Name: Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von 1,2-Azaborinen und die Herstellung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym-Mutanten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige borhaltige Benzolisostere für biomedizinische Anwendungen.

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Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) und dem Boston College unterstützt.

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</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie an diesem Manuskript keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Im ersten Teil dieses Protokolls, beschrieben wir eine modifizierte Synthese von 1,2-azaborines basierend auf zuvor beschriebenen Verfahren 12, 13. Triallylborane 22 wurde als Ersatz für die Strecken verwendet allyltriphenyl Zinn oder Kalium allyltrifluoroborate Verwendung zur Herstellung von N -allyl- N -TBS- B allyl Chlorid - Addukt (1). Diese Methode ermöglicht eine atomökonomische und umwelt...

Bor-Stickstoff - haltige Heterocyclen (dh 1,2-azaborines) wurden kürzlich große Aufmerksamkeit als Isostere von Arene gezogen. Diese Isosterie kann zur Diversifizierung der bestehenden Strukturmotive führen die chemischen Raum 2, 3, 4 zu erweitern. Azaborines haben potentielle Brauchbarkeit für die Anwendung in der biomedizinischen Forschung 5, 6, 7, 8, vor allem im Bereich der medizinischen Chemie in denen Chemiker strukturell Synthese von Bibliotheken durchzuführen und funktionell relevante Moleküle. Bezeichnenderweise jedoch während zahlreiche gut entwickelte Synthesewege zur Verfügung Aren enthaltenden Molekülen gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Verfahren für die Synthese von azaborines 9 gemeldet wurden, 10, </sbis&gt; 11, 12, 13. Dies ist vor allem auf eine begrenzte Anzahl von Optionen für die Bor-Quelle und die luft- und feuchtigkeitsempfindlichen Natur des Moleküls in der frühen Phase der Synthesesequenz. Im ersten Teil dieses Artikels, werden wir eine Multi-Gramm - Maßstab Synthese von N -TBS- B -Cl-1,2-Azaborins (3) unter Verwendung von Standardluftfreien Techniken beschreiben. Diese Verbindung dient als vielseitiges Zwischenprodukt , das weiter funktionalisiert werden kann 14 bis strukturell komplexeren Molekülen, 15. Ausgehend von 3, die Synthese und Reinigung von N -H- B -ethyl-1,2-Azaborins (5) zur Verwendung in Protein - Bindungsstudien beschrieben. Aufgrund der Volatilität von 5, erfordert die effiziente Isolierung eine präzise Steuerung der Reaktionstemperatur, Zeit und distillation Bedingungen. Im zweiten Teil, Protokolle für die Proteinexpression und Isolierung von T4 - Lysozym - Mutanten (L99A und L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 wird durch die Proteinkristallisation und Herstellung von Protein-Ligand - Kristallkomplexe dargestellt werden, gefolgt. T4 - Lysozym - Mutanten L99A und L99A / M102Q wurden als biologische Modellsysteme ausgewählt , um die Wasserstoffbindungsfähigkeit von NH enthält Azaborins Moleküle 17 zu untersuchen. Mit einem Standard - Molekularbiologie - Protokoll wird das Protein in Escherichia coli RR1 - Stamm exprimiert und induziert mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Proteinreinigung wird Ionenaustausch-Säulenchromatographie durchgeführt werden. Protein Kristallisation wird mit hochkonzentrierten gereinigte Proteinlösung (&gt; 95% Reinheit durch Gelelektrophorese) durchgeführt unter Verwendung des HängeDrop Dampfdiffusionsverfahren. Wegen der Empfindlichkeit dieser Studie Liganden an Sauerstoff, die Protein-Ligand-Komplexe werden unter luftfreien Bedingungen hergestellt.

<table><tbody><tr><td>Tetrahydrofuran (THF), inhibitorfrei, für HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether (Et2O), für HPLC, &ge; 99,9%, inhibitorfreies</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Methylenchlorid&nbsp; (CH2Cl2), (Stabilisiert/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentan, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Calciumhydrid (CaH2), Reagenzqualität, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Pyrophores</td></tr><tr><td>Palladium auf Aktivkohle (Pd/C), 10 Gew.-% Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Bortrichloridlösung in Hexan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Hochgiftiges/pyrophores</td></tr><tr><td>Triethylamin, &ge; 99,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st Katalysator der Generation&nbsp;</td><td>Materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, wasserfrei, 99,8 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>Ethyllithiumlösung, 0,5&nbsp; M in Benzol/Cyclohexan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td><td>Hochgiftige/ pyrophore</td></tr><tr><td>HCl-Lösung, 2,0 M in Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan, wasserfrei, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani und Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4-Lysozym WT* (L99A)</td><td>Addgen</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4-Lysozymmutante (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgen</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl-&beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch wasserfrei</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisch wasserfrei</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Korrosiv</td></tr><tr><td>Thermowissenschaftliches Pierce DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Sepharose Fast Flow Kationenaustausch Medien</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentratoren</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethyldisulfid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-Paraton&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Dialyse-Membranschläuche 12.000 bis 14.000 Dalton MWCO</td><td>Fischer</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>Kryoschläuche in Form einer Schlaufe</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Kryozange</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Elektronendichtebilder werden von der Software generiert</td></tr></tbody></table>

synthese von 1,2-azaborines und die vorbereitung ihrer proteinkomplexe mit t4-lysozym mutants

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Wir beschreiben eine allgemeine Synthese von 1,2-Azaborinen unter Verwendung von luftfreien Standardtechniken und Proteinkomplexpräparation mit T4-Lysozym-Mutanten durch Dampfdiffusion. Sauerstoff- und feuchtigkeitsempfindliche Verbindungen werden unter inerter Atmosphäre (N2) entweder mit einem Vakuumgasverteiler oder einer Glovebox aufbereitet und isoliert. Als Beispiel für die Azaborinsynthese demonstrieren wir die Synthese und Reinigung des flüchtigen N-H-B-ethyl-1,2-azaborin durch eine fünfstufige Sequenz mit Destillation und Säulenchromatographie zur Isolierung von Produkten. Die T4-Lysozym-Mutanten L99A und L99A/M102Q werden mit dem Escherichia coli RR1-Stamm exprimiert. Standardprotokolle für die chemische Zelllyse, gefolgt von einer Reinigung unter Verwendung einer Carboxymethyl-Ionenaustauschsäule, ermöglichen ein Protein von ausreichend hoher Reinheit für die Kristallisation. Die Proteinkristallisation wird in verschiedenen Fällmittelkonzentrationen in unterschiedlichen pH-Bereichen unter Verwendung der Hanging Drop Vapor Diffusionsmethode durchgeführt. Die komplexe Vorbereitung mit den kleinen Molekülen erfolgt durch die Dampfdiffusionsmethode unter einer inerten Atmosphäre. Die Röntgenbeugungsanalyse des Kristallkomplexes liefert einen eindeutigen strukturellen Beweis für Bindungswechselwirkungen zwischen der Proteinbindungsstelle und 1,2-Azaborinen.

Die schematische Syntheseweg für 1,2-azaborines ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll gilt für die Synthese von fünf verschiedenen Bor-Stickstoff-enthaltende Moleküle. 2 stellt 11 B - NMR - Spektren im Verlauf von Schritt 1.3 gemessen , um die Bildung des gewünschten Produkts (3) zu überwachen. Proteinreinigung wurde unter Verwendung von Niederdruck - Chromatographie - System durchgeführt , und ein repräsentatives C...

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Azaborinen und die Herstellung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym-Mutanten wird vorgestellt.

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine allgemeine Methode zur Synthese von 1,2-Azaborinen und deren potenzielle Anwendung in der biomedizinischen Forschung zu beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine sichere Synthese von 1,2-Azaborin-Verbindungen ermöglicht, die borhaltige Isostere des allgegenwärtigen Benzol-Motivs darstellen. Der beschriebene Vorläufer kann weiterhin zu potenziell komplexeren Molekülen funktionalisiert werden.Die Herstellung von Protein-Komplexen mit 1,2-Azaborin liefert Einblicke in zukünftige Anwendungen in der biomedizinischen Forschung. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das ringgeschlossene Produkt gemäß dem schriftlichen Protokoll herstellen. Geben Sie 14 Gramm Palladium auf Kohlenstoff zu diesem hergestellten Produkt in Toluol hinzu.Entfernen Sie dann den Kolben aus der Box. Setzen Sie einen im Ofen getrockneten Rückflusskühler mit Schliff 24/40 auf, der mit Stickstoff gespült und mit gekühltem Wasser ausgestattet wurde. Stellen Sie den Kolben in ein Ölbad und erhitzen Sie die Reaktion unter Rühren bis zum starken Sieden bei 135 Grad Celsius.Die Reaktion 16 Stunden unter Rückflussbedingungen belass

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

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Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Ein Protokoll für die diastereoselektive Eintopf Herstellung von cis - N-Ts-iodoaziridines beschrieben. Die Erzeugung von diiodomethyllithium, neben N-Ts Aldimine und Cyclisierung der Amino-Edelstein-Diiodid Zwischen zu iodoaziridines demonstriert. Ebenfalls enthalten ist ein Protokoll, um rasch und quantitativ beurteilt die am besten geeignete stationäre Phase für die chromatographische Reinigung.

Synthese und Reinigung von Iodoaziridines Einbeziehung Quantitative Auswahl der optimalen stationären Phase für die Chromatographie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Bicyclischen Aziridinium Ionen wie 1-Azoniabicyclo [4.1.0] Heptan Tosylate entstanden aus 2-[4-Tolenesulfonyloxybutyl] Aziridine, die für die Vorbereitung der substituierte Piperidines und Azepanes über Regio und stereospezifischen genutzt wurde Ring-Erweiterung mit verschiedenen nukleophile. Dieses hocheffiziente Protokoll erlaubt uns diverse Azaheterocycles mit natürlichen Produkten wie Fagomine, Febrifugine Analog- und Balanol vorzubereiten.

Vorbereitung der stabile bicyclische Aziridinium Ionen und ihre Ring-Öffnung für die Synthese von Azaheterocycles

3-Aroyl-N-Hydroxy-5-Nitroindole wurden durch Cycloaddition von 4-Nitronitrosobenzol mit einem konjugierten terminalen Alkyn in einem einstufigen thermischen Verfahren synthetisiert. Die Vorbereitung des Nitrosarens und der Alkynone wurde angemessen und jeweils durch Oxidationsverfahren an der entsprechenden Aniline und am Alkyno berichtet.

Eine direkte, regioselektive und atomökonomische Synthesevon 3-Aroyl-N-Hydroxy-5-Nitroindolen durch Cycloaddition von 4-Nitronitrosobenzol mit Alkynonen

In dieser Studie stellen wir sowohl Enantiomere von Aziridin-2-carboxylat her, die bei der asymmetrischen Synthese von Alkaloiden, einschließlich Biemamid B und D, als auch (-)-Epiallo-Isomuscarin verwendet werden.

Herstellung von enantiopuren nicht-aktivierten Aziridinen und Synthese von Biemamid B, D und Epiallo-Isomuscarin

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.

Zelltypspezifische Proteinreinigung und Identifizierung aus komplexen Geweben unter Verwendung einer mutierten Methionin-tRNA-Synthetase-Mauslinie

Benachbarte Bisaziridine, die nicht aktivierte und aktivierte Aziridine enthielten, wurden durch asymmetrische organokatalytische Aziridinationen synthetisiert und dann chemoselektiven Ringöffnungsreaktionen unter sauren oder basischen Bedingungen unterzogen. Der nicht aktivierte Aziridinring öffnet sich unter sauren Bedingungen mit weniger reaktiven Nukleophilen, während der aktivierte Aziridinring unter basischen Bedingungen mit reaktiveren Nukleophilen öffnet.

Herstellung zusammenhängender Bisaziridine für regioselektive Ringöffnungsreaktionen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung und Bewertung der antimikrobiellen Aktivität und Zytotoxizität des kationischen Peptides Mel4 und des Peptidmimiks RK758. Durch die Integration chemischer Synthese, rekombinanter Expression und standardisierter funktioneller Assays bietet es einen reibungslosen Arbeitsablauf für die Herstellung und Prüfung von Peptiden und Kleinmolekül-Mimiken.

Herstellung und Prüfung antimikrobieller Peptide und ihrer Nachahmungen

Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Erfahren Sie die Synthese von 1,2-Azaborinen und die Herstellung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym-Mutanten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige borhaltige Benzolisostere für biomedizinische Anwendungen.

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

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