Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, virulente Strategien und Wirt-Pathogen-Systeme aufzuklären, indem die Interaktion eines Candidatus-Phytoplasma-Malefactor-Proteins mit Wirtproteinen aus Malus domestica identifiziert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in zahlreichen biologischen Forschungsbereichen zu beantworten und wird hier in der Pflanzenforschung eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Entstehung der Apfelvermehrungskrankheit zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ein einzelner Pathogen-Effektor gegen Tausende potenzieller Interaktionspartner getestet werden kann, wodurch dieses Verfahren einen leicht durchführbaren Ausgangspunkt in der Infektionsforschung darstellt.

Beginnen Sie damit, infizierte Bäume mit spezifischen Symptomen der Apfelvermehrungskrankheit sowie Kontrollbäume ohne Symptome zu identifizieren. Schneiden Sie mithilfe sauberer Gartenscheren Wurzelproben von drei verschiedenen Stellen des Wurzelsystems ab, die einen Durchmesser von 0,5–1 cm und eine Länge von etwa 5 cm aufweisen. Legen Sie die Wurzelproben in ausreichend beschriftete Plastiktüten.

Legen Sie die Proben anschließend in eine Kühlbox mit gekühlten Kälteakkus und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie weiterverarbeitet werden. Spülen Sie die Wurzelproben mit Wasser ab, um den Boden zu entfernen. Überführen Sie die Proben danach in eine sterile Petrischale und entfernen Sie mithilfe eines sterilisierten Skalpells die Wurelpidermis und die Rinde.

Mit einem sauberen, fusselfreien Tuch den Skalpell abwischen. Anschließend das Instrument in 70 % Ethanol eintauchen und über einer offenen Flamme hitzesterilisieren. Mit dem Skalpell das Phloem anritzen.

Zerkleinern Sie die Probe in kleine Stücke und portionieren Sie 30–100 Milligramm der Stücke in ein steriles zwei-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius oder verwenden Sie sie unmittelbar zur Isolierung von DNA, die als Vorlage für die Amplifikation von Effektorgenen und die anschließende Klonierung des Effektors in den Bait-Vektor dient. Nach der Isolierung von phytoplasmatischer polyspezifischer DNA aus infizierten Bäumen, der Klonierung in Bait-Vektoren und der Überprüfung auf Selbstaktivierung und Expression gemäß dem Textprotokoll.

Stricheln Sie den mit plex A ATP 00189 Effektor transformierten Stamm NMY51 auf eine frische SD-trp-Platte und kultivieren Sie ihn bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage, bis rote Kolonien erscheinen. Verwenden Sie eine rote Kolonie von der Agarplatte, um drei Milliliter SD-trp-Medium in einem kleinen Schüttelkolben anzusetzen, und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 120–150 Umdrehungen pro Minute. Am folgenden Tag setzen Sie mit einem Milliliter der Übernachtkultur 20 Milliliter SD-trp in einem Schüttelkolben an und lassen sie acht Stunden lang wachsen.

Verwenden Sie SD-trp-Medium, um die Kultur auf einen OD600 von 0,2 einzustellen, und impfen Sie mit zehn Millilitern der Kultur zwei Kolben an, die jeweils 100 Milliliter SD-trp-Medium enthalten. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Messen Sie anschließend den OD600 der Kultur und pelletieren Sie 120 OD600-Einheiten.

Beispielsweise, wenn ein OD600 von 1,2 gemessen wird, zentrifugieren Sie 100 Milliliter der Probe, entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 800 Milliliter vorgewärmtes 2xYPAD, um den Pellet in zwei Schüttelkolben erneut aufzuschwemmen, und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Hefekultur bei 30 Grad Celsius und 120–150 Umdrehungen pro Minute. Messen Sie das OD600 entsprechend dem Textprotokoll etwa alle 1,5 Stunden, bis ein OD600 von 0,6 erreicht ist.

Nach der Herstellung von Lachssperma-DNA, Te Lithium-OAc und PEG Lithium-OAc gemäß dem Textprotokoll werden 800 Milliliter Hefe-Kultur bei 700 × g fünf Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets insgesamt in 200 Milliliter steriler, doppelt destillierter Wasser. Anschließend werden die Zellen erneut pelletiert und der Überstand verworfen.

Suspendieren Sie das Pellet in 16 Milliliter Te-Lithium-OAc-Mix und zentrifugieren Sie die Probe erneut. Danach, nach dem Entsorgen des Überstandes, verwenden Sie 9,6 Milliliter Te-Lithium-OAc, um das Pellet erneut zu suspendieren. Bereiten Sie in geeigneten Reaktionsgefäßen zwölf Vials mit jeweils sieben Mikrogramm peak-Add-HAC-DNA-Bibliotheksvektor, 100 Mikroliter 2 % Heringssperma-DNA und 2,5 Milliliter PEG-Lithium-OAc-Mix vor.

Geben Sie 600 Mikroliter der zuvor hergestellten Hefezellsuspension in jedes der zwölf Gefäße und mischen Sie kräftig für eine Minute. Inkubieren Sie anschließend die Ansätze für 45 Minuten in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius, wobei alle 15 Minuten nachgemischt wird. Fügen Sie danach 160 Mikroliter DMSO zu jedem Gefäß hinzu und mischen Sie erneut kräftig.

Anschließend die Vials 20 Minuten zusätzlich bei 42 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Pellettieren der Zellen den Überstand verwerfen und jedes Pellet mit drei Milliliter 2xYPAD resuspendieren. Die Zellen aus allen zwölf Vials in einem 100-Milliliter-Schüttelkolben sammeln und die Hefe 90 Minuten bei 30 Grad Celsius und 120 Umdrehungen pro Minute inkubieren.

Nach der Inkubation, nachdem die Zellen pellettiert und der Überstand verworfen wurde, das Pellet mit einer 10-mL-Serologiepipette und 4,5 mL steriler 0,9 % Natriumchlorid-Lösung vorsichtig mehrmals auf- und abpipettierend gründlich resuspendieren. 50 Mikroliter der Suspension entnehmen und mit 0,9 % Natriumchlorid-Lösung zehnfache Verdünnungen von 1:10 bis 1:1000 herstellen. Anschließend jeweils 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf 90-mm-Petri-Schalen mit SD-trp-leu-Agar aufplattieren.

Verteilen Sie die restliche unverdünnte Hefesuspension auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 16x150 Millimetern, die mit SD-trp-leu-His-ade-Agar befüllt sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius drei Tage lang für die SD-trp-leu-Platten und vier Tage lang für die SD-trp-leu-his-ade-Platten. Bestimmen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Kolonien der verschiedenen seriellen Verdünnungen auf den SD-trp-leu-Auswahlplatten zählen.

Übertragen Sie jeden Klon, indem Sie mit einer sterilen Pipettenspitze die Kolonie auf frische SD-trp-leu-his-ade Selektivplatten aufstreichen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 24 Stunden. Wiederholen Sie das Übertragen der Klone jeden Tag, bis insgesamt fünf Passagen erreicht sind.

Zur Analyse der Klone bereiten Sie unter einer sterilen Haube für jeden Klon ein steriles zwei Milliliter Reaktionsröhrchen mit einem Milliliter SD-trp-leu-his-ade vor. Stanzen Sie mit einer heißen Nadel ein Loch in jedes Röhrchen und verschließen Sie das Loch mit einem gasdurchlässigen Verschluss. Inokulieren Sie jedes Röhrchen mit frischem Kolonie-Material von einem Klon und inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute für 24 Stunden.

Nachdem die Zellen pelletiert und der Überstand verworfen wurde, das Pellet in dem geeigneten Puffer resuspendieren und in ein frisches zwei-Milliliter-Reaktionsröhrchen überführen. 100 Mikroliter säuregewaschene Glaskügelchen zur Suspension hinzufügen und das Röhrchen fünf Minuten lang kräftig mischen. Abschließend die Plasmid-DNA gemäß dem Textprotokoll reinigen.

Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungsassays und deren Interpretation wird in dieser Tabelle und Abbildung bereitgestellt. Eine schwache Selbstaktivierung führt zum Wachstum auf trp-leu-his-, jedoch nicht auf trp-leu-his-ade-depletierten Selektionsplatten. Hefe hingegen, die mit einem stark selbstaktivierenden Köder transformiert wurde, würde auf Medium fehlend trp-leu-his-ade wachsen.

Eine erfolgreiche Cotransformation von Bait und Prey zeichnet sich durch Wachstum auf selektiven Platten aus, die trp und leu fehlen. Die Interaktion zwischen dem Bait und einem Prey-Protein führt zur Komplementierung der his- und ade-Oxytrophiestämme von NMY51. Dargestellt ist hier ein Beispiel einer Interaktion zwischen Bait und Prey in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Experiment. Die Malus domestica Wirt-Interaktionspartner, MdTCP24 und MdTCP25, wurden identifiziert, und die Interaktion wurde durch de-novo-Kontransformation mit dem Effektor bestätigt.

Wenn die Hefe-Zwei-Hybrid-Methode einmal beherrscht ist, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, vorausgesetzt, sämtliche erforderliche Ausrüstung und Materialien, insbesondere die Hefe, sind im Voraus ordnungsgemäß vorbereitet. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontaminationen zu vermeiden und stets unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Nach Abschluss dieses Verfahrens muss eine weitere unabhängige Methode durchgeführt werden, beispielsweise die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation, um die gefundenen Protein-Protein-Interaktionen zu bestätigen.

Dies ist besonders wichtig, da die Hefe oder der Hybrid an sich relativ anfällig für die Erzeugung von falsch-positiven Ergebnissen ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in zahlreichen verschiedenen Forschungsbereichen den Weg, um die molekularen Grundlagen von Protein-Protein-Interaktionen – insbesondere bei Wirt-Pathogen-Interaktionen – sowie viele andere biologische Forschungsgebiete besser zu verstehen. Darüber hinaus werden Sie erkennen, dass die Durchführung dieser Methode in jedem angemessen ausgestatteten Labor für Molekularbiologie leicht realisierbar ist.

Beachten Sie, dass das Arbeiten mit bestimmten Chemikalien, Skalpellen und offenen Flammen äußerst gefährlich sein kann. Daher müssen bei der Durchführung dieses Verfahrens stets bestimmte Vorsichtsmaßnahmen berücksichtigt werden. Das bedeutet, dass Sie Ihre persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille verwenden und die allgemeinen Sicherheitseinrichtungen im Labor nutzen müssen.