Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine allgemeine Methode zur Synthese von 1,2-Azaborinen und deren potenzielle Anwendung in der biomedizinischen Forschung zu beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine sichere Synthese von 1,2-Azaborin-Verbindungen ermöglicht, die borhaltige Isostere des allgegenwärtigen Benzol-Motivs darstellen. Der beschriebene Vorläufer kann weiterhin zu potenziell komplexeren Molekülen funktionalisiert werden.

Die Herstellung von Protein-Komplexen mit 1,2-Azaborin liefert Einblicke in zukünftige Anwendungen in der biomedizinischen Forschung. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das ringgeschlossene Produkt gemäß dem schriftlichen Protokoll herstellen. Geben Sie 14 Gramm Palladium auf Kohlenstoff zu diesem hergestellten Produkt in Toluol hinzu.

Entfernen Sie dann den Kolben aus der Box. Setzen Sie einen im Ofen getrockneten Rückflusskühler mit Schliff 24/40 auf, der mit Stickstoff gespült und mit gekühltem Wasser ausgestattet wurde. Stellen Sie den Kolben in ein Ölbad und erhitzen Sie die Reaktion unter Rühren bis zum starken Sieden bei 135 Grad Celsius.

Die Reaktion 16 Stunden unter Rückflussbedingungen belassen. Danach das Kolben aus dem Ölbad nehmen, um die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen zu lassen. Nach dem Abkühlen den Rückflusskühler am Reaktionskolben durch die Septum ersetzen.

Unter Verwendung einer Spritze, die mit einer im Ofen getrockneten Luer-Lock-Nadel ausgestattet ist, eine 5-Milliliter-Aliquot entnehmen. Den Aliquot in ein Schraubverschluss-NMR-Röhrchen überführen. Die Probe mittels Bor-11-NMR analysieren.

Falls die Reaktion unvollständig ist, überführen Sie den Reaktionskolben in eine Handschuhbox. Fügen Sie anschließend weitere drei Gramm Palladium auf Kohlenstoff hinzu. Entfernen Sie danach den Kolben aus der Handschuhbox.

Bestücken Sie den Kolben mit einem 24/40-Rückflusskühler, der mit Stickstoff gespült und mit gekühltem Wasser ausgestattet wurde. Erhitzen Sie die Reaktion unter Rühren 24 Stunden lang mit einem Ölbad bis zum starken Sieden bei 135 Grad Celsius. Analysieren Sie eine weitere Aliquotprobe mittels Bor-11-NMR, um sicherzustellen, dass die Reaktion abgeschlossen ist.

Überführen Sie danach den Reaktionskolben zurück in die Handschuhbox. Leiten Sie das Reaktionsgemisch durch eine Säule für die Schnellchromatographie, die mit Papiertüchern gepackt ist. Sammeln Sie anschließend das Filtrat in einem einliter-Rundkolben, der mit einem Rührstab ausgestattet ist.

Spülen Sie die Säule mit 50 Milliliter Toluol. Entfernen Sie das Filtratgefäß aus der Handschuhbox und schließen Sie es an eine Vakuum-Gaswechselvorrichtung an, die mit einer Stickstoffleitung ausgestattet ist. Stellen Sie ein Wasserbad unter den Kolben und einen Dewar-Behälter mit flüssigem Stickstoff, um das Lösungsmittel abzufangen.

Öffnen Sie das Hochvakuumsventil, um alle flüchtigen Bestandteile aus dem Filtrat zu entfernen. Danach kehren Sie die Reaktionsmischung in die Handschuhbox zurück. Überführen Sie die Mischung in einen im Ofen getrockneten 250-Milliliter-Rundkolben mit 24/40-Anschluss, der einen Rührstab enthält.

Spülen Sie die restliche Reaktionsmischung mit Dichlormethan aus und überführen Sie sie in den Kolben. Verschließen Sie den Kolben mit einem Septum. Bringen Sie den Kolben von der Handschuhbox zum Vakuumverteiler und schließen Sie ihn an.

Öffnen Sie das Hochvakuumventil, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. Entfernen Sie anschließend schnell die Septum und geben Sie Calciumhydrid mit einer Schaufelspatel hinzu. Verbinden Sie den Rundkolben mit der im Textprotokoll beschriebenen Destillationsapparatur und stellen Sie die Ölbadtemperatur auf 100 Grad Celsius ein.

Nach Abschluss der Destillation entfernen Sie die Wärmequelle und kühlen Sie die Apparatur auf Raumtemperatur ab. Setzen Sie den Druck der abgekühlten Apparatur mit Stickstoff wieder auf Normaldruck und schließen Sie das Absperrventil am luftfreien Lagervorratskolben fest. Nachdem Sie das isolierte Produkt im Handschuhkasten aus dem Kolben in ein Vial überführt haben, lagern Sie das Vial im Gefrierschrank des Handschuhkastens.

Nach der Reinigung des Proteins die gereinigte Lösung in Dialyse-Schläuche überführen. Die Dialyse-Schläuche in ein Gefäß mit einer vier Liter großen Lösung aus 100 Millimolar Natriumphosphat, 550 Millimolar Natriumchlorid und 0,2 % Natriumazid geben. Über Nacht bei vier Grad Celsius rühren.

Am nächsten Tag 2-Mercaptoethanol zur dialysierten Probe hinzufügen, sodass die Endkonzentration fünf Millimolar beträgt. Anschließend die Lösung mit einem Zentrifugal-Konzentrator auf 40 Milligramm pro Milliliter einkonzentrieren. Die Probe bei 5.000 U/min und sechs Grad Celsius zentrifugieren und nach der Einkonzentrierung jeglichen Niederschlag entfernen.

Als Nächstes richten Sie in einer 24-Loch-Platte verschiedene Bedingungen mit der Reservoirlösung ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie Fett zur dichten Versiegelung, indem Sie es auf den Rand jedes Wells auftragen. Mischen Sie fünf Mikroliter der konzentrierten Proteinslösung mit fünf Mikrolitern der Reservoirlösung auf einem silanisierten Glasdeckträger.

Legen Sie den Deckel rückseitig über die Vertiefungen mit Reservoirlösung. Lagern Sie die Platte bei 4 Grad Celsius zur Kristallbildung. Heben Sie die gewachsenen Kristalle mit einer Schleife aus kryogenem Schlauch auf und geben Sie sie in ein 6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie 50 Mikroliter Mutterlauge hinzu. Überführen Sie das Gefäß danach in eine Handschuhbox. Geben Sie fünf Mikroliter des hergestellten Azaborin-Liganden auf die Innenseite der Schraubkappe des Gefäßes.

Verschließen Sie das Röhrchen und lagern Sie es zwei bis sieben Tage im Kühlschrank innerhalb der Handschuhbox, um eine Gleichgewichtseinstellung durch Dampfdiffusion zu ermöglichen. Danach geben Sie einen Tropfen N Paratone auf einen Objektträger. Übertragen Sie mithilfe einer Mikropipette einen Kristall auf den Objektträger.

Verwenden Sie anschließend eine Schleife aus kryogenem Schlauch, um den Kristall aufzunehmen und aus der wässrigen Lösung in das N Paratone zu überführen. Tauchen Sie den mit N Paratone geschützten Kristall in einen Dewar, der flüssigen Stickstoff enthält. Befestigen Sie den blitzartig eingefrorenen Kristall mithilfe kryogener Zangen an der Schleife.

Analysieren Sie anschließend die gesammelten Kristalldaten gemäß der schriftlichen Anleitung. In dieser Studie wird eine modifizierte Synthese von 1,2-Azaborinen vorgestellt, die auf zuvor veröffentlichten Methoden basiert. Tri-Allylborin wird verwendet, um das N-Allyl-NTBSB-Allyl-Chlorid-Addukt herzustellen.

Eine One-Pot-Zweischrittsequenz wird für die Synthese von NTBS BCl 1, 2-Azaborin angewandt, wodurch eine höhere isolierte Ausbeute im Vergleich zu früheren Methoden erzielt wird. Die Synthese von N-H-B-ethyl-1,2-Azaborin wird in zwei Schritten durchgeführt, wobei Ethyllithium anstelle des in zuvor beschriebenen Methoden verwendeten Chromkomplexes eingesetzt wird. Das Protein wird mithilfe eines Niederdruck-Chromatographiesystems gereinigt.

Ein Chromatogramm, das bei 280 Nanometern aufgezeichnet wurde, zeigt ein Signal, das mit dem T4-Lysozym-Mutanten L99am102q übereinstimmt. Das Protein wird anschließend kristallisiert und mit Liganden komplexiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Azaborin-Synthese luftfreie Bedingungen erfordert, wie beispielsweise einen Handschuhkasten und ein Vakuum-Gasverteilersystem, um die Zersetzung der Verbindungen zu verhindern.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg, um die einzigartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften von Azaborinen im Vergleich zu kohlenstoffhaltigen Aromaten in klassischen biologischen Areal-Rekultivierungstaschen zu untersuchen.