einer transgenen Maus

Quelle: Zhilyakov, N. V. et. al., Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert die bildgebende Technik zur Aufzeichnung schneller Kalziumtransienten an Nervenenden mittels konfokaler Mikroskopie. Durch die Stimulation des Nervs und das Erfassen von Fluoreszenzänderungen von kalziumbindenden Farbstoffen visualisiert es den dynamischen Kalziumeinstrom und die Clearance am...

Bildgebung von schnellen Kalziumtransienten in Nervenenden von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung und Analyse von Temperaturreaktionen im Riechkolben von Xenopus laevis. Geruchsrezeptor-Neuronen und Mitralzellen werden differentiell gefärbt, woraufhin Kalziumveränderungen aufgezeichnet werden, was eine Empfindlichkeit einiger neuronaler Netzwerke im Kolben gegenüber Temperaturabfällen widerspiegelt, die an der Nase induziert werden.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Das Protokoll beschreibt die Methode, einen fluoreszierenden Kalziumfarbstoff durch den geschnittenen Nerv in die motorischen Nervenenden der Maus zu laden. Darüber hinaus wird eine einzigartige Methode zur Erfassung schneller Kalziumtransienten in den peripheren Nervenenden mittels konfokaler Mikroskopie vorgestellt.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Lernen Sie die Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs in Froschnervenendungen über einen Nervenstumpf. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung schneller Kalziumtransienten an neuromuskulären Endplatten.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction (Video) | JoVE Journal

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

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