Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Autophosphorylierung von gereinigten bakteriellen Histidinkinasen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zweikomponenten-Signalübertragung zu beantworten. Wie zum Beispiel die Wirkung von verwandten Stimuli bei Protein-Protein-Wechselwirkungen auf die Autophosphorylierung von Histidinkinasen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass es sich um eine Hochdurchsatzmethode handelt, die zum genauen Nachweis von Picomolen des gebildeten Phosphohistadins und zur Ermittlung kinetischer Parameter für Histidinkinasen verwendet werden kann. Als Postdoktorand verwende ich die Filtration von Nitrozellulosemembranen, um proteingebundene radioaktive Liganden zu quantifizieren. Daher war es sinnvoll, eine ähnliche Technik zur Quantifizierung der Histidinphosphorylierung in bakteriellen Histidinkinasen zu entwickeln.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Reagenzien und Materialien, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das 96-Well-Dotplot-Gerät einzurichten, schneiden Sie ein acht Zentimeter mal 12 Zentimeter großes Stück Nitrozellulosemembran ab. Positionieren Sie die Nitrocellulose in der Dotplot-Apparatur.

Stellen Sie sicher, dass die Membran so sitzt, dass das Gerät abgedichtet ist und alle Vertiefungen vollständig von der Membran bedeckt sind. Um das Filtrat aufzufangen, wird das Gerät an einen sekundären Seitenarmkolben angeschlossen. Schließen Sie am Ventilschaft einen geeigneten Schlauch an, damit das Gerät bequem verwendet werden kann, ohne den Sekundärkolben zu kippen.

Schließen Sie dann den sekundären Seitenarmkolben an eine Aspirator-Vakuumquelle an. Prüfen Sie, ob das Gerät vollständig abgedichtet ist, indem Sie ein Vakuum auf das Gerät anwenden. Wenn das Gerät richtig zusammengebaut ist, herrscht in allen Vertiefungen ein starkes Vakuum.

Alle Schlauchanschlüsse können mit Parafilm oder Saran-Folie umwickelt werden, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Vor der Einleitung sind alle vier Reaktionskomponenten als vier X-Stammlösungen herzustellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie gleiche Volumina Reaktionspuffer, Histidinkinase und doppelt destilliertes Wasser.

Lassen Sie diese Reaktionskomponenten für kurze Zeit bei Raumtemperatur äquilibrieren. Um die Reaktion in Gang zu setzen, fügen Sie ein Volumen Gamma-32 P ATP-Lösung hinzu und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren. Verfolgen Sie die verstrichene Reaktionszeit mit einem Timer und lassen Sie die Reaktion für die gewünschte Zeit ablaufen.

Unterdrücken Sie die Reaktion. Ein Aliquot der Reaktion auf 325 millimolare Phosphorsäure wird hinzugefügt. Die abgeschreckten Reaktionen werden sofort auf Eis gelegt, bis alle Reaktionen beendet sind.

Stellen Sie das vormontierte 96-Well-Dotplot-Gerät in einen Sekundärbehälter. Dieser Behälter sollte groß genug sein, damit das Gerät leicht zerlegt werden kann, da das Gerät und die Membran nach Gebrauch radioaktiv sind. Wenden Sie ein Vakuum an das 96-Well-Dotplot-Gerät an.

Sobald das Gerät unter Vakuum steht, pipettieren Sie die abgeschreckte Reaktion vorsichtig direkt auf die Nitrozellulosemembran in jeder Vertiefung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Reaktionen auf die Membran geladen sind. Da die Bindungskapazität von Nitrocellulose größer ist als die Menge an gefleckter Histidinkinase, kann davon ausgegangen werden, dass fast die gesamte Kinase bei korrekter Beladung an die Membran bindet.

Achten Sie je nach verwendetem Gerät darauf, die Nitrozellulose nicht zu durchstechen. Beachten Sie, dass die gesamte Reaktion mit der Nitrocellulose in Kontakt gekommen ist. Es ist leicht, dass ein Teil der Reaktion an den Wänden des Brunnens haften bleibt.

Waschen Sie die Vertiefungen mit 100 Mikrolitern eiskalter 25 Millimolar Phosphorsäure. Auf diese Weise kann das Reaktionsvolumen, das möglicherweise in der Vertiefung eingeschlossen war, die Membran erreichen, wodurch eine vollständige Beladung aller Reaktionen gewährleistet ist. Lassen Sie das gesamte Volumen durch die Membran fließen.

Zerlegen Sie das Gerät vorsichtig, bevor Sie das Vakuum ausschalten. Bitte beachten Sie, dass sowohl das Gerät als auch die Nitrozellulosemembran zu diesem Zeitpunkt radioaktiv sind. Entnehmen Sie keine Geräteteile aus dem Sekundärbehälter.

Übertragen Sie die Nitrozellulosemembran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Gerät in einen Behälter von etwa 200 Millilitern mit 25 Millimolar eiskalter Phosphorsäure. Setzen Sie einen Deckel auf diesen Behälter, da die Wäsche radioaktiv ist. Zu diesem Zeitpunkt kann das Vakuum abgeschaltet werden.

Stellen Sie den Behälter mit der Waschmembran auf eine Wippe. Lassen Sie die Membran 20 Minuten lang sanft schaukeln. Nach 20 Minuten die gebrauchte Waschlösung vorsichtig in einen großen Eimer umfüllen, um sie für die vorübergehende Lagerung von Abfällen zu verwenden.

Geben Sie 200 Milliliter eiskalte 25 Millimolare Phosphorsäure in die Membran. Waschen Sie die Membran auf diese Weise mindestens dreimal, um das Hintergrundsignal gamma-32 P ATP von der Membran zu entfernen. Nach der dritten Wäsche die verwendete Waschlösung mit einem Geigerzähler auf Bestrahlung testen.

Waschen Sie die Membran weiter, bis kein Signal mehr in der Waschlösung vorhanden ist. Nachdem die Membran ausreichend gewaschen wurde, lassen Sie die Membran kurz an der Luft trocknen, was in der Regel fünf Minuten oder weniger dauert. Nach Einwirkung der Nitrocellulose auf ein Phosphorgrün, wie im Textprotokoll beschrieben, ist die Färbung und Entfärbung von Ponceau S vorzubereiten.

Tauchen Sie die Nitrozellulosemembran für ein bis zwei Minuten kurz in die Färbelösung Ponceau S. Befeuchten Sie die gesamte Membran mit dem Fleck, bevor Sie ihn entfärben. Anschließend den überschüssigen Ponceau S von der Membran dekantieren.

Spülen Sie die Membran mit doppelt destilliertem Wasser ab, bis nur noch die Flecken der Histidinkinase verfärbt sind. Beachten Sie, dass dieses Verfahren nur funktioniert, wenn alle Flecken nachweisbare Mengen an Protein enthalten. Schneide mit einer Schere jeden Fleck auf der Nitrozellulosemembran aus.

Es ist nicht notwendig, perfekt entlang der Kante der fleckigen Stelle zu schneiden. Wenn die Membran ausreichend gewaschen wurde, ist der Untergrund aufgrund der unterschiedlichen Größe der Ausschnitte vernachlässigbar. Wichtig ist nur, bei jeder Reaktion den gesamten Fleck herauszuschneiden.

Übertragen Sie jeden Fleck vorsichtig mit einer Pinzette in Szintillationsfläschchen. Es ist kein Szintillationscocktail notwendig, da der Phosphor 32 durch Tscherenkow-Strahlung leicht nachweisbar ist. Als nächstes tupfen Sie mehrere Verdünnungen der Gamma-32 P ATP-Lösung auf einen Zentimeter mal einen Zentimeter Quadrat Nitrocellulose

Übertragen Sie jedes Quadrat vorsichtig mit einer Pinzette in Szintillationsfläschchen ohne Szintillationscocktail. Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen, um die Zählungen pro Minute und Picomol der ATP-Lösung zu bestimmen. Hier ist die Ponceau-Färbung der Nitrozellulosemembran zu sehen.

Die Färbung ist bei allen Proben gleichmäßig, was darauf hindeutet, dass alle Proben gleich beladen sind. Die Fluorographie-Ergebnisse der Nitrozellulosemembran zeigen den relativen Gehalt an radioaktiv markiertem Phosphohistidin an jedem Fleck. Die vierte und achte Reihe sind Negativkontrollen, die zeigen, dass überschüssiges ATP von der Nitrozellulosemembran gewaschen wird.

Repräsentative Ergebnisse der Quantifizierung der Histidinkinase-Autophosphorylierung sind hier dargestellt. Diese Daten werden aus der Szintillationszählung jedes aus der Membran herausgeschnittenen Spots generiert. Die hier gezeigte Standardkurve der Zählungen pro Minute pro Pikosol ATP wird ebenfalls aus der Szintillationszählung generiert und zur Berechnung der in jeder Probe vorhandenen Pikosolen von Phosphohistidin verwendet.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie das Einbringen von verwandten Stimuli oder Proteinen, von denen angenommen wird, dass sie die Kinaseaktivität modulieren, in das Experiment aufgenommen werden, um zusätzliche Fragen wie die Wirkung dieser Additive auf die Kinaseaktivität zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. eine angemessene Strahlenschutzschulung und die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und Abschirmung.