Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Autophosphorylierung gereinigter bakterieller Histidinkinasen zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zweikomponentensignalübertragung zu beantworten, beispielsweise den Einfluss kognater Stimuli auf Protein-Protein-Interaktionen bei der Autophosphorylierung von Histidinkinasen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass es sich um eine Hochdurchsatzmethode handelt, mit der pikomolare Mengen gebildeter Phosphohistidine genau detektiert und kinetische Parameter für Histidinkinasen ermittelt werden können. Als Postdoktorand verwende ich die Filtration an Nitrocellulosemembranen zur Quantifizierung proteingebundener radioaktiver Liganden. Daher erschien es sinnvoll, eine ähnliche Methode zur Quantifizierung der Histidinphosphorylierung bei bakteriellen Histidinkinasen zu entwickeln.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Reagenzien und Materialien, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die 96-Loch-Dot-Blot-Apparatur einzurichten, schneiden Sie ein Stück Nitrocellulosemembran von acht Zentimetern mal zwölf Zentimetern zurecht. Platzieren Sie die Nitrocellulose in der Dot-Blot-Apparatur.

Stellen Sie sicher, dass die Membran so angebracht ist, dass die Apparatur abgedichtet ist und alle Vertiefungen vollständig von der Membran bedeckt sind. Verbinden Sie die Apparatur mit einem sekundären Seitenhalskolben, um das Filtrat zu sammeln. Schließen Sie am Ventilstutzen ausreichend Schlauch an, sodass die Apparatur bequem genutzt werden kann, ohne dass der sekundäre Kolben umkippt.

Verbinden Sie anschließend den sekundären Nebenkolben mit einer Vakuumpumpe. Prüfen Sie, ob die Apparatur vollständig abgedichtet ist, indem Sie ein Vakuum anlegen. Wenn die Apparatur korrekt zusammengebaut ist, herrscht in allen Vertiefungen ein starkes Vakuum.

Alle Schlauchverbindungen können mit Parafilm oder Frischhaltefolie umwickelt werden, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Vor Beginn bereiten Sie alle vier Reaktionskomponenten gemäß der schriftlichen Anleitung als vier X-Stammlösungen vor. Mischen Sie gleiche Volumina des Reaktionspuffers, der Histidinkinase und doppelt destilliertem Wasser.

Lassen Sie diese Reaktionsbestandteile für eine kurze Zeit bei Raumtemperatur equilibrieren. Um die Reaktion zu starten, geben Sie ein Volumen der Gamma-32P-ATP-Lösung hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Verfolgen Sie die verstrichene Reaktionszeit mit einem Timer und lassen Sie die Reaktion für die gewünschte Zeit ablaufen.

Stoppen Sie die Reaktion. Geben Sie eine Aliquot aus der Reaktion zu 325 Millimolar Phosphorsäure. Stellen Sie die gestoppten Reaktionen unverzüglich auf Eis, bis alle Reaktionen beendet sind.

Stellen Sie die vormontierte 96-Loch-Dot-Blot-Apparatur in einen sekundären Behälter. Dieser Behälter sollte groß genug sein, um die Apparatur mühelos darin zu zerlegen, da die Apparatur und die Membran nach der Verwendung radioaktiv sein werden. Legen Sie Vakuum an die 96-Loch-Dot-Blot-Apparatur an.

Wenn die Apparatur unter Vakuum steht, pipettieren Sie die abgeschreckte Reaktion vorsichtig direkt auf die Nitrocellulose-Membran in jedem Well. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Reaktionen auf der Membran aufgetragen sind. Da die Bindungskapazität von Nitrocellulose größer ist als die Menge an aufgetragenem Histidinkinase, kann davon ausgegangen werden, dass nahezu die gesamte Kinase bei korrekter Auftragung an die Membran bindet.

Je nach verwendeter Apparatur ist darauf zu achten, die Nitrocellulose nicht zu durchstechen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Reaktion mit der Nitrocellulose in Kontakt gekommen ist. Es kann leicht vorkommen, dass ein Teil der Reaktion an den Wänden des Wells haften bleibt.

Spülen Sie die Vertiefungen mit 100 Mikroliter eiskalter 25 Millimolar Phosphorsäure. Dadurch gelangt jede eventuell in der Vertiefung eingeschlossene Reaktionsflüssigkeit auf die Membran, wodurch sichergestellt wird, dass alle Reaktionen vollständig aufgetragen werden. Lassen Sie die gesamte Flüssigkeitsmenge durch die Membran fließen.

Zerlegen Sie die Apparatur vorsichtig, bevor Sie das Vakuum abschalten. Beachten Sie, dass sowohl die Apparatur als auch die Nitrocellulose-Membran zu diesem Zeitpunkt radioaktiv sind. Entfernen Sie keine Komponenten der Apparatur aus dem Sekundärbehälter.

Mit einer Pinzette die Nitrocellulose-Membran vorsichtig aus der Apparatur in einen Behälter mit etwa 200 Milliliter eiskalter 25 Millimolar-Phosphorsäure überführen. Den Behälter verschließen, da die Waschflüssigkeit radioaktiv ist. Zu diesem Zeitpunkt kann das Vakuum abgeschaltet werden.

Stellen Sie den Behälter mit der Waschmembran auf einen Schüttler. Lassen Sie die Membran vorsichtig 20 Minuten lang schütteln. Nach 20 Minuten gießen Sie die verwendete Waschlösung vorsichtig in einen großen Eimer, der zur vorübergehenden Abfalllagerung dient.

Geben Sie 200 Milliliter eiskalte 25 Millimolar Phosphorsäure auf die Membran. Waschen Sie die Membran auf diese Weise mindestens dreimal, um das Hintergrundsignal von gamma-32 P ATP von der Membran zu entfernen. Nach dem dritten Waschgang prüfen Sie die verwendete Waschlösung mit einem Geigerzähler auf Radioaktivität.

Spülen Sie die Membran weiter, bis im Waschpuffer kein Signal mehr nachweisbar ist. Nach einer ausreichenden Wäsche belüften Sie die Membran kurz, um sie zu trocknen, was in der Regel fünf Minuten oder weniger dauert. Nach der Behandlung der Nitrocellulose mit Phosphorgrün, wie im textbasierten Protokoll beschrieben, bereiten Sie die Färbung mit Ponceau S und die anschließende Entfärbung vor.

Die Nitrocellulose-Membran kurz für ein bis zwei Minuten in die Ponceau-S-Färbelösung eintauchen. Die gesamte Membran vor der Entfärbung mit der Färbung benetzen. Anschließend das überschüssige Ponceau S von der Membran abgießen.

Spülen Sie die Membran mit doppelt destilliertem Wasser, bis nur noch die Flecken der Histidinkinase angefärbt sind. Beachten Sie, dass dieses Verfahren nur funktioniert, wenn alle Flecken nachweisbare Mengen an Protein enthalten. Schneiden Sie mit einer Schere jeden Fleck auf der Nitrocellulosemembran aus.

Es ist nicht notwendig, exakt entlang der Kante des angefärbten Flecks zu schneiden. Wenn die Membran ausreichend gewaschen wurde, ist der Hintergrund durch unterschiedliche Größen der ausgeschnittenen Flecken vernachlässigbar. Wichtig ist lediglich, dass für jede Reaktion der gesamte Fleck ausgeschnitten wird.

Überführen Sie jeden Spot mithilfe einer Pinzette vorsichtig in Szintillationsgefäße. Ein Szintillationscocktail ist nicht erforderlich, da das Phosphor-32 durch Čerenkov-Strahlung leicht nachweisbar ist. Anschließend werden mehrere Verdünnungen einer Gamma-32-P-ATP-Lösung auf einen Quadratzentimeter großen Nitrocellulose-Flecken aufgetragen.

Überführen Sie mit einer Pinzette vorsichtig jedes Quadrat in Szintillationsgefäße ohne Szintillationscocktail. Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zur Bestimmung der Zerfälle pro Minute pro Pikomol der ATP-Lösung zu erstellen. Die Ponceau-Färbung der Nitrocellulosemembran ist hier dargestellt.

Die Färbung ist in allen Proben gleichmäßig, was darauf hinweist, dass alle Proben gleich beladen sind. Die Fluorographieergebnisse der Nitrocellulosemembran zeigen den relativen Gehalt an radioaktiv markiertem Phosphohistidin an jeder Stelle. Die vierte und achte Reihe sind negative Kontrollen, die zeigen, dass überschüssiges ATP von der Nitrocellulosemembran abgewaschen wurde.

Hier sind repräsentative Ergebnisse der Quantifizierung der Autophosphorylierung von Histidinkinasen dargestellt. Diese Daten werden durch Szintillationszählung jedes von der Membran ausgeschnittenen Flecks gewonnen. Die hier gezeigte Standardkurve der Zählraten pro Pikomol ATP, ebenfalls aus der Szintillationszählung ermittelt, dient zur Berechnung der Pikomol Phosphohistidin, die in jeder Probe vorhanden sind.

Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie die Zugabe von kognaten Stimuli oder Proteinen, von denen vermutet wird, dass sie die Kinaseaktivität modulieren, in das Experiment integriert werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Wirkung dieser Zusatzstoffe auf die Kinaseaktivität zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie eine angemessene Strahlenschutzschulung sowie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und Abschirmungen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.