Name: Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein In Vitro Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Forskolin-induzierte Schwellungsmethode zur Bewertung der CFTR-Funktion in intestinalen Organoiden von Mukoviszidose-Patienten. Diese Technik ermöglicht die personalisierte Testung von CFTR-Modulatoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der HIT-CF-Programm der niederländischen CF-Stiftung (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103) unterstützt, der Wilhelmina Kinderkrankenhaus Research Fund und der Tschechischen Republik und Zilverenkruis / Achmea. Wir möchten S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, und G. Berkers (Abteilung für Pädiatrische Pneumologie, Wilhelmina Kinderkrankenhaus, UMC Utrecht) und RHJ Houwen (Abteilung für Pädiatrische Gastroenterologie, Wilhelmina zu danken Kinderkrankenhaus, UMC Utrecht) für die Patienten heranzugehen und die Biopsien für die Erzeugung eines CF Biobank zu bekommen.

<ol><li>De Boeck, K., Amaral, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+therapies+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in therapies for cystic fibrosis.</a> Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).</li>
<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+genetics%3A+from+molecular+understanding+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+disease+liability+of+variants+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.</a> Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).</li>
<li>Zielenski, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10773783">Genotype and phenotype in cystic fibrosis.</a> Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+CF+airway+epithelial+cell+function+in+vitro+by+a+CFTR+potentiator%2C+VX-770%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>Ramsey, B. W., Davies, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>De Boeck, K., Munck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+corrector+%28lumacaftor%29+and+a+CFTR+potentiator+%28ivacaftor%29+for+treatment+of+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+a+phe508del+CFTR+mutation%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).</li>
<li>Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1569199313001136">Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function.</a> J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).</li>
<li>Sato, T., Vries, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Stange, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1 (1), e27112(2014).</li>
<li>Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+forceps+biopsy+procedure+in+cystic+fibrosis%3A+technical+aspects+and+patients+perspective+for+clinical+trials+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility.</a> BMC gastroenterology. 13, 91(2013).</li>
<li>Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+synergy+in+rectal+organoids+carrying+S1251N%2C+G551D%2C+or+F508del+CFTR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations.</a> J Cyst Fibros. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84(2016).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).</li>
<li>Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+a+model+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium.</a> Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).</li>
<li>Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+agonists+activate+CFTR+in+organoids+and+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis.</a> Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Graeber, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Current+Measurements+Detect+Activation+of+Mutant+CFTR+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+with+the+G551D+Mutation+Treated+with+Ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor.</a> Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+Eur+Cyst+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li>
</ol>

Hans Clevers ist Erfinder von Patenten für die Organoidkultur und den Forskolin-induzierten Quellungstest. Jeffrey M Beekman ist einer der Erfinder eines Patents für den Forskolin-induzierten Schwellungsassay. Sylvia F Boj und Robert Vries sind bei der Stiftung Hubrecht Organoid Technology (HUB) angestellt, die die exklusive Lizenz für die Organoid Technology hält. Ansonsten haben die Autoren nichts offenzulegen.

Hier bieten wir ein komplettes Protokoll für die Erzeugung, Expansion, Einfrieren und Auftauen von menschlichen kolorektalen Organoiden. Während wir uns vor 17 einige Zeit menschliche organoiden Kulturen etabliert haben, hat es sich manchmal als schwierig erwiesen , die Technologie in anderen Labors ohne zu etablieren praktische Ausbildung. Wir gehen davon aus, dass diese Protokolle eine solche Ausbildung ersetzen wird. Wnt-3A-konditioniertes Medium ist eines der wich...

CF wird durch Mutationen in der Mukoviszidose - Transmembran Regulator (CFTR) -Gen verursacht , die eine epitheliale Anionenkanals kodiert. CF betrifft etwa 85.000 Menschen weltweit 1. Über 2.000 CFTR - Mutationen wurden identifiziert ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Diese Vielfalt erklärt zum Teil , ein breites Spektrum an beobachteten Krankheitsphänotypen ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Sechs Klassen von CFTR-Mutationen definiert sind, auf der Grundlage ihrer Wirkung auf CFTR-Protein-Expression und Funktion: (I) keine Synthese, (II) beeinträchtigt Handel, (III) defekte Kanal-Gating, (IV) geändert Leitfähigkeit, (V) reduzierte Mengen von in der Regel CFTR funktioniert, und (VI) beeinträchtigt Zelloberflächenstabilität 4. Obwohl die gemeinsame CFTR-Mutationen gut untersucht sind, die CFTR-Funktion und die Beziehung mit dem klinischen Zustand bleiben poorly verstanden auf der Ebene des Individuums, vor allem für die große Gruppe der seltenen &quot;orphan&quot; Mutationen ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Kürzlich wurden Arzneimittel entwickelt, das CFTR-Protein in einem mutationsspezifischen Art und Weise auszurichten. Zwei Klassen von CFTR-Protein-Targeting Medikamente befinden sich in der klinischen Anwendung und haben unterschiedliche Wirkungsweisen. Potenziatoren, wie VX-770, verbessern die Open-Wahrscheinlichkeit von apikal lokalisierten mutierten CFTR und direkt auf ihre Zugabe zu den Zellen 5 handeln. Korrektoren, wie VX-809, den Handel des endoplasmatischen Reticulum lokalisierten misfolded CFTR wieder herzustellen und erfordern Vorinkubation mit Zellen vor den Auswirkungen 6 beobachtet werden. Das CFTR potentiator, VX-770 wurde für Patienten mit der G551D - Mutation 7, 8, sowie für die acht anderen registriertenCFTR - Gating - Mutationen, einschließlich S1251N 9; gemeinsam werden diese Mutationen durch 5% aller CF Probanden getragen. Andere Studien haben gezeigt , dass VX-770, mit dem Korrektor VX-809 kombiniert, hat begrenzte noch mit erheblichen Auswirkungen auf die Lungenfunktion und führt zu einer Abnahme in Exazerbationsraten in Subjekten homozygot für die F508del von 45-50% der Patienten durch mutation 10, 11. Herkömmliche Studien arzneimittelreaktions Subjekten innerhalb der verbleibenden 50% der CF-Patienten sind kostspielig und zeitaufwendig und sind nicht durchführbar für Personen mit extrem selten CFTR-Genotypen zu identifizieren. Neuartige, kostengünstige, personalisierte Methoden sind entscheidend, um die wachsende Zahl von CFTR-Modulatoren Personen zuordenbar jede Art von CFTR Mutation trägt. unter Verwendung von mutierten CFTR-Gen-Transfektion in h Bisher hat die Studie die Aufnahme von Patientengruppen tragen bestimmte CFTR-Mutationen wurden durch Studien geführteterologous Zellsysteme, gefolgt von elektrophysiologischen Studien in Ussing - Kammern 5, 6, 12. Aufgrund eines Mangels an ausreichenden CF Tiermodellen, Arzneimittelwirksamkeitsstudien an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche differenzierten für die Arzneimittelentwicklung 13 bronchialen Epithelzellen abgeleitet von CF Lungen Explantat Materialien wurden 14 verwendet wird , 15. die begrenzte Verfügbarkeit von Lungen Explantation Gewebe und den invasiven Verfahren jedoch zu bronchiale Zellen von Probanden ohne Endstadium der Erkrankung behindern die Analyse seltener CFTR-Mutationen erhalten und Drogentests in einem personalisierten Mode verhindern. Um diese Einschränkungen zu, &quot;easy access&quot; Gewebe, wie kolorektalen Organoiden, nasale Atemwegszellen und Atemwegszellen stammen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zu überwinden, werden derzeit für personalisierte medikamentöse Behandlungen erforscht. 16, 17. Für den menschlichen Kolon / Rektum beinhalten die Kulturbedingungen definierten Wachstumsfaktoren (Epithelial Growth Factor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) und Noggin), kombiniert mit kleinen Molekülen (Nicotinamid, A83-01, und SB202190) in einer Basalmembranmatrix. Unter diesen Bedingungen wachsen einzelne Stammzellen oder kleine Gewebefragmente aus in geschlossene, zystische, 3D-Strukturen durch hochpolarisierten Epithel mit seinem basalen Seite gebildet außen orientiert. Alle Zelltypen erscheinen typischerweise in ihren normalen Verhältnissen und Positionen. Organoide kann durch wöchentliche mechanische Zerstörung und Wieder plating über lange Zeiträume erweitert werden. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und kann gespeichert werden, so dass langfristige Expansion und Bio-Banking - 17. Sie sind zugänglichalle Standard - zellbiologische / genetische Manipulationen und Analysetechniken für 2D - Zelllinien 18 entwickelt. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die CFTR - Funktion kann leicht in kolorektalen Organoiden in einer Forskolin-induzierte Schwellung (FIS) -Test 19, 20 gemessen werden. Wenn ausgesetzt Forskolin (FSK) oder alternativ an Choleratoxin, Organoiden schnell ihre zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) Spiegel erhöhen, was wiederum in der Öffnung des CFTR - Kanals 19. Organoide von gesunden Individuen oder von Patienten mit CFTR - Mutationen mit Restfunktion zugeordnet ist , wird anschließend als Folge des Ionen- und Wassertransport zu den organoiden Lumen schwellen, die in vitro - Äquivalent von sekretorischen Diarrhoe. Die FIS Antwort von kolorektalen Organoiden wurde zuvor gezeigt, vollständig CFTR-abhängig zu sein, wie abgeleitet von Organoiden angegeben von CFTR-null-Personen einnd durch die Verwendung von spezifischen pharmakologischen Inhibitoren CFTR 19. Große fachspezifische Datensätze können innerhalb weniger Wochen nach der Einnahme eine Biopsie entnommen werden. Für die FIS - Assay im Detail hier beschrieben, Organoide gezüchtet werden aus rektale Biopsien , die in jedem Alter und nur mit begrenztem Unannehmlichkeit 21 erhalten werden kann. Organoide werden wöchentlich durch mechanische Störung in einzelne Krypten agierten, die leicht wieder verschließen und neue Organoide bilden. Für den FIS - Test läuft, ~ 30-80 dieser gestört wenig Organoide werden in jede Vertiefung einer 96-Well - Platte 19 plattiert. Am Tag des Assays werden die Organoide mit Calcein grün gefärbt, ein fluoreszierendes zellpermeablen Farbstoff, der es innerhalb von lebenden Zellen zurückgehalten wird, Echtzeit-Bildgebung zu erleichtern. Dann Fsk, die die intrazelluläre cAMP erhöht und aktiviert dadurch CFTR, wird hinzugefügt, um organoide Schwellung zu stimulieren. Potenziatoren, die auf apikal CFTR wirken, werden gleichzeitig zugegeben with der Forskolin, während Korrektoren, die CFTR Handel wiederherzustellen 24 h vor der Zugabe von Fsk zugegeben. Die organoiden Quellung wird durch eine automatisierte Bildanalyse quantifiziert, die in der Gesamtfläche aller fluoreszierender Objekte für jeden Zeitpunkt auf Forskolin zusätzlich die relative Zunahme berechnet. 3D organoiden Schwellung Vor- und Nachteile gegenüber bestehenden elektro CFTR Ablesungen in 2D in Ussing-Kammern kultiviert Atemwegszellen liefert. Ein Hauptvorteil ist der Durchsatz des Quelltest. Die Zellen werden kultiviert und untersucht eine einzige Art von Kulturmedium verwenden, und ein erfahrener Techniker kann die Kultur bis zu 25 organoiden Proben auf einer wöchentlichen Basis, während rund 1.200 Datenpunkte pro Woche in 12 Patientenproben zu quantifizieren. Wir geben üblicherweise einen einzigen experimentellen Bedingungen durch doppelte oder dreifachen Messungen pro Platte und wiederholen Sie solche Messungen bei drei unabhängigen Inkubationszeit Punkte. Insgesamt etwa 300 bis 500 single organoide Strukturen werden dann pro experimentellen Bedingungen gemessen, die mit begrenzten technischen Variabilität sehr präzise Messungen der CFTR-Funktion führt. Diese Präzision ermöglicht es uns, deutliche Unterschiede definieren in Restfunktion und die Reaktion auf CFTR - Modulatoren und ermöglicht es uns leicht genetischen Hintergrund Effekte zwischen Patienten tragen identische CFTR - Mutationen 19, 22, 23, 24, 25 aufzunehmen. Die Datenqualität kann leicht von Mikroskopbildern beurteilt werden. Während FIS vollständig CFTR-abhängig ist, ist es ein indirektes Ergebnis Maßnahme für CFTR-Funktion, dessen Auslesung durch die Kopplung des Ionentransports zu den Fluidtransport verursacht. Dies steht im Gegensatz direkte CFTR - Funktion Messungen in Ussing - Kammern, die transepithelialen Ionenströme 26 messen. Ussing-Kammern ermöglichen die Auswahl Stimulation der apikalen oder basolateralen compartments (die die organoiden Test nicht erlaubt); von permeabilisierender basolateralen Membranen kann die apikal CFTR-abhängige Anion Sekretion selektiv 27 gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>Fortschrittliches Dulbecco' s Modifizierter Adler Medium mit Nährstoffmischung F-12 Schinken (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>gelagert bei 4 & deg; C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td> <td>#35050</td><td>gelagert bei 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftlich:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>96 Well Kulturplatte</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Kulturplatte</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Kulturplatte</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierte Eagles Medium&nbsp; (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td> <td># 31966-021</td><td>für die Produktion von Wnt-3A konditionierten Medien. Gelagert bei 4 Grad; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOT # 11113</td><td>für die Produktion von Wnt-3A konditionierten Mediums. Gelagert bei -20 °; C</td></tr><tr><td>L Wnt3A-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>für die Wnt-3A-Produktion unter Bedingungen des Mediums.</td></tr><tr><td>TOP/FOP-Plasmide</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Zur Messung der Wnt-Aktivität</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Zur Messung der Wnt-Aktivität</td></tr><tr><td>HEK-293 ATCC</td><td></td><td>#CRL-1573</td><td>Zur Messung der Wnt-Aktivität</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Zur Messung der Wnt-Aktivität</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Für Wnt-3A Zelllinienauswahl</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>gelagert bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Humaner epithelialer Wachstumsfaktor (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>gelagert bei -20°; C</td></tr><tr><td>TGFb Typ I Rezeptor-Inhibitor (A83-01)</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>p38 MAPK-Inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Humanes R-Spondin 3 (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>gelagert bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>für trypsinisierende Organoide zum Einfrieren</td></tr><tr><td>von Recovery Cell Culture zum Einfrieren von Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>zum Einfrieren</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>gelagert bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>gelagert bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>gelagert bei -80°; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>gelagert bei -80°; C</td></tr><tr><td>Name der Reagenzien/Material</td><td><Solvent></td><td>Stock Concentration</td><td>Endkonzentration</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro; g/ml</td><td>100 U/ml 100 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Humaner epithelialer Wachstumsfaktor (hEGF)</td><td>DPBS 0,1% BSA</td><td>0,5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>DPBS</td><td>100 & Mikro; M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb Typ I Rezeptor-Inhibitor (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 & Mikro M</td></tr><tr><td>p38 MAPK-Inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp;</td><td>100 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>DPBS 0,1%BSA</td><td>100 & Mikro; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Humanes R-Spondin 3 (hRspo-3)</td><td></td> <td>variiert pro Charge</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DMSO</td><td>10 & Mikro; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>variabel</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variabel</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variabel</td></tr></tbody></table>

forskolin-induzierte quellung in intestinale organoide: ein<em&gt; in vitro</em&gt; assay für fibrosis patienten in cystic drug response-beurteilung

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Kürzlich entwickelte Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-modulierende Medikamente korrigieren die Oberflächenexpression und/oder Funktion des mutierten CFTR-Kanals bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). Die Identifizierung von Probanden, die von diesen Medikamenten profitieren könnten, ist aufgrund der großen Heterogenität der CFTR-Mutationen sowie anderer unbekannter Faktoren, die zur individuellen Wirksamkeit des Medikaments beitragen, eine Herausforderung. Hier beschreiben wir einen einfachen und relativ schnellen Assay zur Messung der individuellen CFTR-Funktion und des Ansprechens auf CFTR-Modulatoren in vitro. Dreidimensionale (3D) epitheliale Organoide werden aus rektalen Biopsien in einem Standard-Organoidmedium gezüchtet. Sobald die Organoide etabliert sind, können sie für zukünftige Analysen in einer Biobank gespeichert werden. Für den Assay werden 30-80 Organoide in 96-Well-Platten in einer Basalmembranmatrix ausgesät und dann mit Medikamenten exponiert. Einen Tag später werden die Organoide mit Calceingrün gefärbt und die Forskolin-induzierte Schwellung wird durch konfokale Lebendzellmikroskopie bei 37 °C überwacht. Die Forskolin-induzierte Schwellung ist vollständig CFTR-abhängig und ausreichend sensitiv und präzise, um eine Unterscheidung zwischen den Arzneimittelreaktionen von Personen mit unterschiedlichen und sogar identischen CFTR-Mutationen zu ermöglichen. In vitro Swell-Reaktionen korrelieren mit dem klinischen Ansprechen auf die Therapie. Dieser Assay bietet einen kostengünstigen Ansatz für die Identifizierung von Individuen, die auf Medikamente ansprechen, unabhängig von ihren CFTR-Mutationen. Es kann auch bei der Entwicklung künftiger CFTR-Modulatoren eine wichtige Rolle spielen.

1A zeigt eine repräsentative frische Isolierung von Krypten auf BMM eingebettet. Die Krypten sind aus einem kolorektalen Biopsie einer CF Thema. Üblicherweise wird ein organoid aus jeder Krypta (1A - C) erzeugt. Aufgrund der Funktionsstörung der CFTR, sind die meisten der colon CF Organoide nicht cystic, sondern sind kompakt und mit Vorsprüngen und buddings (2A - 2B). Allerdings organoiden einige CF Kult...

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Messung der CFTR-Funktion und der CFTR-Modulatorreaktionen in kultiviertem Gewebe von Probanden mit Mukoviszidose (CF). Aus Biopsien gewonnene Darmorganoide schwellen cAMP-getrieben an, eine Reaktion, die bei CF-Organoiden defekt (oder stark reduziert) ist und durch Exposition gegenüber CFTR-Modulatoren wiederhergestellt werden kann.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die individuelle CFTR-Funktion und die Wirksamkeit von CFTR-modulierenden Therapien mithilfe eines durch Forskolin induzierten Schwellungsassays (FIS-Assay) an aus Darmorganoiden von Patienten mit Mukoviszidose generierten Zellkulturen zu bewerten. Diese Methode beantwortet zentrale Fragestellungen im Bereich der Mukoviszidoseforschung. Insbesondere trägt sie dazu bei, Patienten zu identifizieren, die langfristig von bereits verfügbaren oder experimentellen Wirkstoffen profitieren können.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass leicht zugängliches Gewebe verwendet werden kann, um Organoiden von jedem Mukoviszidose-Patienten unabhängig vom Alter zu erzeugen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur individualisierten Therapie der Mukoviszidose und trägt einer dringenden aktuellen Notwendigkeit Rechnung, die Wirksamkeit von Wirkstoffen kostengünstig und individuell zu testen. Die Durchführung des Verfahrens wird Marvin Statia vom Hubrecht Organoid Technology und Annelot Vonk von der Jeffrey Beekman-Gruppe demonstrieren.Um optimale Daten aus dem Forskolin-induzierten Schwellungsassay zu erhalten, ist es entscheidend

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Hier beschreiben wir eine Methode um dreidimensionale Sphäroid Kulturen der menschlichen nasalen Epithelzellen zu generieren. Sphäroide werden dann Laufwerk Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) stimuliert-abhängigen Ion und Fluid-Sekretion, Quantifizierung der Änderung der Sphäroid luminalen Größe als Proxy für CFTR-Funktion.

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um ein in vitro Organoidmodell aus menschlichen Nasenepithelzellen zu beschreiben. Das Protokoll bietet Optionen für Messungen, die Standardlaborgeräte erfordern, mit zusätzlichen Möglichkeiten für spezielle Geräte und Software.

Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.

Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Dieses Protokoll beschreibt die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA), einen neuartigen diagnostischen Assay für Mukoviszidose (CF). Morphologische Merkmale, nämlich die Rundheit (Zirkularitätsindex, CI) und das Vorhandensein eines Lumens (Intensitätsverhältnis, IR), sind ein Maß für die CFTR-Funktion. Die Analyse von 189 Probanden zeigte eine perfekte Unterscheidung zwischen CF und Nicht-CF.

Rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA): Ein diagnostischer Assay bei Mukoviszidose

Organoid-Fibroblasten-Kokulturen bieten ein Modell zur Untersuchung der In-vivo-Stammzellnische . In dieser Arbeit wird ein Protokoll für ösophageale Organoid-Fibroblasten-Kokulturen beschrieben. Zusätzlich wird die Whole-Mount-Bildgebung verwendet, um die Fibroblasten-Organoid-Interaktion sichtbar zu machen.

Funktionelle Charakterisierung und Visualisierung ösophagealer Fibroblasten mittels Organoid-Cokulturen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Erfahren Sie die Forskolin-induzierte Schwellungsmethode zur Bewertung der CFTR-Funktion in intestinalen Organoiden von Mukoviszidose-Patienten. Diese Technik ermöglicht die personalisierte Testung von CFTR-Modulatoren.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein In Vitro Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung (Video) | JoVE Journal

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein

Weitere Videos entdecken