Name: In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie die In-Utero-Elektroporation zur Untersuchung struktureller Konnektivität und Erregbarkeit kortikaler Neuronen. Diese Methode ermöglicht Einzelzellanalysen durch Histologie und Patch-Clamp-Aufzeichnungen.

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Wir danken R. Gutiérrez und A. Morales für ihre hervorragende technische Unterstützung und LA Weiss für die Bearbeitung. CGB wird von der spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011 finanziert. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von BBVA-Stiftung und SAF2014-58598-jin (Mineco) M. Navarrete und durch einen Zuschuss aus dem Ramón Areces Stiftung und Zuschüsse SAF2014-52119-R und BFU2014-55738-REDT finanziert (von Mineco) zu M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II%2FIII+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2CLateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie Neuronen des somatosensorischen Kortex von C75BL / 6-Mäuse zu beschriften, um ihre Verbindungen und ihre Erregbarkeit zu analysieren. In Bezug auf die bestehenden Methoden, visualisiert sie diskriminierende Aspekte der Konnektivität, wie die Anzahl der axonalen Verzweigungen pro Neuron, ihre genaue Topographie und ihrer anatomischen Lage. Durch Veränderung der Position der Elektroden, ist es möglich , andere Neuronenpopulationen, wie beispielsweise die cingulären Cortex zu ziel...

Die Entwicklung von dendritischen und axonalen Strukturen ist ein wichtiger Aspekt der Schaltungsregelung im Nervensystem, in der Großhirnrinde einschließlich. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der selektiven Verdrahtung der verschiedenen neuronalen Subpopulationen. Eine Anzahl von jüngsten Berichte haben gezeigt, dass, zusätzlich zu Verbindungen, die molekulare Vielfalt von Neuronen wird durch die Übernahme von hochspezifischen Modi des Brennens reflektiert. Die Mechanismen , die Erregbarkeit und Konnektivität der verschiedenen neuronalen Subtypen während der Entwicklung, sowie ihre Koordinationsgrad zu bestimmen, sind jedoch immer noch schlecht verstanden , 1, 2. In vivo Verlust- und gain-of-function Analysen zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Expression von spezifischen Genen und deren Einfluss auf die Entwicklung der Schaltung ermöglichen. In utero Elektroporation (IUE) ist eine Technik weit verbreitet zu studierendie Funktion eines Gens von Interesse in spezifischen neuronalen Populationen und die Gesamtmuster ihrer Verbindungen zu studieren. Um jedoch die morphologischen Eigenschaften von Axonen und Dendriten in kortikalen Schichten in lebenden Mäusen zu bestimmen, ist es wichtig, Neuronen dünn zu beschriften. Eine Cre-Rekombinationssystem mit IUE kombiniert verwendet werden, um ein Sparse-Population von Neuronen bei einer ausreichend niedrigen Dichte zu markieren die Vorsprünge durch einzelne Zellen der identifizierten kortikalen laminas emittiert zu lösen. Diese Methode Etiketten eine ausreichende Anzahl von Neuronen pro Kortex quantitative Daten nach der Analyse der angemessenen Anzahl von elektroporiert Gehirne (Abbildung 1) zu erhalten. Dieses Manuskript stellt eine Methode für eine solche Feinanalyse der Konnektivität. Es stellt auch eine ähnliche Strategie zu analysieren, in getrennten Experimenten, die elektrischen Eigenschaften von Neuronen, die durch Strom-Clamp-Aufnahmen auf grün fluoreszierendes Protein Durchführung (GFP) -electroporated Zellen aus akuten kortikalen Scheiben schneiden. Diese proTocole sind vielseitig und können zur Untersuchung der Erregbarkeit und Konnektivität von Neuronen durch zusätzliche Plasmide während IUE WT und transgenen Tieren und auch von Neuronen in denen Verluste und Gewinne von Funktions eingeführt angewendet werden. Obwohl dieses Protokoll kann die Elektroporation von Mäusen an embryonalen Tag (E) 15.5, diese Technik durchgeführt zwischen E9.5 3 und postnatalen Tag (P) 2 4 in jedem Alter werden beschrieben. Während der Elektroporation in frühen Stadien zielt Neuronen und Vorstufen des Thalamus und tiefen Schichten der Hirnrinde, späteren Stufe der Elektroporation Markierungen oberflächlicher Schichten (zB E15.5 IUE Ziele Schicht II-III Neuronen). Zusammenfassend ist die Kombination von IUE mit Einzelzell morphologische Analyse und die Elektro ein nützliches Werkzeug, um die molekularen Mechanismen, die die enorme strukturelle und funktionelle Vielfalt von Neuronen im Nervensystem zu erläutern.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast</td><td>Green Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Imalgen)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (xilagesisch)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Jod</td><td>Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff # 3 - 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen # 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson Pinzette - Gerade 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinschere - Gerade 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Schere Mezenbaum-Nelson Gebogen L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Dünne gebogene Spitzen - Style 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu Nadelhalter - Gezahnt</td><td>Fein Science Tools</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Applier</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Nahtmaterial - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas (100 mm, 1,0/0,58 Außen-/Innendurchmesser)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratorröhrchen für kalibrierte Mikrokapillarpipetten</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gaze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen (Star Cott)</td><td>Albasa-Nadel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Polyklonaler Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatur</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Platinelektroden 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp; für Fluoreszenzbildgebung - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Isofluoran-Verdampfer</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserscanning-System</td><td>Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Mikroskop</td><td>Zeiss-Kryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikropettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Analyse-Softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Acquisition</td><td></td></tr> <tr><td>Software (MultiClamp 700B Verstärker)</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Mikromanipulator + rotierender Sockel&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td></td> Newport-Miniatur-Schlauchpumpen <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero ansätze elektroporation die erregbarkeit neuronaler subpopulationen und einzelzell - konnektivität zu studieren

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Das Nervensystem besteht aus einer enormen Bandbreite von verschiedenen neuronalen Typen zusammen. Diese neuronalen Subpopulationen sind gekennzeichnet durch, unter anderen Merkmalen, ihre unterschiedlichen dendritischen Morphologien, ihre spezifische Muster von axonalen Konnektivität und deren selektive Brennen Antworten. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die für diese Aspekte der Differenzierung während der Entwicklung sind immer noch schlecht verstanden. Hier beschreiben wir kombinierte Protokolle für die Kennzeichnung und die Charakterisierung der strukturellen Verbindungen und Erregbarkeit der Neurone. Die Modifikation der in utero Elektroporation (IUE) Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einer spärlichen Population von Neuronen. Dies wiederum ermöglicht die Identifizierung und Verfolgung der Dendriten und Axone der einzelnen Neuronen, die genaue Charakterisierung der laminaren Lage von axonalen Projektionen und morphometrische Analyse. IUE kann auch in der Erregbarkeit zu untersuchen Veränderungen verwendet werden vonWildtyp (WT) oder gentechnisch veränderten Neuronen indem sie sie mit Ganzzell-Aufnahme von einer akuten Scheiben durch Elektroporation Gehirne zu kombinieren. Diese beiden Techniken tragen zu einem besseren Verständnis der Kopplung von strukturellen und funktionalen Verbindungen und der molekularen Mechanismen der neuronalen Steuerung Vielfalt während der Entwicklung. Diese Entwicklungsprozesse haben wichtige Auswirkungen auf axonalen Verkabelung, die funktionelle Diversität von Neuronen und die Biologie von kognitiven Störungen.

Um die morphologischen Veränderungen von Neuronen im Detail zu charakterisieren und während der Entwicklung ist es wesentlich Neuronen dünn zu etikettieren. Ein Cre-Rekombinase verdünnt System ermöglicht die Expression eines Gens von Interesse in einer spärlichen Population von Neuronen, so dass nur solche Neuronen , die dieses Enzym exprimieren GFP (1A) integrieren. Mit dieser Strategie Schicht II-III wird gezielt und von IUE bei E15.5 gekennzeichnet. CAG-DsRed2 bei 1 u...

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes der intrauterinen Elektroporation besteht darin, die strukturelle Konnektivität und Erregbarkeit kortikaler Neuronen unter normalen und experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung der Struktur und funktionellen Konnektivität des Gehirns sowie der Biologie kognitiver Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es ermöglicht, eine spärliche Population von Neuronen zu markieren, die Dendriten darzustellen und Einzelneuronen zugänglich zu machen, was zu einer effizienteren und präziseren quantitativen Analyse führt.Vor der Injektion bereiten Sie zehn Mikroliter DNA-Mischung pro Operation für die Einzelzellmarkierung oder eine Standard-Patch-Clamp-Studie vor. Danach manipulieren Sie die Embryonen vorsichtig mit den Fingern, um das Telencephalon zu lokalisieren. Anschließend bringen Sie eine vorbereitete Borosilikat-Kapillare in eine Mundpipette ein.Führen Sie die Nadelspitze durch die Gebärmutter, wobei Sie Blutgefäße meiden, bis sie das Seitenventrikel erreicht. Danach injizieren Sie langsam etwa einen Mikroliter der mit Fast Green gefärbten DNA-Lösung, bis ein großer blauer Fleck sichtbar wird. Ein kritischer Schritt bei diesem Verfahren ist die Injektion der DNA.Dies sollte so schonend wie möglich erfolgen. Platzieren Sie nun die sieben Millimeter großen Platin-Elektroden seitlich am Kopf eines Embryos und leiten Sie Spannung über die Platin-Elektroden ein. Kryoschützen Sie in diesem Verfahren die fixierten Gehirne in zehn Milliliter 30%iger Saccharose in PBS bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Tage, bis sie absinken.Danach bereiten Sie Aluminiumfolienwürfel mit einem Kubikzentimeter vor und füllen die Würfel zu zwei Dritteln mit OCT. Anschließend geben Sie die Gehirne in die Würfel und gefrieren sie auf Trockeneis ein. Lagern Sie die eingefrorenen Gehirne danach bei 80 Grad Celsius.Um die Gehirne im Kryostaten zu schneiden, einen Tropfen OCT auf die Oberfläche der Probenscheibe geben. Die Aluminiumfolie vom Histologieblock ablösen und den Block in der gewünschten Orientierung auf das flüssige OCT setzen. Fest andrücken, bis der Histologieblock fixiert ist.Danach die Probenscheibe in den Probenträger des Kryostaten einlegen und die Probe für das Schneiden ausrichten. Anschließend 50–100 µm dicke Schnitte anfertigen und die schwimmenden Kryoschnitte mit einem feinen Pinsel in PBS überführen. Danach die Schnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 5 % fetalem Rinderserum in PBS blockieren, das 0,5 % Triton X-100 enthält.Anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius mit primärem Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:500 in Blockierungslösung inkubieren. Am nächsten Tag die Schnitte dreimal mit PBS waschen. Sekundären Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:500 in Blockierungslösung hinzufügen und die Schnitte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Anschließend die Schnitte dreimal mit PBS waschen. Danach die Schnitte mit DapE in PBS, das 0,5 % Triton X-100 enthält, für zehn Minuten kontrastfärben. Die Schnitte mit PBS abspülen und mit Eindeckmedium auf Objektträger aufbringen.Um die Neuronen zu rekonstruieren, nehmen Sie Bilder der Gehirnschnitte mit hoher Vergr&ouml;&szlig;erung und hoher Aufl&ouml;sung auf. W&auml;hlen Sie anschlie&szlig;end im Aufnahmesoftware den Modus „Tile Scan“, um den interessierenden Bereich abzudecken, der alle Dendriten und axonalen Forts&auml;tze einschlie&szlig;t. Nehmen Sie eine ausreichende Anzahl von Stapeln entlang der Z-Achse auf, um Informationsverluste zu vermeiden.Danach öffnen Sie das Bild und wählen die Option „segmentierte Linie“ aus dem Menü aus. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Struktur des Neurons. Anschließend gehen Sie zu Analysieren, Werkzeuge, dann zum ROI-Manager und klicken auf Hinzufügen, um die Linie zu speichern.Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Axon oder jede Dendrit des analysierten Neurons. Drücken Sie im ROI-Manager-Menü auf „Measure“, um die Länge zu erhalten. Exportieren Sie die Messwerte in eine Textdatei oder eine Tabelle zur Analyse.Um eine Aufnahme eines GFP-exprimierenden Neurons aus einem GFP-elektroporierten Mausgehirn durchzuführen, legen Sie das Gehirn in eine gekühlte Kulturschale. Schneiden Sie das Kleinhirn mit einer kleinen Schere ab. Heben Sie dann das Gehirn mit einem Spatel auf und tupfen Sie es auf einem Papiertuch trocken.Kleben Sie die ventrale kaudale Ebene des Gehirns auf einen Vibratom-Halter. Platzieren Sie den Halter in ein Vibratom, das mit eiskaltem ACSF gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass die Vibratom-Kammer kontinuierlich mit Carbogen versorgt wird. Danach gewinnen Sie akute Schnitte, indem Sie innerhalb von 15 Minuten 300 Mikrometer dicke koronale Schnitte anfertigen.Als Nächstes inkubieren Sie die akuten Schnitte bei 25 Grad Celsius mindestens 60 Minuten lang in ACSF, während Sie mit Carbogen durchbläst. Nach 60 Minuten überführen Sie einen Schnitt mit einer Pasteur-Pipette oder einem kleinen Pinsel in die Ableitungskammer. Befestigen Sie den Schnitt mit einem Harp und spülen Sie ihn kontinuierlich mit ACSF mit einer Rate von zwei Millilitern pro Minute. Um ein GFP-positives Neuron zu patchen, lokalisieren Sie den Bereich von Interesse mithilfe des Mikroskops bei 10x. Suchen Sie dann mit dem 60x-Objektiv eine GFP-positive Zelle. Füllen Sie anschließend die Aufnahmeelektrode mit intrazellulärer Lösung.Platzieren Sie anschließend eine Glaspipette in der Pipettenhalterung. Danach führen Sie die Pipettenspitze in das Bad ein und fokussieren die Spitze. Sobald sich die Pipette im Bad befindet, leiten Sie eine positive Druckbeaufschlagung über das Rückdruck-Steuerungssystem ein.Nähern Sie sich unter visueller Kontrolle der gewünschten Zelle an, wobei ein Rückdruck in der Pipette aufrechterhalten wird. Sobald sich eine kleine Delle auf der Zelloberfläche zeigt, lassen Sie den Druck ab. An diesem Punkt kann sich ein dichter Verschluss mit einem Widerstand von mehr als einem Gigaohm bilden.Andernfalls eine leichte Unterdruckkraft anwenden, um dies zu erleichtern. Während die Dichtung gebildet wird, die Haltespannung der Spannungsclamps auf 60 Millivolt einstellen. Sobald die Giga-Ohm-Dichtung gebildet ist, einen kurzen Unterdruckimpuls anwenden, um die Zellmembran zu rupturieren und in den Ganzzellmodus überzugehen.Sobald der Ganzzellenmodus erreicht ist, wechseln Sie vom Spannungs- in den Stromklampenmodus und beginnen Sie mit der Aufzeichnung. Diese Bilder zeigen die Übertragung von Vektoren in Neuronen der Schicht 2/3 mittels intrauteriner Elektroporation am embryonalen Tag 15,5; die koronalen Schnitte wurden am postnatalen Tag 16 angefertigt. Der CAG DsRed2-Vektor wurde als Kontrolle cotransfiziert.Das GFP wird nur in jenen Neuronen exprimiert, die ebenfalls Cre aufgenommen haben, wodurch die Rekombination der LoxP-Stellen im CALNL-GFP-Vektor ermöglicht wird. Hier sehen Sie ein konfokales Bild mit hoher Vergr&ouml;&szlig;erung der dendritischen B&auml;ume eines weiteren sp&auml;rlich markierten GFP-Neurons. Es handelt sich um ein pyramidales Neuron, das mit GFP elektroporiert wurde und unter Hellfeld- und gr&uuml;ner Fluoreszenz-Bedingungen beobachtet wurde.Hier ist eine typische, regelmäßige Spiking-Antwort eines CAG-GFP-elektroporierten Kontrollneurons in Schicht 2/3. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in 30 Minuten für Elektroporationen in utero und an einem halben Tag für die Patch-Clamp-Aufzeichnung durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Operation so schnell wie möglich durchzuführen, um den Stress der Mutter zu verringern und die Überlebenschancen der Welpen zu erhöhen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Expressionsanalyse angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise den Zusammenhang zwischen der Expression spezifischer Gene und deren Einfluss auf die Entwicklung des Wirtsorganismus. Nach ihrer Etablierung ebnete diese Technik Forschenden auf dem Gebiet der Entwicklungsneurowissenschaften den Weg, um die Vernetzung und Morphologie von Neuronen bei Mäusen zu untersuchen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intrauterine Operationen nutzt, um die Struktur und Vernetzung von Neuronen auf Einzelzellniveau sowie die Erregbarkeit fluoreszenzmarkierter Neuronen zu beschreiben.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

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Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

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Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Erfahren Sie die In-Utero-Elektroporation zur Untersuchung struktureller Konnektivität und Erregbarkeit kortikaler Neuronen. Diese Methode ermöglicht Einzelzellanalysen durch Histologie und Patch-Clamp-Aufzeichnungen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

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