Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein In Vitro Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die individuelle CFTR-Funktion in Bezug auf die Wirksamkeit von CFTR-modulierenden Behandlungen mit Hilfe eines Forskolin-induzierten Schwellungs- oder FIS-Assays in Darmorganoiden zu bewerten, die von Mukoviszidose-Patienten erzeugt wurden. Diese Methode adressiert Schlüsselfragen im Bereich Mukoviszidose. Vor allem hilft es bei der Identifizierung von Patienten, die langfristig von bestehenden oder experimentellen Medikamenten profitieren können.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass leicht zugängliches Gewebe verwendet werden kann, um Organoide von jedem CF-Patienten unabhängig vom Alter zu erzeugen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Orthotherapie von Mukoviszidose und adressieren einen dringenden aktuellen Bedarf, die Wirksamkeit von Arzneimitteln kostengünstig und individuell zu testen. Marvin Statia von Hubrecht Organoid Technology und Annelot Vonk von der Jeffrey Beekman Group werden das Verfahren vorführen.

Um optimale Forskolin-induzierte Quellungs-Assay-Daten zu erhalten, ist es wichtig, mit einer Kultur zu arbeiten, die große Organoide mit mehreren Knospen enthält. Nachdem Sie eine solche Kultur identifiziert haben, beschriften Sie ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Namen der Probe und ein Röhrchen als gewaschen. Verwenden Sie anschließend eine p1000-Pipette, um das Medium vorsichtig aus den Organoid-Kulturvertiefungen zu aspirieren, ohne die Tropfen der Basalmembranmatrix zu stören.

Und geben Sie einen Milliliter Basalmedium in jede Vertiefung. Verwenden Sie nun die Pipette, um die Tropfen der Basalmembranmatrix in jeder Vertiefung aufzubrechen, und übertragen Sie die resultierenden Organoidsuspensionen in das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Probennamen. Spülen Sie jede Vertiefung mit einem weiteren Millimeter Basalmedium aus und ziehen Sie die Wäschen in das Probenröhrchen.

Wenn alle Proben entnommen wurden, füllen Sie das Probenröhrchen bis zu einem Endvolumen von 12 Millilitern mit Basalmedium und mischen Sie die Lösung mit einer vorfeuchten Fünf-Milliliter-Pipette. Als nächstes zentrafugieren Sie die Organoide und suspendieren das Pellet in einem Milliliter frischem Basalmedium. Decken Sie dieselbe p1000-Pipettenspitze mit einer p10-Spitze ohne Filter ab und versuchen Sie, die Suspension 20 Mal zu bewerten.

Entsorgen Sie dann beide Spitzen und geben Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vier Milliliter frisches Basalmedium in die Probe. Kippen Sie das Röhrchen um etwa 70 Grad und mischen Sie die Lösung zwei- bis dreimal kräftig mit der neuen pre-wet p1000 Pipettenspitze. Halten Sie das Rohr 10 Sekunden lang in der gekippten Position.

Verwenden Sie dann dieselbe p1000-Pipette, um den oberen Milliliter der Probe viermal in die gewaschenen Röhrchen zu übertragen. Nachdem die letzte Probe geerntet wurde, sammeln Sie die Organoide durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet wieder in 120 Mikrolitern 50%iger Basalmembranmatrix. Geben Sie dann ein drei Mikroliter großes Tröpfchen auf einen Objektträger aus Glas und bestätigen Sie das Vorhandensein von mindestens 30 bis 50 Organoiden im Tröpfchen unter einem Lichtmikroskop.

Als nächstes werden drei Mikroliter Oraganoid-Tröpfchen auf die Mitte jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte aufgetragen und die Platte 15 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator gelegt, um die Basalmembranmatrix zu verfestigen. Geben Sie dann entweder 100 Mikroliter Volldarmmedium plus VX809 oder nur ein vollständiges Dickdarmmedium in die entsprechenden Organoid-Vertiefungen und stellen Sie die Platte für 18 bis 24 Stunden wieder in den Inkubator. Geben Sie am nächsten Tag mit einer Repetierpipette 10 Mikroliter Kalziumlösung in jede Vertiefung, indem Sie die Vertiefungen einmal mit einer Mehrkanalpipette erneut suspendieren, um sicherzustellen, dass sie sich mischen, und stellen Sie die Platte für weitere 30 Minuten in den Inkubator zurück.

Während die Zellen gefärbt werden, stellen Sie das Live-Imaging-Tool am konfokalen Mikroskop für die Lebendzell-Bildgebung auf 37 Grad und fünf Prozent Kohlendioxid ein, um die Bildgebungskammer vorzuinkubieren. Übertragen Sie am Ende der Inkubation die Platte in den Plattenhalter am Konfokalmikroskop und verwenden Sie die intelligente Setup-Option, um die Spur Alexa floor 488 auszuwählen. Stellen Sie als Nächstes die fünf Ex-Objektive und den Scanbereich auf 0,6x ein, um die Ansicht zu verkleinern und das gesamte Well-Fenster zu erfassen.

Passen Sie die Laserleistung und die Empfindlichkeit des Detektors an, um eine optimale Detektion der kalziumgrün markierten Organoide über dem Hintergrund zu ermöglichen. Legen Sie die Bittiefe auf acht und die Framegröße auf 512 x 512 Pixel fest. Verwenden Sie die Option Zeitreihen, um die Messzeit, die Häufigkeit und die Intervalle festzulegen.

Und die Kacheloption, um die einzelnen Well-Positionen manuell zu bestimmen. Geben Sie nun 100 Mikroliter frisch zubereitetes Forskolin und/oder VX770 in die entsprechenden Vertiefungen, beginnend mit der ersten Vertiefung, die abgebildet werden soll, und beginnen Sie mit der Messung. Aufgrund der Dysfunktion des Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulators (CFTR) sind die meisten Dickdarm-Mukoviszidose-Organoide kompakt und schwellen je nach Genotyp 60 Minuten nach der Forskolin-Stimulation entweder nicht an oder zeigen nur eine sehr geringe Schwellung.

Wenn CF-Organoide jedoch vor der Forskolin-Stimulation mit CFTR-Modulatoren behandelt werden, zeigen die Organoide eine Zunahme der Schwellung. Um die Schwellung zu quantifizieren, können zu jedem Zeitpunkt die gesamten kalziumgrünen Oberflächen gemessen werden. Einmal gemeistert, können diese Techniken in drei oder vier Stunden abgeschlossen sein, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Bevor dieses Verfahren in Angriff genommen wird, ist der wichtigste Schritt die Optimierung der Kulturbedingungen für Darmorganoide, da Kulturen von guter Qualität die optimale Leistung des FIS-Assays bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie Sie mit Darmorganoidkulturen arbeiten und anschließend die CFTR-Aktivität und die Reaktion der CFDR-Modulatoren mit einem Forskolin-induzierten Schwellungsassay messen können.