Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, virulente Strategien und Wirtserregersysteme zu entschlüsseln, indem die Interaktion eines Candidatus-Phytoplasma-Malefaktor-Proteins mit Wirtsproteinen aus dem Malus domestica identifiziert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in vielen verschiedenen biologischen Forschungsbereichen zu beantworten, und wird hier in der Pflanzenforschung eingesetzt, um molekulare Mechanismen aufzuklären, die der Entstehung der Apfelproliferationskrankheit zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein einzelner Erregereffektor gegen Tausende von potenziellen Interaktoren gescreent werden kann, was diese Methode zu einem leicht praktikablen Ausgangspunkt in der Infektionsforschung macht.

Identifizieren Sie zunächst infizierte Bäume mit Apfelproliferations-spezifischen Symptomen und kontrollieren Sie Bäume, die symptomfrei sind. Schneiden Sie mit einer sauberen Gartenschere Wurzelproben von drei verschiedenen Stellen des Wurzelsystems ab, die einen Durchmesser von 0,5 1 cm und eine Länge von etwa 5 cm haben. Geben Sie die Wurzelproben in ausreichend gekennzeichnete Plastiktüten.

Anschließend werden die Proben in eine Cold-Box mit gekühlten Thermopackungen gegeben und bis zur Weiterverarbeitung bei vier Grad Celsius gelagert. Spülen Sie die Wurzelproben mit Wasser ab, um die Erde zu entfernen. Geben Sie dann die Proben in eine sterile Petrischale und entfernen Sie mit einem sterilisierten Skalpell die Wurzelepidermis und die Rinde.

Wischen Sie das Skalpell mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab. Tauchen Sie das Instrument dann in 70%iges Ethanol und sterilisieren Sie es über offener Flamme. Benutze das Skalpell, um das Phloem zu kratzen.

Die Probe wird in kleine Stücke geschnitten und 30-100 Milligramm der Stücke in ein steriles Reaktionsröhrchen von zwei Millilitern aliquotiert. Lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius oder verwenden Sie sie sofort zur Isolierung von DNA, die als Vorlage für die Effektorgenamplifikation und die anschließende Klonierung des Effektors in den Ködervektor dient. Nach der Isolierung von polyspezifischer Phytoplasma-DNA aus infizierten Bäumen wurde sie in Ködervektoren kloniert und auf Selbstaktivierung und Expression gemäß dem Textprotokoll getestet.

Streak plex Ein ATP 00189-Effektor transformierte NMY51 auf eine frische SD-trp-Platte und kultivierte es zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius, bis rote Kolonien entstehen. Verwenden Sie eine rote Kolonie von der Agarplatte, um drei Milliliter SD-trp-Medium in einem kleinen Schüttelkolben zu inokulieren und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und Schütteln bei 120-150 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Tag mit einem Milliliter der Nachtkultur 20 Milliliter SD-trp in einen Schüttelkolben impfen und acht Stunden wachsen lassen.

Verwenden Sie das SD-trp-Medium, um die Kultur auf einen OD600-Wert von 0,2 einzustellen, und inokulieren Sie mit zehn Millilitern der Kultur zwei Kolben mit je 100 Millilitern SD-trp-Medium. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius unter Schütteln über Nacht. Messen Sie als Nächstes den OD600 der Kultur und pelletieren Sie 120 OD600-Einheiten.

Wenn beispielsweise ein OD600 von 1,2 gemessen wird, schleudern Sie 100 Milliliter Probe herunter, verwerfen Sie den Überstand und verwenden Sie 800 Milliliter vorgewärmtes 2xYPAD, um das Pellet in zwei Shaker-Flaschen zu resuspendieren und bei 30 Grad Celsius zu inkubieren. Inkubieren Sie die Hefekultur bei 30 Grad Celsius und 120-150 Umdrehungen pro Minute. Messen Sie den OD600 etwa alle 1,5 Stunden gemäß dem Textprotokoll, bis ein OD600 von 0,6 erreicht ist.

Nach der Aufbereitung der Lachsspermien-DNA, Te Lithium OAc und PEG Lithium OAc gemäß dem Textprotokoll zentrifugieren Sie 800 Milliliter Hefekultur bei 700 x G für fünf Minuten, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in insgesamt 200 Millilitern sterilem doppelt destilliertem Wasser. Pelletieren Sie dann die Zellen wieder und entsorgen Sie den Überstand.

Das Pellet wird in 16 Milliliter Te Lithium OAc-Mischung resuspendiert und die Probe erneut heruntergeschleudert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie 9,6 Milliliter Te Lithium OAc, um das Pellet wieder zu suspendieren. Bereiten Sie in entsprechend großen Reaktionsgefäßen zwölf Fläschchen mit sieben Mikrogramm Peak-Vektor der Add HAC-DNA-Bibliothek, 100 Mikrolitern 2 % Lachsspermien-DNA und 2,5 Millilitern PEG-Lithium-OAc-Mischung vor.

Geben Sie 600 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Hefezellsuspension in jedes der zwölf Fläschchen und mischen Sie es eine Minute lang kräftig. Dann inkubieren Sie die Reaktionen in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius für 45 Minuten und mischen alle 15 Minuten. Geben Sie anschließend 160 Mikroliter DMSO in jedes Fläschchen und mischen Sie kräftig.

Dann inkubieren Sie die Fläschchen weitere 20 Minuten bei 42 Grad Celsius. Nach dem Pelletieren der Zellen wird der Überstand entsorgt und jedes Pellet mit drei Millilitern 2xYPAD resuspendiert. Poolen Sie die Zellen aus allen zwölf Fläschchen in einem 100-Milliliter-Shaker-Kolben und inkubieren Sie die Hefe 90 Minuten lang bei 30 Grad Celsius und 120 Umdrehungen pro Minute.

Nach der Inkubation, nachdem Sie die Zellen pelletiert und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie eine serologische Pipette von zehn Millilitern und 4,5 Milliliter steriles 0,9%iges Natriumchlorid, um das Pellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich zu resuspendieren. Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Suspension und verwenden Sie 0,9% Natriumchlorid, um zehnfache Verdünnungen von 1:10 bis 1:1000 herzustellen. Dann werden 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf 90-Millimeter-Petrischalen mit SD-trp-Leu-Agar aufgetragen

Den Rest der unverdünnten Hefesuspension auf Petrischalen mit 16x150 Millimeter Durchmesser mit SD-trp-leu-His-ade-Agar verteilen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für drei Tage für die SD-trp-leu-Platten und für vier Tage für die SD-trp-leu-his-ade-Platten. Bestimmen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Kolonien der verschiedenen seriellen Verdünnungen auf den SD-trp-leu-Selektionsplatten zählen.

Übertragen Sie jeden Klon mit einer sterilen Pipettenspitze, um die Kolonie aufzunehmen und auf frische SD-trp-leu-his-ade-Selektivplatten zu streichen. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Übertragung der Klone jeden Tag, bis insgesamt fünf Passagen erreicht sind.

Um Klone zu analysieren, bereiten Sie unter einer sterilen Haube ein steriles Reaktionsröhrchen mit zwei Millilitern und einem Milliliter SD-trp-leu-his-ade für jeden Klon vor. Stanzen Sie mit einer heißen Nadel ein Loch in jedes Rohr und verwenden Sie eine gasdurchlässige Versiegelung, um das Loch abzudecken. Beimpfen Sie jedes Fläschchen mit frischem Koloniematerial von einem Klon und inkubieren Sie die Fläschchen 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute.

Nach dem Pelletieren der Zellen und dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in den entsprechenden Puffer zurückversetzt und in ein frisches Reaktionsröhrchen von zwei Millilitern überführt. Geben Sie 100 Mikroliter säuregewaschene Glasperlen in die Suspension und mischen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang kräftig. Zum Schluss reinigen Sie die Plasmid-DNA gemäß dem Textprotokoll.

Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungsassays und ihrer Interpretation ist in dieser Tabelle und Abbildung enthalten. Eine schwache Selbstaktivierung führt zu Wachstum auf trp-leu-his, aber nicht auf trp-leu-his-ade depletierten Selektionsplatten. Während die mit einem starken, selbstaktivierenden Köder umgewandelte Hefe auf trp-leu-his-ade ohne Medium wachsen würde.

Eine erfolgreiche Kotransformation von Köder und Beute ist gekennzeichnet durch Wachstum auf selektiven Platten, denen trp und leu fehlen. Die Interaktion des Köders und eines Beuteproteins führt zu einer Komplementation der his und ade oxytrophie von NMY51 Hier ist ein Beispiel für eine Interaktion zwischen Köder und Beute in einem Hefe 2 Hybrid Experiment. Die Interaktionspartner des Malus-domestica-Wirts, MdTCP24 und MdTCP25, wurden identifiziert und die Interaktion wurde durch Denovo-Kegeltransformation mit dem Effektor bestätigt.

Einmal gemeistert, kann die Hefe 2 Hybride an einem Tag durchgeführt werden, wenn alle notwendigen Geräte und Materialien, insbesondere die Hefe, im Voraus richtig vorbereitet werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Kontamination zu vermeiden und immer unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Im Anschluss an dieses Verfahren muss eine weitere unabhängige Methode, wie z.B. die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung, durchgeführt werden, um die gefundenen Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen.

Dies ist besonders wichtig, da die Hefe oder der Hybrid per se relativ anfällig für falsch positive Ergebnisse ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in vielen verschiedenen Forschungsbereichen, um die molekularen Prinzipien besser zu verstehen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen beinhalten, insbesondere bei Wirt-Pathogen-Interaktionen, und vielen anderen biologischen Forschungsbereichen. Darüber hinaus werden Sie verstehen, dass die Durchführung dieser Methode in jedem anständig ausgestatteten molekularbiologischen Labor problemlos durchführbar ist.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bestimmten Chemikalien, Skalpellen und offenen Flammen äußerst gefährlich sein kann, daher müssen Sie bei diesem Verfahren immer bestimmte Vorsichtsmaßnahmen berücksichtigen. Das bedeutet, dass Sie Ihre persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille verwenden und die allgemeine Laborsicherheitsausrüstung verwenden.