Name: Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Verabreichung therapeutischer MSC-Sphäroide unter xeno-freien Bedingungen. Diese Methode verbessert Zellretention und Funktionalität für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse P40RR17447 des National Institute of Health und RP150637 des Cancer Prevention and Research Institute of Texas finanziert. Wir danken Dr. Darwin J. Prockop für seine Unterstützung bei diesem Projekt.

<ol><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+New+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).</li>
<li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li>
<li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Paracrine+Immunomodulatory+Potential+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+in+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 9176357(2016).</li>
<li>Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Potapova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+support+migration%2C+extracellular+matrix+invasion%2C+proliferation%2C+and+survival+of+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C.Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+Improve+Myocardial+Infarction+in+Mice+because+Cells+Embolized+in+Lung+Are+Activated+to+Secrete+the+Anti-inflammatory+Protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+%28PGE2%2C+TSG6%2C+and+STC1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
<li>Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html"> http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> (2016).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mesenchymal+Stromal+Cells%27+Paracrine+Immunomodulatory+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.Med.Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects.</a> Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li>
<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+%27licensing%27%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li>
<li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+round%3A+multipotent+stromal+cells%2C+a+three-dimensional+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die optimale MSC für die Verwendung in einigen Forschung und klinische Anwendungen sollten hoch aktivierten ihren Nutzen zu maximieren, und vorzugsweise unter chemisch definierten XF Bedingungen hergestellt, die Lieferung von potentiellen Antigenen aus xenogenen Mediumkomponenten wie FBS zu minimieren. In den Protokollen hier beschrieben, haben wir Methoden 1 gezeigt) aktivieren MSCs in 3D Kultur durch Bildung von Sphäroiden, 2) erreichen, um die 3D-Aktivierung von MSCs unter Bedingungen XF, 3) Auswertung der Aktivierun...

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) sind für verschiedene regenerative Medizin Ansätze großes Potenzial gezeigt. MSCs wurden zunächst als stromal Komponente von Knochenmark isoliert wurden , da aber von zahlreichen anderen adulten Geweben erhalten worden sind , einschließlich Fettgewebe 1, 2, 3. Interessanterweise umfasst der Hauptisolationsverfahren die bemerkenswerte Eigenschaft von MSCs fest auf Gewebekulturkunststoff in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) zu haften. Während dieses traditionelle Isolationstechnik eine einfache und schnelle Expansion von MSCs ermöglicht in zweidimensionalen (2D) Kultur, ist es auch sehr künstlich und mißachtet Bedeutung der nativen dreidimensionalen (3D) Umgebung zu möglichen Verlust von wichtigen zellulären Eigenschaften führende 4, 5 , 6. Daher ist die Untersuchung von MSCs in 3D-Kulturen, diesind physiologische als herkömmliche 2D-Kulturen, hat für &quot;verloren / verminderte&quot; MSC Merkmale auf der Suche entstanden. Xeno-frei (XF) chemisch definierte Bedingungen für die MSC Kultur und Aktivierung, zu identifizieren und somit machen die Zellen besser geeignet für klinische Anwendungen Zudem hat großes Interesse gestiegen. Viele Studien sind veröffentlicht worden, die 3D-Kultur von MSCs zeigen sowohl in Biomaterialien und als sphärische Aggregate oder Sphäroide. MSCs in Biomaterialien wurden zunächst für das Tissue Engineering Ansätze entwickelt , beschädigte Gewebe mit Zell ausgesät Gerüste zu ersetzen, während Sphäroid - Kulturen von MSCs als eine Möglichkeit gesehen wurden MSC Verhalten in vivo nach der Verabreichung der Zellen für Therapien in präklinischen oder klinischen Studien zu verstehen , 4, 5, 7. Interessanterweise spontan Sphäroiden MSCs bilden sich, wenn die Einhaltung der Gewebekultur-Plastik ist nicht zulässig8, 9, 10. Traditionell wurde die Zellaggregation durch Rührflasche Methoden oder flüssigen Overlay-Techniken erleichtert, Methoden zunächst in der Krebsbiologie bei den Bemühungen um zu versuchen, den Tumor-Mikroumgebung zu imitieren. In jüngerer Zeit wurden weitere Methoden taucht , die Zellaggregation in Kulturschalen vorbeschichtet mit spezifischen Chemikalien zeigen zu verhindern Zelle zu Kunststoffhaft 4, 5, 6. Eine der einfachsten und wirtschaftlichsten Verfahren MSC Sphäroide zu erzeugen, ist zur Kultur sie in hängenden Tropfen, eine Technik, die häufig verwendet wurde embryoid bodies aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen. Mit hängenden Tropfen Kulturtechnik, die Zellhaftung an den Gewebekulturkunststoff wird durch Suspendieren der Zellen in einem Tropfen des Mediums auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel verhindert und damit die Schwerkraft zu erleichtern Zelle AGGREGation in der Spitze des Tropfens. Das Sphäroid Größe kann leicht durch Ändern der Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen manipuliert werden, Tropfen Kulturen machen hanging besonders einfach zu steuern. Frühe Untersuchungen über die 3D - Kultur von MSCs gezeigt radikalen Unterschiede in den Eigenschaften der Zellen in 3D im Vergleich zu ihren Pendants 2D 6, 8, 9. Zur gleichen Zeit zeigten Berichte , dass die vorteilhaften Wirkungen von MSCs in vivo auf ihre Fähigkeit , durch Mikroumweltreize aktiviert zu werden , verlassen und in Reaktion darauf zu erzeugen , entzündungshemmende und immunmodulierende 11 Faktoren. Interessanterweise viele dieser Faktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurde in viel größeren Mengen von MSC Sphäroide als herkömmliche 2D MSCs ebnet den Weg für das produzierte Idee vonVerwendung von 3D - Kulturen , die Zellen 8, 12, 13 zu aktivieren. Außerdem Genaktivierung in 3D Kulturen erschienen Mechanismen zu rekapitulieren, zumindest teilweise der Zellaktivierung nach Injektion in 12 Mäusen. Durch die in den Experimenten MSCs vor ihrer Verwendung zu aktivieren, Auswirkungen der Zellen verlängert werden könnte , und mehr im Vordergrund als die traditionelle MSC Wirkung in vivo oft verzögert und vorübergehend, und kann als &quot;Hit and Run&quot; beschrieben werden. In den letzten Jahren wichtige funktionelle Studien MSC Sphäroide verwenden , haben gezeigt , dass sie Entzündungsreaktionen zu unterdrücken und zu modulieren Immunität in vivo durch Effektorzellen , wie beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen zu beeinflussen, Neutrophile und T - Zellen Sphäroide eine attraktive Form grundierte MSCs 2 Herstellung , 3. Zusätzlich Herstellung von Anti-Krebs-Moleküle, wie interleukin-24 (IL-24) und Tumor - Nekrose - Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL), werden in 3D - Kulturen von MSCs relativ erhöht MSCs zu Monoschicht ein Phänomen , das für die gezielte Krebstherapien 8, 10, 14 ausgenutzt werden könnte. Da die traditionelle MSC Kultur nicht nur die Verwendung von Gewebekulturkunststoff erforderlich, sondern auch FBS, auf eine weitere Hürde zugänglich MSC Sphäroiden mehr machen für die klinische Anwendung zu überwinden hatte. Um diese Hürde bewältigen, wir die Bildung von Sphäroiden MSC unter bestimmten Bedingungen chemisch definierten XF kürzlich gezeigt und festgestellt , dass die resultierenden MSC Sphäroide wurden die gleichen entzündungshemmenden und anti-Krebs - Moleküle , wie die Sphäroide in Bedingungen mit 14 FBS erzeugt herzustellen aktiviert. Hier werden diese Erkenntnisse in mehreren ausführlichen Protokolle vorgestellt, die die Erzeugung von voraktivierten MSCs in 3D-Kulturen unter Verwendung von XF zeigenMedien. Außerdem werden Protokolle vorgestellt, die effektivsten Möglichkeiten, beschreiben die Aktivierungsstufen der MSCs in Bezug auf ihre entzündungshemmende, immunmodulierende und Anti-Krebs-Wirkung, zusammen mit einem praktischen Verfahren zur Beurteilung der intakten Sphäroiden in Mäuse zu liefern.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha; (minimal essentiell medium alpha)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>minimal essentielles Medium zur Herstellung von MSC-Wachstumsmedium (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (fetales Rinderserum), Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; Nr. S11510; Nr. S11550; S11595-24</td><td>Komponente eines kompletten Nährmediums für alle Zelltypen</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>Komponente eines kompletten Nährmediums für alle Zelltypen</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>Komponente eines kompletten Nährmediums für alle Arten von</td></tr><tr><td>Zellen Sterilisationsfiltereinheiten, 0,22 & Mikro; m PES-Membran</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>Sterilisation</td></tr><tr><td>für Medien 150 mm Zellkulturschale</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; SIGMA</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Thermo Forma wasserummantelter CO2 befeuchteter Inkubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modell 3110</td><td>Inkubation von kultivierten Zellen</td></tr> Early <tr><td>Passage MCSs</td><td>Zentrum für die Aufbereitung und Verteilung adulter Stammzellen am Texas A& M Health Science Center College of Medicine Institut für Regenerative Medizin bei Scott & Weiße</td><td>NA</td><td>Aufbereitung von 2D- und 3D-Kulturen von MSCs</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>Erwärmungsmedium auf 37 > C</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>manuelle Handhabung von Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>Handhabung von serologischen Pipetten</td></tr><tr><td>Costar sterile serologische Pipette (5, 10, 25 und 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>Handhabung von</td></tr><tr><td>Flüssigkeiten PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), pH 7,4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>Verarbeitung von Zellkulturen</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA-Lösung</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>Heben adhärenter Zellen und Dispergieren von Zellaggregaten</td></tr><tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>Zellzentrifugation</td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>Zellzentrifugation</td></tr><tr><td>Eppendor gekühlte Zentrifuge</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Modell 5810R</td><td>Zellzentrifugations-Hämozytometer</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>Ausschluss toter Zellen während der Zellzählung im Hämazytometer</td></tr><tr><td>Definiertes xenofreies MSC Medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Xenofreie Medien, die speziell für das Wachstum und die Expansion menschlicher mesenchymaler Stammzellen entwickelt wurden</td></tr><tr><td>Definiertes xenofreies MSC-Medium-2 (XFM-2)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>Definiertes, xenofreies Medium für humane mesenchymale Stammzellen</td></tr><tr><td>HSA (Humanes Serumalbumin)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Bestandteil des xenofreien MSC-Mediums</td></tr><tr><td>rHSA (rekombinantes humanes Serumalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; SIGMA</td><td>Bestandteil eines xenofreien MSC-Mediums</td></tr><tr><td>Vollständige RNA-Isolierung Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Gesamte RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Probenhomogenisierung vor der Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>RNAse-freies DNase-Set&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNA-Eliminierung in der Säule während der Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp; ALDRICH</td><td>Hemmung von RNAs in RLT-Puffer</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>Mischprobe</td></tr><tr><td>Spektrophotometer</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA-Konzentration und -Qualität</td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Transkription von Gesamt-RNA in cDNA-Genexpressionsassays</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>variiert die</td><td>Primer/Sonden-Kombination für die Echtzeit-PCR</td></tr><tr><td>Schneller Universal-PCR-Mastermix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>Mastermix für die Echtzeit-PCR-Reaktion</td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-System (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>Echtzeit-PCR</td></tr><tr><td>1,5 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Zellzentrifugation, Probenentnahme und -lagerung</td></tr> <tr><td>(-80 &Grad; C) Gefrierschrank</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modell Thermo Forma 8695</td><td>Probenlagerung</td></tr><tr><td>PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit</td><td>R& D Systems</td><td>KGE004B</td><td>Schätzung der Zytokinkonzentration in der Probe</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s modifizierter Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032</td><td>Makrophagen-Kulturmedien</td></tr><tr><td>J774 Maus-Makrophagen</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Maus-Makrophagen-Zelllinie</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro Makrophagenstimulation</td></tr><tr><td>LPS (Lipopolysaccharid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro Makrophagenstimulation</td></tr><tr><td>Maus TNF-a ELISA-Kit</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>Schätzung der Zytokinkonzentration in der</td></tr><tr><td>Probe Maus IL-10 (Interleukin 10) ELISA Kit</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>Schätzung der Zytokinkonzentration in der Probe</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>Splenozyten-Kulturmedien</td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>in vivo Sphäroidabgabe; Splenozytenpräparat</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3e Functional Grade Purified</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro Splenozytenstimulation</td></tr><tr><td>70 &mu; m Sieb&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Splenozytenpräparat</td></tr><tr><td>Lyselösung für rote Blutkörperchen (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>Entfernung von roten Blutkörperchen während der Splenozytenisolierung</td></tr><tr><td>Maus IFN-&#947; (Interferon-Gamma) ELISA-Kit</td><td>R& D Systems</td><td>MIF 00</td><td>Schätzung der Zytokinkonzentration in der Probe</td></tr><tr><td>von LNCaP-Prostatakrebszellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>Studie zur Wirkung von 3D-MSCs auf Krebszelllinien in vitro</td></tr><tr><td>basierte Zellproliferations-Assay-Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>Zellzahlmessung basierend auf dem DNA-Gehalt</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Bestandteil des Lysereagenzes</td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>Calciumchelator, Bestandteil des Lysereagenzes</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>RNA-Abbau zur Messung von</td></tr><tr><td>DNA-Filter-basierten Multimode-Mikroplatten-Readern</td><td>BMG Technology</td><td>NA</td><td>Mikrotiterplatten-Assays (ELISA, Zellquantifizierung, etc.)</td></tr><tr><td>HBSS (Hanks balanced salt solution), kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>Resupsension von MSC-Sphäroiden vor in vivoInjektionen</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>MWI Vet Supply 502017</td><td></td><td>Anästhesie für in vivo Injektionen</td></tr><tr><td>Sauerstoff, Druckgas</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>Zur Verwendung mit Isofluran</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2 Schrank</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modell 1385</td><td>Sterile Zellkultur</td></tr><tr><td>Sicherheit I.V. Kathetter/Nadel Stiletto, 20 G , 1 Zoll</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>Verabreichung von Shperoiden in die Bauchhöhle</td></tr><tr><td>Sterile Mikropipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>variiert</td><td>die Handhabung von Flüssigkeiten/Zellen</td></tr></tbody></table>

herstellung und verabreichung von therapeutischen mesenchymalen stamm- / stroma-zellen (msc) sphäroiden primed in 3-d-kulturen unter xeno freien bedingungen

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) vielversprechend in der Biotechnik und der regenerativen Medizin. MSCs können aus mehreren adulten Geweben durch ihre starke Adhärenz an Gewebekulturkunststoff und dann expandiert weiter in vitro isoliert werden, am häufigsten fötalem Rinderserum (FBS) verwendet wird . Da FBS können MSCs verursachen immunogen zu werden, begrenzt seine Präsenz in MSC-Kulturen sowohl klinische und experimentelle Anwendungen der Zellen. Daher unter Verwendung von Studien chemisch definierte Xeno-freie (XF) Medien für die MSC-Kulturen sind äußerst wertvoll. Viele vorteilhafte Wirkungen von MSCs wurden auf ihre Fähigkeit zurückzuführen Entzündung und Immunität zu regeln, vor allem durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Prostaglandin E2 (PGE2). Jedoch erfordern MSCs Aktivierung dieser Faktoren zu erzeugen, und da die Wirkung von MSCs oft vergänglich ist, hat großes Interesse hervor Wege der Pre-Aktivierung der Zellen Prio zu entdeckenr ihre Verwendung, wodurch die Beseitigung der Verzögerungszeit für die Aktivierung in vivo. Hier präsentieren wir Protokolle effizient aktivieren oder prime MSCs in dreidimensionalen (3D) Kulturen unter chemisch XF Bedingungen definiert und diese voraktivierten MSCs in vivo zu verabreichen. Insbesondere wir zuerst beschreiben Verfahren zur sphärischen MSC Mikrogeweben oder &quot;Sphäroide&quot; in hängenden Tropfen unter Verwendung XF Medium erzeugen und zu zeigen, wie die Kugeln und konditioniertes Medium (CM) können für verschiedene Anwendungen geerntet werden. Zweitens beschreiben wir die Genexpression Bildschirme und in vitro funktionelle Assays , um schnell das Niveau der MSC Aktivierung in Sphäroide bewerten, die entzündungshemmende und Anti-Krebs - Potential der Zellen zu betonen. Drittens beschreiben wir ein neues Verfahren intakte MSC Sphäroide in die Maus - Peritonealhöhle für in vivo Wirksamkeitstests zu injizieren. Insgesamt überwinden die Protokolle hier großen Herausforderungen unter chemisch definierten XF con voraktivierten MSCs zu erhaltenBedingungen und bieten ein flexibles System MSC Sphäroiden für Therapien zu verabreichen.

In der aktuellen Arbeit wurden hängenden Tropfen Kulturen unter XF Bedingungen kompakten sphärischen Mikrogeweben oder &quot;Sphäroiden&quot; von aktivierten MSCs zu erzeugen. Die Prüfpräparate Roadmap in 1 veranschaulicht , dass MSCs zur Selbstorganisation gefördert werden in Sphäroide wenn in hängenden Tropfen für 72 Stunden ausgesetzt, wonach die Sphäroide oder das CM mit Kugel abgeleiteten therapeutischen Faktoren geladen wird , kann sowohl gesammelt und möglicherwei...

Das therapeutische Potenzial von mesenchymalen Stamm-/Stromazellen (MSCs) ist gut dokumentiert, jedoch bleibt die beste Methode, die Zellen für Patienten vorzubereiten, umstritten. Darin kommunizieren wir Protokolle zur effizienten Erzeugung und Verabreichung von therapeutischen sphärischen Aggregaten oder "Sphäroiden" von MSCs, die unter xenofreien Bedingungen für experimentelle und klinische Anwendungen geprimt wurden.

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente besteht darin, therapeutische, kugelförmige Aggregate oder Sphäroide von mesenchymalen Stamm- und Stromazellen, auch MSCs genannt, die unter xenofreien Bedingungen präpariert wurden, effizient herzustellen und in experimentellen sowie klinischen Anwendungen zu injizieren. Diese Methoden können dazu beitragen, wesentliche Hindernisse im Bereich der MSC-Therapeutika zu überwinden, wie beispielsweise eine geringe Zellretention, mangelndes Überleben und eingeschränkte Funktionalität, die häufig nach der Transplantation von dispergierten Zellen sowie unter ungünstigen Bedingungen, die typischerweise mit Gewebeschäden einhergehen, beobachtet werden.Der Hauptvorteil dieser Verfahren besteht darin, dass die MSC-Sphäroide hergestellt, präpariert und injiziert werden können, ohne immunogene tierische Produkte wie FBS einzusetzen, was derzeit einige klinische Anwendungen der Zellen einschränkt und außerdem die Interpretation einiger präklinischer Daten verfälschen kann. Obwohl dieser Mechanismus potenziell sehr vorteilhaft für die Vermittlung der Wirksamkeit auf der Basis von MSCs ist, kann er auch genutzt werden, um die von MSCs vermittelte Geweberep

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) mit autologem Serum, reduziert das Risiko der Abstoßung durch xenogene Material und andere negative Auswirkungen. Es ermöglicht auch die Rückgewinnung von einer Untergruppe von mesodermalen Vorläufern, die frische hMSCs liefern kann. hMSCs in einem Eigen Fibringerinnsels Einbetten ermöglicht eine einfache Handhabung und effektive chirurgische Implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Hier präsentieren wir Protokolle zur Kultivierung von Humanparodontalband (PDL) Zellsphäriden durch Chitosan-Filme. Die Kultur der dreidimensionalen (3D) zellulären Sphäroide bietet eine Alternative zum herkömmlichen Gewebekulturpolystyrol (TCPS) Kultursystem.

Bildung von Human Periodontal ligament Cell Spheroids auf Chitosan Filmen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem adhärente Zellen aus mehrschichtigen Kolben in einer geschlossenen, halbautomatischen Weise unter Verwendung eines Gegenstromzentrifugationssystems gewonnen werden können. Dieses Protokoll kann sowohl für die Ernte von adhärenten als auch von Suspensionszellen von anderen Zellexpansionsplattformen mit wenigen Änderungen an den bestehenden Schritten angewendet werden.

Humane mesenchymale Stammzellprozessierung für klinische Anwendungen in einem geschlossenen, halbautomatischen Workflow

Xenogene (chemische oder tierische) Produkte, die in den Vorbereitungs-/Manipulationsschritten der Zelltherapie eingeführt werden, sind mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und pathogene Übertragung bei Wirtspatienten verbunden. Hier wird eine vollständige xenogenfreie Methode zur Isolierung und in vitro Expansion von humanen adipösen Stammzellen beschrieben.

Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie

Ein Protokoll wird für die Produktion von ankerabhängigen Zellen durch Mikroträger-Mikrobioreaktoren als potenzielle zellbasierte Therapien beschrieben. Bei der Zielsetzung eines Anwendungsfalls des akuten Atemnotsyndroms werden vergleichbare Zellausbeute und günstige Genexpression im Vergleich zu kolbenbasierten Prozessbedingungen illustriert. Dieses Protokoll lässt sich auf andere ankerabhängige Zellen und Zielindikationen erweitern.

Mikrobioreaktor-basierte Produktion von ankerabhängigen mesenchymalen Stromzellen, die auf das akute Atemnotsyndrom vorbereitet sind

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

Erfahren Sie die Herstellung und Verabreichung therapeutischer MSC-Sphäroide unter xeno-freien Bedingungen. Diese Methode verbessert Zellretention und Funktionalität für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

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