In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses in utero-Elektroporationsansatzes ist es, die strukturelle Konnektivität und Erregbarkeit kortikaler Neuronen unter normalen und experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, wie z.B. die Analyse der Struktur und funktionellen Konnektivität des Gehirns und die Biologie kognitiver Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Markierung einer dünn besetzten Population von Neuronen ermöglicht und es Ihnen ermöglicht, die Dendriten zu verbinden und auf die einzelnen Neuronen zuzugreifen, was zu einer effizienteren, feineren quantitativen Analyse führt.

Bereiten Sie vor der Injektion zehn Mikroliter DNA-Mischung pro Operation für die Einzelzellmarkierung oder die Standard-Patch-Clamp-Studie vor. Manipulieren Sie dann die Embryonen vorsichtig mit den Fingern, um das Telencephalon zu lokalisieren. Legen Sie anschließend eine vorbereitete Borosilikatkapillare in eine Mundpipette.

Führen Sie die Nadelspitze durch die Gebärmutter und vermeiden Sie dabei die Blutgefäße, bis sie den Seitenventrikel erreicht. Injizieren Sie danach langsam etwa einen Mikroliter Fast Green DNA-Lösung, bis ein großer blauer Fleck zu sehen ist. Ein kritischer Schritt in diesem Verfahren ist die Injektion der DNA.

Dies sollte so sanft wie möglich erfolgen. Platzieren Sie nun die sieben Millimeter großen Platinelektroden seitlich auf dem Kopf eines Embryos und legen Sie über die Platinelektroden eine Spannung an. Bei diesem Verfahren kryokontieren die fixierten Gehirne in zehn Millilitern 30%iger Saccharose in PBS bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Tage, bis sie absinken.

Bereite dann einen Würfelzentimeter Alufolienwürfel vor und fülle die Würfel zu 2/3 oder ganz nach dem Weg mit OCT. Danach legst du die Gehirne in die Würfel und frierst sie auf Trockeneis ein. Lagern Sie die gefrorenen Gehirne anschließend bei 80 Grad Celsius.

Um das Gehirn im Kryostaten zu schneiden, geben Sie einen Tropfen OCT auf die Oberfläche der Probenscheibe. Ziehen Sie die Aluminiumfolie vom Histologieblock ab und positionieren Sie den Block in der gewünschten Ausrichtung auf dem flüssigen OCT. Üben Sie festen Druck aus, bis der histologische Block fixiert ist.

Führen Sie dann die Probenscheibe in den Probenkopf des Kryostaten ein und richten Sie die Probe für die Schnittung aus. Schneiden Sie dann 50-100 Mikrometer dicke Schnitte und übertragen Sie die schwimmenden Kryosektionen mit einem feinen Pinsel auf PBS. Blockieren Sie anschließend die Schnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 5 % fötalem Rinderserum in PBS, das 0,5 % Triton X-100 enthält.

Inkubieren Sie sie anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius mit 1:500 Primärantikörpern, die in Blockierungslösung verdünnt sind. Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS. 1:500 Sekundärantikörper in Blockierungslösung verdünnt zugeben und die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Dann waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS. Anschließend werden die Abschnitte zehn Minuten lang mit dapE in PBS mit 0,5 % Triton X-100 gegengefärbt. Spülen Sie die Abschnitte mit PBS ab und montieren Sie sie mit Eindeckmedium.

Um die Neuronen zu rekonstruieren, werden Bilder der Hirnschnitte mit hoher Vergrößerung und hoher Auflösung aufgenommen. Wählen Sie als Nächstes Tile Scan in der Erfassungssoftware, um den interessierenden Bereich abzudecken, der alle Dendriten und axonalen Prozesse umfasst. Erfassen Sie eine ausreichende Anzahl von Stacks auf der Z-Achse, um Informationsverluste zu vermeiden.

Öffnen Sie danach das Bild und wählen Sie die Option segmentierte Linie aus dem Menü. Zeichne eine Linie, die der Struktur des Neurons folgt. Gehen Sie anschließend zu Analysieren, Tools, gefolgt von ROI-Manager und dann Hinzufügen, um die Zeile zu speichern.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Axon oder jeden Dendriten des analysierten Neurons. Drücken Sie im Menü ROI-Manager auf Messen, um die Länge abzurufen. Exportieren Sie die Messungen zur Analyse in eine Textdatei oder Tabelle.

Um eine Aufzeichnung des GFP-exprimierten Neurons einer GFP-elektroporierten Maus durchzuführen, legen Sie das Gehirn in eine gekühlte Kulturschale. Schneide das Kleinhirn mit einer kleinen Schere ab. Nehmen Sie dann das Gehirn mit einem Spatel auf und tupfen Sie es auf einem Papiertuch trocken.

Kleben Sie die ventrale Schwanzebene des Gehirns auf einen Vibratom-Halter. Platzieren Sie den Halter auf einem mit eiskaltem ACSF gefüllten Vibratome und stellen Sie sicher, dass die Vibratome-Kammer kontinuierlich karbogeniert ist. Anschließend erhalten Sie akute Schnitte, indem Sie innerhalb von 15 Minuten 300 Mikrometer große Koronalschnitte schneiden.

Als nächstes inkubierst du die spitzen Scheiben bei 25 Grad Celsius für mindestens 60 Minuten in ACSF, während du sie mit Carbogen blubbert. Nach 60 Minuten wird eine Scheibe mit einer Pasteur-Pipette oder einem kleinen Pinsel in die Aufnahmekammer übertragen. Halten Sie die Scheibe mit einer Harfe fest und überschwemmen Sie sie mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von zwei Millilitern pro Minute.

Um ein GFP-positives Neuron zu patchen, lokalisieren Sie den interessierenden Bereich durch das Mikroskop bei 10x. Finden Sie dann eine GFP-positive Zelle mit dem 60x-Objektiv. Füllen Sie anschließend die Aufzeichnungselektrode mit intrazellulärer Lösung.

Setzen Sie anschließend eine Glaspipette in den Pipettenhalter ein. Legen Sie anschließend die Pipettenspitze in die Badewanne und fokussieren Sie sich auf die Spitze. Sobald sich die Pipette im Bad befindet, üben Sie über das Gegendruckkontrollsystem Überdruck aus.

Nähern Sie sich der interessierenden Zelle unter visueller Führung, während Sie den Gegendruck in der Pipette aufrechterhalten. Wenn ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche erscheint, lassen Sie den Druck ab. An dieser Stelle kann sich eine dichte Abdichtung mit einem Widerstand größer als einem Gigaohm bilden.

Andernfalls üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um dies zu erleichtern. Während die Dichtung geformt wird, bringen Sie die Haltespannungsklemme auf 60 Millivolt. Sobald die Giga-Ohm-Dichtung gebildet ist, wenden Sie einen Saugimpuls an, um die Zellmembran zu durchbrechen und in den Ganzzellenmodus zu übergehen.

Sobald es sich im Ganzzellenmodus befindet, wechseln Sie vom Spannungsklemmen- in den Stromzangenmodus und starten Sie die Aufnahme. Diese Bilder zeigen die Abgabe von Vektoren an Neuronen der Schicht 2/3 durch in utero-Elektroporation am embryonalen Tag 15.5, und die koronalen Schnitte wurden am postnatalen Tag 16 präpariert. Der CAG DsRed2-Vektor wurde als Kontrolle kotransfiziert.

GFP wird nur in solchen Neuronen exprimiert, die auch cre eingebaut haben, was die Rekombination der LoxP-Stellen im CALNL GFP-Vektor ermöglicht. Hier ist ein konfokales Bild mit hoher Vergrößerung der dendritischen Dorne eines anderen spärlich beschrifteten GFP-Neurons. Dabei handelt es sich um ein pyramidales Neuron, das mit GFP elektroporiert wurde und unter hellen Feldern und grüner Fluoreszenz beobachtet wurde.

Hier ist eine typische, regelmäßige Spike-Reaktion eines CAG-GFP-elektroporierten Kontrollneurons auf Schicht 2/3. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten für In-utero-Elektroporationen und einen halben Tag für die Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die Operation so schnell wie möglich durchzuführen, um den Stress der Mutter zu reduzieren und die Überlebenschancen der Welpen zu erhöhen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Expression durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Beziehung zwischen der Expression bestimmter Gene und ihrem Einfluss auf die Entwicklung des Surrogats. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsneurowissenschaften, um die Konnektivität und Morphologie von Neuronen bei Mäusen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die In-utero-Operation verwenden, um die Struktur und Konnektivität von Neuronen auf Einzelzellebene und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben.