Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente besteht darin, therapeutische, kugelförmige Aggregate oder Sphäroide von mesenchymalen Stamm- und Stromazellen, auch MSCs genannt, die unter xenofreien Bedingungen präpariert wurden, effizient herzustellen und in experimentellen sowie klinischen Anwendungen zu injizieren. Diese Methoden können dazu beitragen, wesentliche Hindernisse im Bereich der MSC-Therapeutika zu überwinden, wie beispielsweise eine geringe Zellretention, mangelndes Überleben und eingeschränkte Funktionalität, die häufig nach der Transplantation von dispergierten Zellen sowie unter ungünstigen Bedingungen, die typischerweise mit Gewebeschäden einhergehen, beobachtet werden.

Der Hauptvorteil dieser Verfahren besteht darin, dass die MSC-Sphäroide hergestellt, präpariert und injiziert werden können, ohne immunogene tierische Produkte wie FBS einzusetzen, was derzeit einige klinische Anwendungen der Zellen einschränkt und außerdem die Interpretation einiger präklinischer Daten verfälschen kann. Obwohl dieser Mechanismus potenziell sehr vorteilhaft für die Vermittlung der Wirksamkeit auf der Basis von MSCs ist, kann er auch genutzt werden, um die von MSCs vermittelte Gewebereparatur zu untersuchen sowie zu verstehen, wie andere Mediumformulierungen den therapeutischen Genex Plus beeinflussen können. Diese Verfahren werden Josh Beaver und Bret Clough, zwei Techniker aus meinem Labor, demonstrieren.

Nach dem Aussäen und Inkubieren von mesenchymalen Stammzellen gemäß dem Textprotokoll, die Zellen mit Trypsin und EDTA ablösen und nach der Zentrifugation der gewonnenen Zellen bei 450 × g alle Zellen in einem einzigen kegelförmigen Reagenzglas mit dem geeigneten Medium vereinigen. Die Zellen zentrifugieren und das Zellpellet in einem kleinen Volumen Medium resuspendieren. Anschließend, nach der Zellzählung, die gewonnenen MSCs in einem der folgenden Medien auf 714 Zellen pro Mikroliter verdünnen, um Sphäroide mit etwa 25.000 Zellen zu erzeugen.

Als Nächstes pipettieren Sie 35-Mikroliter-Tropfen der Zellen auf die Unterseite des Deckels einer 150-Millimeter-Invertkulturschale. Überführen Sie 20 Milliliter PBS bei Raumtemperatur in den Boden der Schale und drehen Sie den Deckel mit den Tropfen in einer kontinuierlichen, gleichmäßigen Bewegung um, sodass die Tropfspitzen nach unten zeigen. Stellen Sie den Deckel dann vorsichtig auf den Boden der Kulturschale.

Überführen Sie die Schale für drei Tage in den Inkubator, ohne sie zu stören, um eine angemessene Sphärenbildung zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig den Deckel, drehen Sie ihn um, sodass die Tropfen erneut nach oben zeigen, und kippen Sie den Deckel dann um etwa 10 bis 20 Grad. Verwenden Sie anschließend einen Zellabheber, um die Tropfen, die die Sphäroide enthalten, zum Rand der Platte zu schieben.

Überführen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette das Endmedium der Sphäre in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und waschen Sie die Platte mit Raumtemperatur-PBS und derselben Pipettenspitze, um eine maximale Rückgewinnung der Sphäroide sicherzustellen. Für Echtzeit-PCR-Assays zentrifugieren Sie die Sphäroid-Suspension bei 450 × g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Anschließend aspirieren Sie den Überstand.

Spülen Sie die Sphäroide mit PBS und wiederholen Sie sowohl die Zentrifugations- als auch die Aspirationsschritte. Für die Verabreichung an Tiere lassen Sie die Sphären ohne Zentrifugation auf den Boden des Röhrchens sedimentieren. Um das konditionierte Medium oder CM für Assays zur Untersuchung der immunmodulatorischen und anti-karzinogenen Wirkung zu gewinnen, sammeln Sie die Sphäroide und das CM-Medium mithilfe eines Zellabhebers und einer Pipette, wie gerade gezeigt, in einem 15-Milliliter-Konischgefäß ein.

Spülen Sie die Deckel jedoch nicht mit PBS. Nach der Zentrifugation bei 450 × g für 5 bis 10 Minuten überführen Sie das Überstand in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 × g und Raumtemperatur für 5 bis 10 Minuten.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um das geklärte CM vorsichtig in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius zu sammeln. Nachdem die Sphäroide wie in diesem Video gezeigt hergestellt wurden, warten Sie drei bis vier Minuten, bis sie sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Sphäroide, indem Sie HBSS ergänzt mit 0,2 bis 0,5 % HSA hinzufügen, um xenofreie Bedingungen aufrechtzuerhalten. Danach saugen Sie den Überstand erneut ab.

Überlagern Sie die Sphäroide mit 100 bis 200 Mikrolitern sterilem HBSS/HSA und stellen Sie die Röhrchen auf Eis. Nach der Anästhesie eines Mäuses gemäß dem Textprotokoll wird das Tier in den BSL-2-Schrank gelegt, wobei die dorsale Seite nach unten zeigt, und der untere Bauchbereich der Maus mit 70 %igem Ethanol desinfiziert. Entfernen Sie die Kappe eines 20-Gauge-Intravenöskatheters und lokalisieren Sie, während Sie die Mäusehaut mit einer Hand festhalten, die Mitte einer gedachten Linie, die das gebeugte Kniegelenk und den Genitalbereich verbindet. Mit der Nadelspitze der Katheter-Kanülen-Anordnung in Richtung der Körpermitte führen Sie mit der anderen Hand eine intraperitoneale Injektion durch.

Entfernen Sie vorsichtig die Metallnadel aus der Katheter-Nadel-Vorrichtung. Überprüfen Sie die Nadel auf Blut, Urin und Fäkalien und entsorgen Sie sie. Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Kunststoffkatheters, indem Sie eine Pipettenspitze mit 100 bis 200 Mikrolitern, gefüllt mit 100 Mikrolitern sterilem HBSS/HSA, in den Katheter-Spritzenadapter einführen, wodurch ein dichter Verschluss entsteht.

Danach langsam die Flüssigkeit in die Bauchhöhle injizieren. Mit einer Pipettenspitze von 100 bis 200 Mikroliter das MSA-Sphäroide und HBSS/HSA aufnehmen und das gesamte Volumen wie gerade gezeigt über den Katheter in die Bauchhöhle überführen. Anschließend das Gefäß, das die Sphären enthält, mit 100 Mikrolitern HBSS/HSA spülen und das gesamte Volumen der Sphären in die Bauchhöhle übertragen.

Legen Sie einen mit Desinfektionsmittel getränkten Mullverband über den Katheter und entfernen Sie den Katheter langsam aus der Bauchhöhle, anschließend entsorgen Sie ihn. Überprüfen Sie den Katheter auf verbliebene Sphäroide. Massieren Sie dann vorsichtig die Bauchhöhle mit den Fingern, um eine gleichmäßige Verteilung der Sphäroide sicherzustellen.

Unmittelbar nach der Applikation der Sphäroide in die Mäuse die Aktivierungsstufe der für Injektionen vorbereiteten Sphäroide überprüfen, indem 40 bis 120 Sphären in einen Katheter in eine 12- oder 6-Well-Platte überführt werden, die ein bis zwei Milliliter Alpha-MEM ergänzt mit 2 % FBS und 1× Penicillin-Streptomycin enthält. Sechs Stunden später das Medium aus den Vertiefungen in 1,5- oder 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Röhrchen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 450 × g zentrifugieren. Abschließend das geklärte CM in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und mithilfe eines kommerziellen ELISA-Sets gemäß dem schriftlichen Protokoll zur Bestimmung der PGE-2-Konzentration verwenden.

Wie hier zu sehen ist, aggregieren sich etwa 25.000 MSCs zunächst zu kleinen Zellhaufen, wenn sie in 35-Mikroliter-Tropfen aus CCM suspendiert werden, verschmelzen jedoch schließlich zu einer einzigen kompakten Sphäre an der Tropfenspitze nach 72 Stunden. Diese Abbildung zeigt, dass die Bildung einzelner kompakter Sphären und XFM-1 eine Supplementierung mit 13 Milligramm pro Milliliter HSA erfordert, eine Konzentration, die dem geschätzten Gesamtgehalt an Proteinen in CCM entspricht. Während der Sphärenbildung verändert sich das MSC-Phänotyp radikal, und in einem geeigneten, chemisch definierten, xeno-freien Medium wird die Expression zahlreicher antiinflammatorischer Faktoren, einschließlich PGE2 und TSG6, hochreguliert.

Jedoch wird die Produktion von TSG6 und PGE2 in MSCs, die als Sphären in XFM-2 oder XFM-1 ohne HSA kultiviert werden, nicht signifikant gesteigert. Schließlich führten, ähnlich den in-vitro-Effekten, in die Bauchhöhle von Mäusen injizierte XFM-1-HSA-Sphären, unmittelbar nach der Induktion einer systemischen Entzündung durch die intravenöse Gabe von LPS, zu erhöhten PGE2- und IL-10-Spiegeln im Peritoneum, während proinflammatorisches TNF alpha abnahm. Nachdem die Technik beherrscht ist, kann jede Platte mit hängenden Tropfen in ein bis zwei Minuten vorbereitet werden.

Die intraperitoneale Applikation intakter Sphäroide kann bei korrekter Durchführung innerhalb von 5 bis 10 Minuten pro Tier abgeschlossen werden. Bei der Herstellung von MSC-Sphäroiden mittels Hanging-Drop-Technik ist zu beachten, dass verschiedene xeno-freie Mediumformulierungen bezüglich der Sphärenbildung und der Steigerung der Expression therapeutischer Gene nicht gleichwertig sind. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie eingesetzt werden, um die Organisation der MSCs in den Sphäroiden zu untersuchen sowie mögliche zusätzliche Signalwege zu identifizieren, die in MSCs in verschiedenen Bereichen des Sphäroids aktiviert sind.

Nach dieser Entwicklung ermöglichte diese Methode den MSC-Wissenschaftlern, andere 3D-Kulturbedingungen zu untersuchen und deren Einfluss auf die Priming von MSCs und die Expression therapeutischer Gene zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MSCs als Sphäroide mittels der Hängetropfentechnik präimt, wie man ihre therapeutische Wirksamkeit in vitro bewertet und wie man intakte Sphäroide effektiv in Mäuse zur in-vivo-Wirksamkeitsprüfung einbringt. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit adulten menschlichen Stammzellen spezielle Ausrüstung und Schulung erfordert und gefährlich sein kann, wenn die Zellen nicht ordnungsgemäß behandelt werden.

Bei der Handhabung von adulten menschlichen Stammzellen muss stets geeignete PSA getragen werden.