Name: Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Proteininteraktionen eines bakteriellen Effektors mit Malus domestica mittels Yeast-Two-Hybrid-Screen identifizieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Apfeltriebsucht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner und Florian Senoner vom Versuchszentrum Laimburg und Mirelle Borges Dias Schnetzer von Dualsystems Biotech AG für die technische Unterstützung und Julia Strobl für das Manuskript Korrektur. Diese Arbeit wurde im Rahmen des APPL2.0 Projekt durchgeführt und wurde von der Autonomen Provinz Bozen / Bolzano, Italien und dem Südtiroler Apfelkonsortium teilweise finanziert.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Im Y2H Bildschirm wird das Potential Effektor-Protein mit verschiedenen hypothetischen interagierende Proteine ​​(Schritt 7) co-exprimiert wird. Jeder wachsende Hefe Klon enthält den Köder, aber eine (potentiell) unterschiedliche Interaktor. Die interagierenden Proteine ​​werden in einer cDNA-Bibliothek codiert wird, die in die Beute Plasmide kloniert wird. Der Köder und die Beute Plasmide jedes Co-cistronically-Code für einen Teil eines Hefe-Transkriptionsfaktors. Im Falle einer physikalischen Wechselwirkung zwischen Köder (Effektorzellen) und einer Beute plasmid-kodierten Interaktor die beiden Transkriptionsfaktor Teile (die DNA-Bindungsdomäne und die Aktivierungsdomäne) vereinigt sind, und die Expression des Reportergens induziert wird. Die Hefe in der Lage, auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten zu wachsen. Die Art der Beute cDNA-Bibliothek ist abhängig von der abgeschirmten Effektor und muss entsprechend gewählt werden. Die Beute und Köder Vektor, sowie der Hefestamm, müssen kompatibel sein. In diesem Bildschirm Bindung eine LexA DNA-Domäne und die Gal4 Aktivierung domain wurden als kompatibel Hefe-Transkriptionsfaktor-Einheiten eingesetzt. Die cDNA-Bibliothek kann individuell konstruiert werden, nach Maß, oder im Handel erhalten. Die Herstellung der cDNA Beute-Bibliothek ist nicht Teil dieses Protokolls. In diesem Protokoll wird ein selbst erstellter, normalisierte cDNA - Bibliothek aus der RNA von Malus x domestica Blätter verwendet wurde und kloniert in pGAD-HA 41. Der Effektor (Köder) Hefestamm exprimierenden wurde mit der Beute-Bibliothek transformiert, und Klone wurden auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten ausgewählt. Plasmid-DNA aus den Hefekolonien, ein säulenbasierte DNA Plasmid Mini Kit für Bakterien Extrakt in Kombination mit einer mechanischen Störung Schritt unter Verwendung von Glasperlen empfohlen, Hefe Lyse (Schritt 8) verbessern. In diesem Plasmid Reinigung wird der Köder und die Beute Vektor gereinigt in relativ geringen Konzentrationen gleichzeitig werden. Jedoch ist die Menge an Plasmid DNA genug, um das Wechselwirkungspartner durch Sequenzierung wit zu identifizierenhout vor Plasmid Ausbreitung (Schritt 8.4). Als Alternative gereinigte DNA in Schritt 8.4 kann in kompetente E. coli und ausgewählt mit Beute - Vektor-vermittelter Antibiotikaresistenz transformiert werden (zB das Ampicillin bei pGAD-HA). Die ausgewählte E. coli - Kolonien tragen nur die pGAD-HA Bibliothek Plasmid und High-Yield - Plasmid Reinigung kann mit diesen Klonen durchgeführt werden. Auch die erfolgreiche Transformation von pLexA-N und pGAD-HA-Konstrukte ergänzt das Tryptophan und Leucin-Auxotrophie von NMY51. Eine Wechselwirkung zwischen dem Effektor und einem Protein (kodiert auf pGAD-HA) führt zur Aktivierung des Reportersystems in NMY51 Stämmen. Im Fall der Selbstaktivierung, NMY51 mit dem Effektor transformierte pLexA-N in Kombination mit dem leeren Bibliotheksvektor pGAD-HA wächst auf selektiven Platten fehlt trp-leu-his-ade aufgrund der unerwünschten Aktivierung des NMY51 Reportersystems exprimiert 40. Die Selbstaktivierung kann w seineak und in Abwesenheit von trp-leu-his oder die Aktivierung durch Wachstum stark sein kann und dadurch auf trp-leu-his-ade Platten 41 auftreten können. Selbstaktivierung kann einen massiven Hintergrund von falsch-positiven Klonen im eigentlichen Y2H Bildschirm verursachen. Um dies zu vermeiden, muss eine Selbstaktivierungstest mit dem Köder werden durchgeführt, in dem der Effektor-exprimierenden Vektor co-transformiert mit dem leeren Vektor-Bibliothek. In dieser experimentellen Einstellung, Reportergenexpression muss nicht induziert werden. Wenn Selbstaktivierung ( das heißt Wachstum auf selektiven Platten) in dem Test sichtbar ist, kann das Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3-Amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) ergänzt werden. 3-AT ist ein Inhibitor der imidazoleglycerol-phosphat - Dehydratase (HIS3), ein Enzym wichtig während Histidinbiosynthese 46. Die Supplementation mit 3-AT können die schwachen Effekte der Selbstaktivierung während Y2H Bildschirme 47, reduzieren48. Verschiedene Konzentrationen von 3-AT sollte getestet werden. In diesem Protokoll, 1-40 mM 3-AT wurden verwendet. Die niedrigste Konzentration, die Selbstaktivierung zur Unterdrückung führt sollten anschließend im Y2H Bildschirm verwendet werden. Die selektiven Platten des Selbstaktivierungstest kann nur dann, wenn die SD-trp-leu-Platten der eine ausreichende Anzahl von Klonen enthalten Cotransformation ausgewertet werden. Als Hinweis ≥ 500 Kolonien pro 90 mm (Durchmesser) Petrischale ausreichend sind. Um die genaue Transfektionseffizienz zu bestimmen, wird empfohlen, serielle Verdünnungen der co-transformierter Hefe herzustellen und sie auf SD-trp-leu-Platten zu verteilen. Selbstaktivierung zu reduzieren, kann der Effektor in pLexA-C geklont werden, ein Köder-Expressionsvektor, der das LexA-Tag an den C-Terminus des Proteins verbindet. Die Orientierung der Lex-A - Tag kann Selbstaktivierung 24 dämpfen. Jedoch ist es nicht möglich, in jedem Falle zu verringern oder zu Selbstaktivierung abzuschaffen. Die Formation derrot oder rötlich Kolonien deutet auf eine schwache oder falsch-positive Interaktion. Der ade2 Reportergen von NMY51 wird nur aktiviert , wenn es um eine Interaktion von Protein-Protein kommt, was wiederum blockiert die Akkumulation eines roten Farbstoffes in diesem Hefestamm 40. In Abwesenheit einer Wechselwirkung sind NMY51 rötlich, während die Kolonien tragenden starke Interaktoren weiß sind. Die Beobachtung der Koloniefarbe auf den Selektionsplatten ist somit ein weiterer wichtiger Hinweis, um zu beurteilen, ob die jeweiligen Kolonien Echt- oder falsch-positiven Interaktoren. Es ist schließlich notwendig, anzupassen oder bestimmte Testeinstellungen ändern in Bezug auf die Art der Köder und die Interaktion Eigenschaften. Mittlerweile wurden eine Reihe von Verbesserungen und derivative Techniken des gemeinsamen Y2H etabliert für die Analyse von sehr schwierig Protein-Interaktionen in verschiedenen Host-Systemen zu ermöglichen. Eine Überprüfung von Stynen et al. 49 Adressen and beschreibt verschiedene Aspekte der Y2H, seine Verbesserungen und Anpassungen und liefert somit wertvolle Informationen darüber, wie die entsprechende Interaktion Test zu wählen. Y2H Bildschirme und abgeleitete Techniken weit verbreitet in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, wo auch immer Identifizierung von binären Protein-Interaktionen erforderlich ist. Selbst wenn kritische Kontrollen durchgeführt werden, wie beispielsweise Selbstaktivierungstests des Köders und ein-zu-eins - Wieder Transformationen der identifizierten interagierende Proteine, die Y2H anfällig falsche Ergebnisse liefern 26, 50, 51. Die Hefe als Modell für alle Interaktionsstudien nicht geeignet. Hefe nicht notwendigerweise eine zelluläre Umgebung dar, die die entsprechende posttranslationale Modifikation und Faltung für jedes 24 - Protein unterstützt. Weiterhin ist in der Y2H Einstellung werden die Proteine ​​überexprimiert, und ihre Expression ist nicht die Kontrolledurch ihren natürlichen Promotor führte. Die Y2H zwingt die proteinösen Bindungspartner an den Zellkern, die nicht notwendigerweise ihre natürliche subzellulären Ziel. Die nativen zellulären Umstände der Interaktion kann somit nicht von der Hefe reflektiert werden und zu falsch negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen kann. Die meisten Y2H werden auf Hefe-Auxotrophie Komplementation als selektives Prinzip. Diese Ernährungs Auswahl wird durch eine hohe Empfindlichkeit aus, aber auf Kosten einer verringerten Selektivität im Vergleich zu anderen (beispielsweise chromogene reporter) -Assays 49. Wenn unreducible Selbstaktivierung (siehe oben) oder andere Beschränkungen auftreten , für eine bestimmte Effektorfunktion ist die Y2H kein geeigneter Test 25. In Tabelle 1 und Abbildung 1, die erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungstest gegeben. Das Fehlen von realen Interaktionen (dh falsche Negative) durch Protein Toxizität, fehlerhafte translationale Protein verursacht werdenVerarbeitung, sterische Hinderung der Interaktion, unterrepräsentierte Interaktionspartner in der Beute Bibliothek, Membranlokalisierung des Köders oder fehlenden Komponenten , die für die Interaktion 24. Es wird empfohlen, de novo verstärken das Volllängen - Gen des identifizierten interagierenden Proteins aus cDNA, subklonieren es in pGAD-HA, und führen eine Eins-zu-Eins - Wechselwirkungsassay die erzeugte pGAD-HA - Konstrukt in den Köder-exprimierenden durch Transformieren NMY51 Stamm. Dies ist notwendig, da die beobachtete Interaktors in dem Beute-Bibliothek nur ein Fragment eines größeren Proteins sein könnte. Jedoch ist die Information für die jeweiligen Volllängen-Gen nur zugänglich, wenn beträchtliche genomischen und transkriptomischen Sequenzdaten verfügbar sind. Das Transformationsprotokoll für das Selbstaktivierungstest hier beschrieben sind, können für eine solche Eins-zu-Eins-Assays angewendet werden, und die Wechselwirkung zwischen dem Bait und dem Interaktor reproduzierbar sein müssen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Wechselwirkungen in einem Y2H Bildschirm identifiziert muss immer von einer anderen unabhängigen Technik bestätigt werden. Diese unabhängige Technik muss auf die natürliche Umgebung des eigentlichen Protein-Protein-Wechselwirkung näher sein. In dem Fall des phytoplasmal Effektor ATP_00189 wurde die Wechselwirkung mit den TCP - Transkriptionsfaktoren von Malus x domestica in planta mit bimolekularen fluoreszierendes Komplementation (BiFC) in Nicotiana benthamiana prüft Protoplasten 28 (nicht Teil des Protokolls). Der Effektor-Protein ATP_00189 wurde aus der Pflanze Erreger P. mali abgeleitet. In planta BIFC wurde somit ATP_00189 Wechselwirkungen mit den Malus x domestica Transkriptionsfaktoren zu überprüfen gewählt zuvor in dem Y2H 28 identifiziert. BiFC ist ein Protein-Protein-Interaktionsassay, der nicht die subzelluläre Translokation der interagierenden Proteine ​​in den Zellkern, um das Reportersystem zur Aktivierung erfordert &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Darüber hinaus ahmt die in planta - Expression und Modifikation Maschinen die Umgebung der natürlichen Interaktion zwischen Pflanze bakterielle Effektor in seiner Wirtspflanze. Allerdings ist ein globaler Bildschirm BIFC mit nicht durchführbar ist. Es gibt mehrere Schritte in dem Protokoll, das sorgfältig behandelt werden müssen. Wenn das Gen von Interesse zu verstärken (Schritt 4), ist es wichtig zu bestimmen, dass Primer an Pflanzen-DNA binden. Somit DNA aus nicht-infizierten Pflanzen müssen als negative Kontrolle einbezogen. Die Sequenz des Gens von Interesse nicht enthalten die EcoRI und SalI-Restriktionsstellen, die für die gerichtete Klonierung des Einsatzes verwendet werden. Wenn die Sequenz diese Seiten enthält, müssen verschiedene Restriktionsenzyme für das Klonen ausgewählt werden. Hefe-Transformation ist eine zentrale Methode während dieses Protokolls. Die Transfektionseffizienz ist abhängig von der Kompetenz der Hefezellen, ihre Lebensfähigkeit, den Wachstumszustand, und die Qualität der Transfektion REAGent 53, 54. Für das vorgeschlagene Protokoll wird dringend empfohlen, Hefe zu verwenden, die aus frischen Platten nicht älter als zwei Wochen (gehalten bei 4 ° C), wenn die Transformationen durchführen. Oft wird das Wachstum der transformierten Hefe verzögert, wenn selektive Flüssigkulturen mit Kolonien aus alten Agarplatten inokuliert. Es ist auch hilfreich, um eine flüssige Starterkultur als Inokulum für den tatsächlichen Experimente zu verwenden und nicht die Hefe von der Platte direkt zu verwenden. Geringe Effizienz bei der Transfektion der Beute in den Köder-exprimierenden Hefe kann auf die Unterrepräsentation bestimmter Beuteproteine ​​(potentielle Interaktionspartner) führen und den gesamten Bildschirm so schräg kann. In diesem Protokoll wird ein Hefe-Transfektionseffizienz von ~ 150.000 cfu / &amp; mgr; g DNA transfiziert in der Y2H funktionierte gut. die Mängel und Nachteile des Y2H Technik zu kennen und die Ergebnisse in einer kritischen und in geeigneter Weise zu interpretieren ist unverzichtbar, um die korr Zeichnungect Schlussfolgerungen. Y2H Assays und die Derivate werden seit vielen Jahren verwendet und haben viele Verbesserungen und Anpassungen in Bezug auf die verschiedenen Ködercharakteristik, die subzelluläre Lokalisierung der Wechselwirkung, die erwarteten Bindungspartner und andere Faktoren unterzogen, die für die Interaktion erforderlich sein könnten (siehe Y3H 55, 56, 57). Vor kurzem Array-basierten Y2H Bildschirme entwickelt worden, die für automatisierte Hochdurchsatz - Analyse zahlreicher Ködern gegen Millionen preys 58 ermöglichen. Die Zukunft liegt höchstwahrscheinlich in der Automatisierung und Hochdurchsatz-Ansätze zu diesem Test für die Aufklärung komplexer Signalwege und Interaktom in verschiedenen Forschungsbereichen zu ermöglichen.

<html> Hefe - Zwei-Hybrid - Screens (Y2H) wurden 1 vor etwa 27 Jahren entwickelt und haben seitdem breite Anwendung in verschiedenen Gebieten verwendet worden , um spezifische Protein-Protein - Wechselwirkungen zu bestimmen , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Die physikalische Wechselwirkung eines bakteriellen Effektor mit einem Host-Zielprotein ist oft Voraussetzung für die funktionelle Manipulation dieses Zielproteins. Diese Interaktionen analysieren hat in den Fokus der vielen verschiedenen Bereichen der Infektion 12 Biologie bewegt, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Das Prinzip des Y2H Bildschirm ist , dass die Wechselwirkung der beiden Proteine in die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors führt, der die Expression von Reportergenen antreibt. Die bekannte Effektor (der&quot; Köder &quot;) translatorisch verschmolzenen an die DNA-Bindungsdomäne (DBD) des Transkriptionsfaktors, und die möglichen Wechselwirkungspartner (die &quot;Beute&quot;) an die Aktivierungsdomäne (AD) der jeweiligen Transkriptionsfaktor fusioniert ist. Da der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, eine Bibliothek von potentiellen Interaktoren in die so genannte geklont &quot;Beute-Bibliothek&quot;. Normalerweise diese Bibliothek durch Klonieren von cDNAs in einen geeigneten Beute-Vektor Expressionsplasmid codierend das AD hergestellt ist, die mit dem Köder-Vektor kodiert DBD. bei einer Wechselwirkung kompatibel ist, die rekonstituiert Transkriptionsfaktoren die Expression von Reportergenen, induzieren, die im allgemeinen das Wachstum von Hefe-Auswahl zu ermöglichen. dieIdentifizierung der Interaktionspartner wird durch die Sequenzierung der Beute Plasmid mit Plasmid-spezifischen Primer erreicht. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt , zu manipulieren und ihre Host-Stoffwechsel verwerten oder Abwehrmechanismen zu umgehen und Effektor - Molekülen über verschiedene Bakterien Sekretion Systeme 19, 20, 21 absondern. die Bindungspartner dieser bakteriellen Effektoren bestimmen, ist daher der erste Schritt in der Stellweges in dem Host zu identifizieren. Dies führt zu einem verbesserten Verständnis der spezifischen Mechanismen Pathogenität. Y2H Bildschirme werden durchgeführt , bakterielle Effektor Interaktionen während phytoplasmoses zu identifizieren, und oft ist ein entscheidender Y2H anfänglichen Experiment zur weiteren Charakterisierung der molekularen Mechanismen Pathogenität in phytoplasma Forschung 22, 23. Doch das trafin den meisten Publikationen hod Beschreibung ist eher selten, und diese Techniken werden oft an Biotech-Unternehmen ausgelagert. Um die Aufmerksamkeit auf die Durchführbarkeit dieses Verfahrens zeichnen, dieses Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Informationen Interaktionspartner eines bakteriellen Effektor-Molekül in seinem natürlichen Wirt identifizieren. Trotz der breiten Nutzung und den schnellen Vorlauf Ansatz von Y2H Bildschirme, darf nicht vergessen werden, dass bestimmte Interaktionen nicht in der Hefe-System auftreten könnten. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass die Hefezelle als eine Art von &quot;in vivo Reaktionsbehälter&quot; mit bestimmten biologischen Einschränkungen verwendet. Mehrere Autoren haben die Vor- und Nachteile von Y2H und seine Derivate 11, 24, 25, 27 26, gerichtet. Allgemeine Überlegungen sind beispielsweise, dass die Hefezelle nicht die entsprechende bieten könnteGenexpression, (post-) translationale oder translocational Bedingungen für die jeweiligen Proteine ​​untersucht. Dies kann auf dem Bildschirm zu falsch negativen Ergebnissen führen. Positive Wechselwirkungen können wiederum Artefakte und in der natürlichen Situation (dh im Fall von Effektoren in den geeigneten Wirt) auftreten , möglicherweise nicht. Es ist daher unerlässlich, um die Wechselwirkungen von der heterologen Hefe-Expressionssystem mit einem unabhängigen Interaktionstest in einem eng verwandten biologischen Systems zu bestätigen. In dieser Studie wurden identifiziert die Bindungspartner der Effektor ATP_00189 aus dem nicht-kultivierbaren Pflanze Erreger Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Die Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen , die Symptomentwicklung von Apple proliferation zugrunde liegenden 28, eine Krankheit , die hohe wirtschaftliche Verluste in den betroffenen Apfelanbauregionen in Europa 29 verursacht.

<table><tbody><tr><td>Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Trishydroxymethylaminomethan (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>für Medien und</td></tr><tr><td>Puffer Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>für Medien und</td></tr><tr><td>Puffer Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>für Medien und Puffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>zur DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Korrekturlesen von Polymerase (z. B. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>für die Klonierung</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>für die Klonierung</td></tr><tr><td>Säulenbasiertes DNA-Aufreinigungskit (z. B. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>zur Klonierung</td></tr> von <tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>für die mikrobiologische Selektion,</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>für den Selbstaktivierungsassay</td></tr><tr><td>L-Arginin-Monohydrochlorid</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Isoleucin&nbsp;</td><td>Anwendung</td><td>A3642</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Lysin-Monohydrat&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Methionin&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Phenylalanin&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>für die Hefekultur</td></tr><tr><td>L-Threonin&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>für die Hefekultur</td></tr><tr><td>L-Tyrosin&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>L-Valin&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Adenin-Hemisulfatsalz&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>0,22 &Mikro; m Porenfilter</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>für die Sterilfiltration</td></tr><tr><td>L-Histidin Monohydrochlorid</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>L-Tryptophan&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>D-Glucose-Monohydrat&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>für die Hefekultur</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>für Hefe- und Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>für die Hefekultur</td></tr><tr><td>Polyethylen Glycol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>für die Hefeumwandlung</td></tr><tr><td>Lithiumacetatdihydrat (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>für die Hefetransformation</td></tr><tr><td>Lachs-Spermien-DNA&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>für die Hefetransformation</td></tr><tr><td>Antikörper gegen Lex-A-Tag (z.B. Anti-LexA DNA-Bindungsregion)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>für Western Blot</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit (z.B. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>für die Plasmidaufreinigung aus Hefe und Bakterien</td></tr><tr><td>Acid washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>für die Plasmidaufreinigung aus Hefe</td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>für die mikrobiologische Selektion</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>Vakuumkonzentratorzentrifuge (z.B. Concentrator 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>für die DNA-Präparation</td></tr><tr><td>Ködervektor (z.B. pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>für Y2H</td></tr><tr><td>Beutevektor (z.B. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>für Y2H</td></tr><tr><td>Control Beutevektor (z.B. pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>für Y2H</td></tr><tr><td>Control Bait Vector (z.B. pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>für Y2H</td></tr><tr><td>Elektrokompetente E. coli (z.B. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>zur Klonierung</td></tr> von <tr><td>Hefe-Reporterstamm (NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, z.B. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>für Y2H</td></tr><tr><td>Paraffinfolie aus Kunststoff (z.B. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>für Hefe- und Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Gasdurchlässige Versiegelung (z.B. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>für Hefekultur</td></tr><tr><td>PCR Cycler (z.B. T100 Thermal Cycler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>quantitative PCR Cycler (z.B. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>für quantitative</td></tr><tr><td>PCR Mikrozentrifuge (z.B. Centrifuge 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>allgemeine Laborausstattung</td></tr><tr><td>Zentrifuge (z.B. Zentrifuge 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser (DNAse-frei, RNAse-frei, Protease-frei)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>für PCR und DNA-Werke</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>für die DNA-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Sterilfilter (0,22 & Mikro; m; Polyethersulfon)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (Europäische Katalognummer)</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Petrischalen & Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Petrischalen & Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>Photometer (z.B. BioPhotometer)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>Photometer Küvetten</td><td>Brand</td><td>759015</td><td>für Hefekulturen</td></tr><tr><td>Wasserbad (z.B. Wasserbad Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>für die Hefetransformation</td></tr><tr><td>Western Blot Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>diverse</td><td>für den Proteinnachweis</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>für die Klonierung</td></tr> von <tr><td>Shaker (Erlenmeyer)-Kolben (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) und atmungsaktiven Wattestopfen (z.B. Duran Erlenmeyer Enghalskolben)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator (z.B. GFL 3031)GFL</td><td></td><td>3031</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Binder</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Ice Maker (z.B. Ice Maker IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>0,2 mL, 1,5 mL und 2,0 mL Reaktionsgefäße (Polypropylen)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Pipetten und Einweg-Pipettenspitzen (unterschiedliche Volumina: 10 - 1.000 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>diverse</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Vortex-Schüttler (z.B. MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>zum Klonieren</td></tr><tr><td>Kühlschrank (4 &deg; C) (z.B. Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Gefrierschrank (-20 &deg; C) (z.B. Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Messzylinder (z.B. Marke)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Allgemeine Laborausstattung</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten (z.B. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>für Hefe- und Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Mechanische Pipettette (z.B. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>allgemeine Laborausrüstung</td></tr><tr><td>Küvetten für die Elektroporation (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>für die Bakterientransformation</td></tr><tr><td>Elektroporator (z.B. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>für die Bakterientransformation</td></tr><tr><td>Gel- und Blot-Bildgebungssystem (z.B. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) (50 mL)</td><td>VWR-Deutschland&nbsp;</td><td>525-0403 (Europäische Katalognummer)</td><td>allgemeine Laborausrüstung</td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>allgemeine Laborgeräte</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>für die Ligation</td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat (ATP, z. B. ATP-Lösung (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G (vertrieben von Thermo Scientific)</td><td>für die Ligation</td></tr><tr><td>Dropout-Mix ohne Histidin, Leucin, Tryptophan und Adenin (DO, z. B. Hefe Synthetische Drop-out-Medium Supplements)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>für die Hefekultur (Fertigmischung)</td></tr></tbody></table>

die entwirrung der funktion eines bakteriellen effektor aus einem nicht-kultivierter pflanzenschädling eine hefe mit zwei-hybrid-screen

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Die Entwirrung der molekularen Mechanismen der Krankheitsmanifestationen ist wichtig, Pathologien und Symptomentwicklung in der Pflanzenwissenschaft zu verstehen. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt, ihre Wirts Stoffwechsel zu ihrem eigenen Vorteil zu manipulieren. Diese bakterielle Manipulation ist oft verbunden mit schweren Symptomentwicklung oder dem Tod der betroffenen Pflanzen. Die Bestimmung der spezifischen bakteriellen Moleküle verantwortlich für die Host-Manipulation ist ein wichtiger Bereich in der mikrobiologischen Forschung geworden. Nach der Identifizierung dieser Bakterien-Moleküle, die sogenannten &quot;Effektoren&quot;, ist es wichtig, ihre Funktion aufzuklären. Ein einfacher Ansatz die Funktion eines Effektor zu bestimmen, ist seine proteinösen Bindungspartner in seinem natürlichen Wirt über eine Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm zu identifizieren. Normalerweise birgt der Host zahlreiche potentielle Bindungspartner , die nicht ausreichend durch ein beliebiges in silico - Algorithmus vorhergesagt werden kann. Es ist daher die beste Wahl, um perform einen Bildschirm mit dem hypothetischen Effektor gegen eine ganze Bibliothek von exprimierten Wirtsproteine. Es ist besonders schwierig, wenn der Erreger wie phytoplasma kultivierbaren ist. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die DNA-Aufreinigung aus einem phytoplasma-infizierten holzig Wirtspflanze, die Verstärkung des potentiellen Effektor, und die anschließende Identifizierung der molekularen Interaktionspartner der Anlage mit einem Y2H Bildschirm. Obwohl Y2H Bildschirme häufig verwendet werden, gibt es einen Trend, diese Technik zu Biotech-Unternehmen auszulagern, die den Y2H Service zu einem Preis anbieten. Dieses Protokoll bietet Anweisungen, wie ein Y2H in jedem anständig ausgestatteten molekularbiologischen Labor unter Verwendung von Standardlabortechniken auszuführen.

Vor dem eigentlichen kann Y2H Bildschirm der Köder durchgeführt werden müssen für Selbstaktivierung getestet werden. Dies wird durch die Umwandlung der Köder Expressionsvektor zusammen mit dem leeren Beute Bibliothek Vektor und Überprüfung Wachstum auf selektiven Platten erreicht. Um zu analysieren , ob die phytoplasmal Protein ATP_00189 selbstaktivierende ist, wurde die Selbstaktivierung Test in Abschnitt 5. Der Köderplasmid ergänzt den trp und die Beute Plasmid , das das leu Auxotrophie von S. cerevisiae NMY51 40 wie beschrieben durchgeführt. Eine erfolgreiche Co-Transformation wird also durch Wachstum auf selektiven Platten fehlen trp und leu gekennzeichnet. Die Wechselwirkung des Köder und Beute-Protein führt zu einer Komplementierung der seine und ade Auxotrophie von NMY51. Wenn Selbstaktivierung durch den Köder in der Abwesenheit einer Wechselwirkung auftritt, wächst die Hefe auf selektiven Platten seiner und ade fehlt. Starke und schwache SelbstAktivierung auftreten. Starke Selbstaktivierung des Köders wird durch Wachstum des co-transformierte Hefe auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung führt zu Wachstum auf trp-leu-his aber nicht auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten. Die richtige positive Kontrollen sind unverzichtbar für die Ergebnisse der Selbstaktivierungstest zu interpretieren. Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse der Selbstaktivierungstest und deren Interpretation ist in Tabelle 1 und visualisiert in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel von Bait Selbstaktivierung Tests eines Bait Bevor ein Y2H Bildschirm durchführen. S. cerevisiae NMY51 wurde co-transformiert mit zusammenwirkenden Köder (pLEX-p53) und Beute (PACT larget) als eine positive Kontrolle (linkes Bild: ac), einem schwach selbstaktivierende plus eine leere Beute library - Vektor (Mitteltafel: df) und eine nicht selbstaktivierende Köder plus eine leere Beute Bibliothek Vektor (rechtes Bild: gi). Die Co-transformierten Hefe wurden auf SD - Platten fehlen trp und leu (oberes Bild: a, d, g), trp, leu und sein (Mitteltafel: b, e, h) und trp, leu, sein und ade (unterer Panel: c, f, i). Die Auswahl auf Medium ohne trp und leu ist eine positive Kontrolle für die erfolgreiche Co-Transformation, wie der Köder Vektor, der das trp Auxotrophie und die Beute Vektor der leu Auxotrophie von NMY51 (Wachstum auf SD-trp-leu) ergänzt. Im Falle einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute oder eine Selbstaktivierung des Köders wird der Reporterexpression von NMY51 eingeschaltet und ergänzt die His- und ade Auxotrophie (Wachstum auf SD-trp-leu-his-ADE). Ein schwaches Selbstaktivierung wird durch Wachstum auf SD-trp-leu-his - Platten (Mitteltafel, df) gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung eines Köders müssen für die Analyse der Köder vor vermindert werdenin einem Y2H Bildschirm, zum Beispiel durch Zugabe von 3-AT zur selektiven Medien. Aminosäure Depletionen sind angegeben mit &quot;-&quot; in den jeweiligen Mediennamen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> keiner </td><td> pGAD-HA </td><td> kein Wachstum </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td&gt; Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> PACT larget </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Erwartete Ergebnisse in einem Bait Selbstaktivierungstest. Die Transformation von S. cerevisiae NMY51 ergibt in Differential Wachstum auf Selektivmedien basierend auf den Eigenschaften von cotransformiert Köder und Beute. Wachstum auf selektiven Platten wurde bei 30 ° C nach der Transformation von verschiedenen Vektor-Kombinationen (af) nach 72 h Inkubation ausgewertet. Schwache Selbstaktivierung wird durch das Wachstum der Hefe auf SD-trp-leu-his und starke Selbstaktivierung durch Wachstum auf SD-trp-leu-his-ade Auswahl plat gekennzeichnetes in Abwesenheit eines Interaktionspartner. Die pLexA-N kodierten phytoplasmal Effektor ATP_00189 zeigt keine Selbstaktivierung, die durch die Unfähigkeit des Bait-Vektor gekennzeichnet ist NMY51 transformiert in Abwesenheit seines und ADE zu wachsen. Je nach dem Köder kann ein Y2H Bildschirm zahlreiche Hefe-Klone wachsen auf selektiven Platten gewinnen. Alle Klone müssen für mögliche Redundanzen analysiert und geprüft werden. Selbst wenn eine normalisierte cDNA-Bibliothek verwendet worden ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein Interaktors in vielen verschiedenen Klone repräsentiert wird. In Abhängigkeit von der Bibliothek Klonierungstechnik ist es auch möglich, daß nur Fragmente des vollständigen Gens in einigen Beutevektoren eingefügt werden. Es ist daher ratsam, die de novo verstärken (von cDNA) und subklonieren das Gen voller Länge des Interaktors und die Interaktion zu testen in einer Eins-zu-Eins - Y2H Analyse (Abbildung 2). <img alt = &quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2: Beispiel einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute in einem Y2H Experiment. Ein Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm wurde durchgeführt, und Plasmide, die aus positiven Interaktor Klone wurden gereinigt. Die Beute Vektor wurde sequenziert und die Host - Interaktionspartner Malus x domestica MdTCP24 und MdTCP25 wurden identifiziert. Als Negativkontrolle MdTCP34 (für die keine Interaktor in der Y2H Bibliothek Bildschirm identifiziert) wurde parallel subkloniert. Die volle Länge Gene wurden aus Apfel cDNA amplifiziert, subkloniert in dem Beute - Vektor (co-cistronically der Aktivierungsdomäne AD exprimierenden) und de novo co-transformiert mit dem Bait - Vektor des bakteriellen Effektor ATP_00189 an die DNA - Bindungsdomäne (BD) gekoppelt ausdrückt. Diese Zahl wird von 28 genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur.

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, virulente Strategien und Wirt-Pathogen-Systeme aufzuklären, indem die Interaktion eines Candidatus-Phytoplasma-Malefactor-Proteins mit Wirtproteinen aus Malus domestica identifiziert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in zahlreichen biologischen Forschungsbereichen zu beantworten und wird hier in der Pflanzenforschung eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Entstehung der Apfelvermehrungskrankheit zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ein einzelner Pathogen-Effektor gegen Tausende potenzieller Interaktionspartner getestet werden kann, wodurch dieses Verfahren einen leicht durchführbaren Ausgangspunkt in der Infektionsforschung darstellt.Beginnen Sie damit, infizierte Bäume mit spezifischen Symptomen der Apfelvermehrungskrankheit sowie Kontrollbäume ohne Symptome zu identifizieren. Schneiden Sie mithilfe sauberer Gartenscheren Wurzelproben von drei verschiedenen Stellen des Wurzelsystems ab, die einen Durchmesser von 0,5–1 cm und eine Länge von etwa 5 cm aufweisen. Legen Sie die Wurzelproben in ausreichend beschriftete Plastiktüten.Legen Sie die Proben anschließend in eine Kühlbox mit gekühlten Kälteakkus und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie weiterverarbeitet werden. Spülen Sie die Wurzelproben mit Wasser ab, um den Boden zu entfernen. Überführen Sie die Proben danach in eine sterile Petrischale und entfernen Sie mithilfe eines sterilisierten Skalpells die Wurelpidermis und die Rinde.Mit einem sauberen, fusselfreien Tuch den Skalpell abwischen. Anschließend das Instrument in 70 % Ethanol eintauchen und über einer offenen Flamme hitzesterilisieren. Mit dem Skalpell das Phloem anritzen.Zerkleinern Sie die Probe in kleine Stücke und portionieren Sie 30–100 Milligramm der Stücke in ein steriles zwei-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius oder verwenden Sie sie unmittelbar zur Isolierung von DNA, die als Vorlage für die Amplifikation von Effektorgenen und die anschließende Klonierung des Effektors in den Bait-Vektor dient. Nach der Isolierung von phytoplasmatischer polyspezifischer DNA aus infizierten Bäumen, der Klonierung in Bait-Vektoren und der Überprüfung auf Selbstaktivierung und Expression gemäß dem Textprotokoll.Stricheln Sie den mit plex A ATP 00189 Effektor transformierten Stamm NMY51 auf eine frische SD-trp-Platte und kultivieren Sie ihn bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage, bis rote Kolonien erscheinen. Verwenden Sie eine rote Kolonie von der Agarplatte, um drei Milliliter SD-trp-Medium in einem kleinen Schüttelkolben anzusetzen, und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 120–150 Umdrehungen pro Minute. Am folgenden Tag setzen Sie mit einem Milliliter der Übernachtkultur 20 Milliliter SD-trp in einem Schüttelkolben an und lassen sie acht Stunden lang wachsen.Verwenden Sie SD-trp-Medium, um die Kultur auf einen OD600 von 0,2 einzustellen, und impfen Sie mit zehn Millilitern der Kultur zwei Kolben an, die jeweils 100 Milliliter SD-trp-Medium enthalten. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Messen Sie anschließend den OD600 der Kultur und pelletieren Sie 120 OD600-Einheiten.Beispielsweise, wenn ein OD600 von 1,2 gemessen wird, zentrifugieren Sie 100 Milliliter der Probe, entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 800 Milliliter vorgewärmtes 2xYPAD, um den Pellet in zwei Schüttelkolben erneut aufzuschwemmen, und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Hefekultur bei 30 Grad Celsius und 120–150 Umdrehungen pro Minute. Messen Sie das OD600 entsprechend dem Textprotokoll etwa alle 1,5 Stunden, bis ein OD600 von 0,6 erreicht ist.Nach der Herstellung von Lachssperma-DNA, Te Lithium-OAc und PEG Lithium-OAc gemäß dem Textprotokoll werden 800 Milliliter Hefe-Kultur bei 700 × g fünf Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets insgesamt in 200 Milliliter steriler, doppelt destillierter Wasser. Anschließend werden die Zellen erneut pelletiert und der Überstand verworfen.Suspendieren Sie das Pellet in 16 Milliliter Te-Lithium-OAc-Mix und zentrifugieren Sie die Probe erneut. Danach, nach dem Entsorgen des Überstandes, verwenden Sie 9,6 Milliliter Te-Lithium-OAc, um das Pellet erneut zu suspendieren. Bereiten Sie in geeigneten Reaktionsgefäßen zwölf Vials mit jeweils sieben Mikrogramm peak-Add-HAC-DNA-Bibliotheksvektor, 100 Mikroliter 2 % Heringssperma-DNA und 2,5 Milliliter PEG-Lithium-OAc-Mix vor.Geben Sie 600 Mikroliter der zuvor hergestellten Hefezellsuspension in jedes der zwölf Gefäße und mischen Sie kräftig für eine Minute. Inkubieren Sie anschließend die Ansätze für 45 Minuten in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius, wobei alle 15 Minuten nachgemischt wird. Fügen Sie danach 160 Mikroliter DMSO zu jedem Gefäß hinzu und mischen Sie erneut kräftig.Anschließend die Vials 20 Minuten zusätzlich bei 42 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Pellettieren der Zellen den Überstand verwerfen und jedes Pellet mit drei Milliliter 2xYPAD resuspendieren. Die Zellen aus allen zwölf Vials in einem 100-Milliliter-Schüttelkolben sammeln und die Hefe 90 Minuten bei 30 Grad Celsius und 120 Umdrehungen pro Minute inkubieren.Nach der Inkubation, nachdem die Zellen pellettiert und der Überstand verworfen wurde, das Pellet mit einer 10-mL-Serologiepipette und 4,5 mL steriler 0,9 % Natriumchlorid-Lösung vorsichtig mehrmals auf- und abpipettierend gründlich resuspendieren. 50 Mikroliter der Suspension entnehmen und mit 0,9 % Natriumchlorid-Lösung zehnfache Verdünnungen von 1:10 bis 1:1000 herstellen. Anschließend jeweils 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf 90-mm-Petri-Schalen mit SD-trp-leu-Agar aufplattieren.Verteilen Sie die restliche unverdünnte Hefesuspension auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 16x150 Millimetern, die mit SD-trp-leu-His-ade-Agar befüllt sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius drei Tage lang für die SD-trp-leu-Platten und vier Tage lang für die SD-trp-leu-his-ade-Platten. Bestimmen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Kolonien der verschiedenen seriellen Verdünnungen auf den SD-trp-leu-Auswahlplatten zählen.Übertragen Sie jeden Klon, indem Sie mit einer sterilen Pipettenspitze die Kolonie auf frische SD-trp-leu-his-ade Selektivplatten aufstreichen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 24 Stunden. Wiederholen Sie das Übertragen der Klone jeden Tag, bis insgesamt fünf Passagen erreicht sind.Zur Analyse der Klone bereiten Sie unter einer sterilen Haube für jeden Klon ein steriles zwei Milliliter Reaktionsröhrchen mit einem Milliliter SD-trp-leu-his-ade vor. Stanzen Sie mit einer heißen Nadel ein Loch in jedes Röhrchen und verschließen Sie das Loch mit einem gasdurchlässigen Verschluss. Inokulieren Sie jedes Röhrchen mit frischem Kolonie-Material von einem Klon und inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute für 24 Stunden.Nachdem die Zellen pelletiert und der Überstand verworfen wurde, das Pellet in dem geeigneten Puffer resuspendieren und in ein frisches zwei-Milliliter-Reaktionsröhrchen überführen. 100 Mikroliter säuregewaschene Glaskügelchen zur Suspension hinzufügen und das Röhrchen fünf Minuten lang kräftig mischen. Abschließend die Plasmid-DNA gemäß dem Textprotokoll reinigen.Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungsassays und deren Interpretation wird in dieser Tabelle und Abbildung bereitgestellt. Eine schwache Selbstaktivierung führt zum Wachstum auf trp-leu-his-, jedoch nicht auf trp-leu-his-ade-depletierten Selektionsplatten. Hefe hingegen, die mit einem stark selbstaktivierenden Köder transformiert wurde, würde auf Medium fehlend trp-leu-his-ade wachsen.Eine erfolgreiche Cotransformation von Bait und Prey zeichnet sich durch Wachstum auf selektiven Platten aus, die trp und leu fehlen. Die Interaktion zwischen dem Bait und einem Prey-Protein führt zur Komplementierung der his- und ade-Oxytrophiestämme von NMY51. Dargestellt ist hier ein Beispiel einer Interaktion zwischen Bait und Prey in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Experiment. Die Malus domestica Wirt-Interaktionspartner, MdTCP24 und MdTCP25, wurden identifiziert, und die Interaktion wurde durch de-novo-Kontransformation mit dem Effektor bestätigt.Wenn die Hefe-Zwei-Hybrid-Methode einmal beherrscht ist, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, vorausgesetzt, sämtliche erforderliche Ausrüstung und Materialien, insbesondere die Hefe, sind im Voraus ordnungsgemäß vorbereitet. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontaminationen zu vermeiden und stets unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Nach Abschluss dieses Verfahrens muss eine weitere unabhängige Methode durchgeführt werden, beispielsweise die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation, um die gefundenen Protein-Protein-Interaktionen zu bestätigen.Dies ist besonders wichtig, da die Hefe oder der Hybrid an sich relativ anfällig für die Erzeugung von falsch-positiven Ergebnissen ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in zahlreichen verschiedenen Forschungsbereichen den Weg, um die molekularen Grundlagen von Protein-Protein-Interaktionen – insbesondere bei Wirt-Pathogen-Interaktionen – sowie viele andere biologische Forschungsgebiete besser zu verstehen. Darüber hinaus werden Sie erkennen, dass die Durchführung dieser Methode in jedem angemessen ausgestatteten Labor für Molekularbiologie leicht realisierbar ist.Beachten Sie, dass das Arbeiten mit bestimmten Chemikalien, Skalpellen und offenen Flammen äußerst gefährlich sein kann. Daher müssen bei der Durchführung dieses Verfahrens stets bestimmte Vorsichtsmaßnahmen berücksichtigt werden. Das bedeutet, dass Sie Ihre persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille verwenden und die allgemeinen Sicherheitseinrichtungen im Labor nutzen müssen.

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Erfahren Sie, wie Sie Proteininteraktionen eines bakteriellen Effektors mit Malus domestica mittels Yeast-Two-Hybrid-Screen identifizieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Apfeltriebsucht.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen (Video) | JoVE Journal

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Weitere Videos entdecken