Name: Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die Isolation intakter Langerhans-Inseln aus dem Pankreas neonataler Mäuse. Diese einfache Kollagenase-Methode liefert 20 bis 80 Inselcluster für Studien zur Insulinsekretion und Genexpression.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIDDK (DK065949 für GG) unterstützt. Wir danken Dr. Brenda M. Jarvis und Jeff Duryea Jr. für die Lektüre des Manuskripts.

Tiernutzung nach den festgelegten Verfahren in Protokoll M / 11/181 genehmigt von der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee für Gu. CD1 oder CBA / Bl6 Mäuse wurden von kommerziellen Anbietern gekauft und in der Vanderbilt Tieranlage gekreuzt neugeborenen Mäusen erhalten. 1. Herstellung von Mäusen, Stock-Lösungen und Geräte <ol><li> Für die Maus Kreuz: eine Maus Kreuz und notieren Sie die Aufstecken Termine einrichten experimentelle Planung zu unterstützen. CD1-Mäuse geben in der Regel Geburt um Tag 19 nach der Paarung. Verwenden Sie CD1 oder CBA / Bl6 kreuzt CD1 oder CBA / Bl6 Neugeborenen bzw. zu erhalten. Kreuzungen zwischen den beiden Linien nutzen CD1 Weibchen und CBA / Bl6 Männer. </li><li> Für die Kollagenase Lager: 200 mg Kollagenase Typ IV mit einem hohen Präzisionswaage wiegen. Transfer in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Man löst in 40 ml HBSS mit Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 und 0,5 mM jeweils) , um eine 5 mg / ml Stammlösung herzustellen. <ol><li> Lassen Sie Kollagenasefür ~ 30 min unter leichtem Schütteln lösen. Aliquotieren und die Lösung in -20 ° C als Vorrat eingefroren halten, die für mindestens ein Jahr lang aktiv bleibt. </li></ol></li><li> Autoklaven auf mehrere Paare von Pinzetten, Scheren und P20-Tipps für die Präparation und Inselchen Picking sterilisieren. </li><li> Für die 1 M Glucose Lager: wiegen 9 g Glucose in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen, 50 ml RPMI 1640-Medium, das Glukose zu lösen. Halten Sie in 4 ° C bis zur Verwendung, aber nicht mehr als 6 Monate. </li></ol> 2. Arbeitslösungen HINWEIS: Der Tag der Inselisolierung, bereiten Sie die folgenden Reagenzien. <ol><li> Für die Kollagenase Typ IV Arbeitslösung: Tauwetter und Kollagenase Lager auf Eis verdünnt. Dispense 0,15 ml Brühe in jedem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 1,35 ml HBSS mit Ca 2+ / Mg 2+. Drehen Sie das Röhrchen 5 mal. Lassen Sie auf Eis für 15 min. <ol><li> Spin bei hoher Geschwindigkeit für 3 Minuten in einer Mikro. Überstand in ein neues Röhrchen. Lassen Sie auf Eis bis zum Gebrauch. Entsorgen Sie das Rohr mit unlöslichen Ablagerungen. </li></ol></li><li> Zur vollständigen RPMI 1640 Medium: 2,5 ml 1 M Glucose, 50 ml hitzeinaktiviertem FBS und 5 ml 100x Pen-Strep Lager in 500 ml RPMI 1640 Medien hinzuzufügen. Lassen Sie auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> 3. Pancreas Isolierung und Verdauung <ol><li> Euthanize Neugeborenen mit Isofluran, gefolgt von Enthauptung nach anerkannten Protokollen. </li><li> Legen Sie die Maus mit dem Bauch nach oben zeigt. Spray mit 70% Ethanol für die Sterilisation. </li><li> Heben Sie die Bauchhaut mit einer Pinzette und schneiden Sie die Haut und Muskelschichten in Längsrichtung entlang der Mittellinie mit einer Schere aus dem Genitalbereich des Brustkorbs. Dies öffnet die Bauchhöhle alle inneren Organe zu belichten. </li><li> Übertragen Sie alle inneren Organe zu einer 100-cm-Schale mit einer Pinzette. Suchen Sie die Bauchspeicheldrüse, die ein Streu Orgel mit einem Rückenteil ist , das in den Magen und Milz und eine ventrale Teil klammert , die 11 bis Duodenum klammert. </li&gt; <li> In HBSS in die Schüssel, die Organe zu versenken. In Lösung klammern die Pankreasgewebe nicht mehr auf den Zwölffingerdarm, Magen oder Milz. Es ist ohne weiteres erkennbar unter einem Binokular wegen seiner typischen weißen Farbe. Verwenden einer Pinzette die Pankreasgewebe weg vom umgebenden Gewebe und an einem neuen 60-mm-Schale mit HBSS zu schälen. </li><li> Schneiden Sie jede Bauchspeicheldrüse mit einer Schere in Stücke kleiner als 5 mm über beliebigen Abmessungen. Transfer zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bis zu fünf Bauchspeicheldrüsen (jünger als P7) kann in einem Röhrchen verdaut werden. Für P8-P16 Mäuse, verwenden Sie eine Röhre pro Bauchspeicheldrüse. </li><li> In 0,5-1 ml Kollagenase Arbeitslösung in jedes Röhrchen (0,2 ml pro P1-P7 Bauchspeicheldrüse Verwenden Sie 0,5 ml für jede P8-P16 Bauchspeicheldrüse.). Lassen Sie das Rohr in einem 37 ° C Inkubator für bis zu 15 min. Drehen Sie das Rohr zwei Mal pro min. </li><li> Nach ca. 5 min, tippen Sie auf das Rohr die Verdauung Status des Pankreasgewebe zu überwachen. Weiter den Verdauungsprozess, bis die meisten der PankreasGewebe erscheint als fragmentierten Zellcluster, mit einem Durchmesser von &lt;2 mm. Das Lysat wird trüb erscheinen, die den normalen Azinuszelltumoren Autolyse zurückzuführen ist. </li></ol> 4. Lysate Waschen <ol><li> Drehen Sie das Lysat bei 500 × g für 10 s in einer Mikro. Entfernen Sie die überstehende Schicht mit einem P1,000 Pipetman. Der Überstand sollte erscheinen trübe, aber ohne Zellhaufen. verwenden aspiration nicht, die die Gewebefragmente an der Unterseite durch die Anwesenheit von etwas klebrig DNA schnell abzusaugen weg kann. </li><li> 1 ml RPMI 1640 Komplettmedium. Tippen Sie auf das Rohr sanft die fragmentierte Lysat wieder zu suspendieren. Kehren nach oben und unten 10-mal. Wiederholen Sie Schritt 4.1. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.2 zwei weitere Male oder bis der Überstand klar erscheint. Re-suspend gewaschenen Pankreas Fragmente in 1 ml komplettem RPMI 1640-Medium. </li></ol> 5. Islet Isolation HINWEIS: Bei einer kleinen Anzahl von Bauchspeicheldrüsen, direkte Handlese, wie unten (5.1) kann für die Insel isol verwendet werdenation. Für große Anzahlen von Bauchspeicheldrüsen (&gt; 6), wobei das Verfahren in 5.2 skizziert ist bevorzugt. <ol><li> Direkt Handlese: <ol><li> Übertragen Sie Lysat aus Schritt 4.3 zu einer 60-mm-Schale. In 5 ml komplettem RPMI 1640-Medium. Bringen Sie unter einem Binokular. </li><li> Stellen Sie die Hellfeldbeleuchtung auf dem Mikroskop auf. Stellen Sie die Lichtintensität auf ~ 50% der maximalen Leistung. Unter dieser Bedingung erscheinen Inseln als leicht rosa Cluster, während Acinuszellen als dunkle unregelmäßig geformte Cluster (Abbildung 1A). Eine Vergrößerung von ~ 50X (die Leistung des Objektivs zu kombinieren und das Augenteil) wird empfohlen, die beste Art und Weise zu visualisieren Inseln und die Pipettenspitze Öffnung gleichzeitig für die Kommissionierung zu bieten. </li><li> Pick-up-Inseln mit einem P20-Pipettenspitze während acinar Cluster zu vermeiden. Dispense Inselchen angereicherten Fraktionen auf eine neue 60 - mm - Schale mit RPMI Komplettmedium (1B). </li><li> Wiederholen Sie die Hand-Picking-Prozess noch zweimal. Lassen Sie rein Inseln in eine neue 60mm - Schale mit 4 ml komplettem RPMI Medium (1C). </li></ol></li><li> Gradientenzentrifugation: <ol><li> Vorbereiten eines 15 ml Zentrifugenröhrchen, die mit 2 ml Polysaccharose und Natriumdiatrizoat in einer Dichte von 1,077 g / ml vorgespannt ist. Lassen Sie das Röhrchen auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Übertragung der Suspension aus Schritt 4.3 auf der Oberseite des Polysaccharose und Natriumdiatrizoat-Lösung mit einer Pasteur-Pipette. Sie nicht die untere Schicht stören. Gewebe von bis zu 10 neu geboren oder 2 P17 Bauchspeicheldrüsen können in jede 15 ml-Röhrchen geladen werden. </li><li> Drehe das Röhrchen bei ~ 600 xg in einem Schwenkrotor für 15 min bei 4 ° C. Verwenden Bremse-Aus-Einstellungen. </li><li> Nach Zentrifugation übertragen die Medien und Zwischenphasenschichten (man beachte, dass unter idealen Betriebsbedingungen werden die Inseln in der Zwischenphase zwischen Polysaccharose und Kulturmedien nach dem Zentrifugieren befinden) in ein neues 15 ml-Röhrchen. In 10 ml Medien mischen vorsichtig , aber gründlich. </li><li> Spin down die Insel angereicherte Fraktionbei 300 xg für 5 min. Entfernen Sie die Waschmedien. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit komplettem RPMI-Medien. Resuspendieren Pellets in bis 4 ml Medien, die meist kleinen Inseln und Kanälen (Abbildung 1D) enthält. </li><li> Hand holen die kleinen Inseln, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben. </li></ol></li></ol> 6. GSIS Assays in isolierten Inseln <ol><li> Inkubieren der Inseln aus Schritt 5.1.4 in kompletten RPMI-Medium für 2 h in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette RPMI unter einem Binokular zu entfernen. In 3 ml KRB - Lösung mit 2,8 mM Glucose zu der Platte 3. Swirl 10-mal die Inseln zu waschen. Entfernen KRB-Lösungen. <ol><li> Wiederholen Sie einmal, um den Waschvorgang. Inkubieren der Inselchen mit 3 ml KRB-Lösung bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator. </li></ol></li><li> Aliquot 1 ml KRB in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Pre-warm die KRB Lager und Platte auf 37 ° C in einem Inkubator. </li><li> Waschen Sie die kleinen Inseln zweimal mit vorgewärmten KRB wie in 6.2. Transfer 10 Inselchen in jede Vertiefung der vorgewärmten Platten. Inkubieren in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Nach 45 Minuten wurden 50 ul Überstand zurücktreten. Diese enthält die Insulinlösung unter basalen Glukose ausgeschieden. </li><li> In 32 &amp; mgr; l 500 mM Glucose. Schwenken Sie die Platte 20-mal die Lösung zu mischen. Inkubieren in einem 37 ° C Inkubator. Schwenken Sie die Platte 5 mal einmal alle 5 min. </li><li> Nach 45 min zurückziehen 50 &amp; mgr; l Überstand. Dies ist das Insulin unter hohem Glucose sekretiert. </li><li> Übertragen Sie alle Inseln in ein 1,5 ml-Röhrchen. Einfrieren in -20 ° C für 30 min. Tauen Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie das Einfrieren und Auftauen Prozess. </li><li> In 0,5 ml 70% Ethanol mit 20 mM HCl. Lassen Sie über Nacht. Dies ist das Insulin links in Inselchen. </li><li> Verwenden herkömmlicher ELISA auf den Insulinspiegel Assay, zuvor beschriebenen 3. </li></ol>

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<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
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<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass für die beschriebene Arbeit keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Hier bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf Inselisolierung von Bauchspeicheldrüsen, die für konventionelle Perfusion zu klein sind. Es wird erwartet , Inselchen bereit für alle islet-basierten Untersuchungen wie beta-Zellreinigung, Genexpressionsanalyse, islet beta-Zell - Reifung, Proliferation, Zellstressreaktionen, Zellüberleben, Metabolismus und funktionelle GSIS Wartung, usw. zu ergeben. Dies wird nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen die erste detaillierte visuelle Protokoll, das neue Forsch...

Die Isolierung reiner Pankreasinseln ist essentiell für die Bestimmung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) von Betazellen und für die Inseltransplantation von Leichenspendern 1-3. Es ist auch notwendig, die endokrine Genexpression in Inselzellen zu etablieren 4, 5. Zu diesem Zweck wurden detaillierte Protokolle erstellt, die die Isolierung von Pankreasinseln aus großen Pankreasinseln ermöglichen (6 und Verweise darin). Diese Methoden basieren auf enzymatischer Perfusion zur Dissoziation von Azinus aus Inselgewebe, gekoppelt mit Gradiententrennung und Handpflückung. Somit kann die Isolierung von Inselzellen aus einer großen Bauchspeicheldrüse in den meisten Laboratorien problemlos durchgeführt werden. Auf der anderen Seite gibt es kein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das die Isolierung von Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse ermöglicht, die zu klein sind, um sie zu durchbluten.
Die Untersuchung der Genexpression und Funktion von Neugeboreneninseln ist wichtig. Neugeborene Inselzellen haben andere Eigenschaften als Erwachsene in Bezug auf Insulinsekretion und Proliferationsfähigkeit 7, 8. Die Isolierung von Inselzellen von neugeborenen Tieren, insbesondere Mäusen, ist jedoch aufgrund der geringen Größe der neugeborenen Bauchspeicheldrüse eine Herausforderung. Die Größe verhindert den üblichen Perfusionsprozess, wenn Kollagenase durch den Pankreasgang injiziert wird. In der Tat wurden in mehreren Arbeiten Studien in dieser Richtung vorgestellt, mit enzym- oder nicht-enzymgestützten Isolierungsverfahren 7, 9, 10. Es fehlt jedoch eine detaillierte Beschreibung des Prozesses der Inselisolierung mit visueller Hilfe 7, 9, was es für die meisten Forscher zu einer Herausforderung macht, ähnliche Studien durchzuführen. 
Wir haben verschiedene Bedingungen untersucht, die qualitativ hochwertige Inselzellen von neugeborenen Mäusen hervorbringen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das den Forschern helfen soll, die wichtigsten Details des Inselisolationsprozesses zu erfahren. Dieses Protokoll ist auf die Bauchspeicheldrüse der Maus bis zu einem Alter von zwei Wochen anwendbar, danach kann eine Perfusion für die routinemäßige Isolierung von Inselzellen durchgeführt werden. Islets können direkt für Insulinsekretions- und Genexpressionsassays verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS mit Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Wenn HBSS ohne Ca2+/Mg2+ erhalten wird, können CaCl2 und MgSO4 zu 1,26 bzw. 0,5 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ohne Glukose</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Glukose muss in bestimmten Mengen zugesetzt werden, um die spätere Nutzung der Inselzellen nicht zu beeinträchtigen.</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polysaccharose- und Natriumdiatrizoatlösung</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Zentrifuge 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Zentrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofugeröhrchen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Wissenschaftlich,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Schale</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Schale</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1-Mäuse</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Das Jackson-Laboratorium, Farmington, Connecticut;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>Das Jackson-Laboratorium, Farmington, Connecticut;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

effektive isolation von funktionellen inselchen von neonatal maus pancreas

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusions-basierte Inselisolierung Protokolle von großen Säugetieren Bauchspeicheldrüsen sind gut etabliert. Solche Protokolle sind in vielen Laboratorien aufgrund der großen Größe der Pankreasgang, der ermöglicht bereit Kollagenase Injektion und anschließende Gewebeperfusion leicht durchgeführt. Im Gegensatz dazu Inselisolierung von kleinen Bauchspeicheldrüsen, wie die von neugeborenen Mäusen, ist schwierig, weil die Perfusion nicht leicht erreichbar in dem kleinen pancreata ist. Hier haben wir ein detailliertes einfaches Verfahren beschreiben, die von neu geborenen Mäusen, die mit visuellen Unterstützung einer beträchtlichen Zahl von Inseln erholt. Frisch sezierte ganze Bauchspeicheldrüsen wurden mit 0,5 mg / ml Kollagenase IV in Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 ° C, in Mikrozentrifugenröhrchen gelöst verdaut. Die Röhrchen wurden regelmäßig zu unterstützen Gewebe Zerstreuung angezapft. Wenn der größte Teil des Gewebes zu kleinen Gruppen etwa 1 mm dispergiert, drei- bis viermal mit Nährmedien Lysate wurden mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), gewaschen. Islet Cluster,ohne erkennbare acinar Gewebe kann dann unter Sezieren Stereoskop zurückgewonnen werden. Dieses Verfahren gewinnt 20 - 80 kleine bis große Inseln pro Bauchspeicheldrüse von Neugeborenen Maus. Diese Inseln sind für die meisten denkbaren Downstream-Assays, einschließlich der Insulinsekretion, Genexpression und Kultur. Ein Beispiel für die Insulinsekretion Assay dargestellt, um den Isolationsprozess zu validieren. Der genetische Hintergrund und der Grad der Verdauung sind die größten Faktoren, die Ausbeute zu bestimmen. Frisch mit hoher Aktivität hergestellt Kollagenase-Lösung wird bevorzugt, da es in endokrin exokrinen Isolation hilft. Die Anwesenheit von Kationen [Calcium (Ca 2+) und Magnesium (Mg 2+)] in allen Lösungen und fötales Rinderserum in der Wasch- / Kommissionierung Medien sind notwendig für eine gute Ausbeute an kleinen Inseln mit der richtigen Integrität. Ein Binokular mit gutem Kontrast und Vergrößerung wird auch dazu beitragen.

Unter optimalen Bedingungen kann das vorgestellte Verfahren ergeben 20 - 80 Inseln aus jeder kleinen Maus Bauchspeicheldrüse. Diese Zahl hängt von dem genetischen Hintergrund, dem Alter der Mäuse, und die Größe der Inseln zurückgewonnen werden. Unter den üblicherweise verwendeten, CD1 aus gezüchtet und C57BL / 6J reinrassige Mäuse produzieren weniger Inselchen mit geringerer Größe als Hybrid zwischen CD1 und C57BL / 6 oder kommerziellen B6CBAF1 / J-Mäuse tun. Direkt Hand Kommissionierung...

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intakte Langerhans-Inseln aus dem Pankreas neugeborener Mäuse zu isolieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Entwicklung und Funktion zu beantworten, beispielsweise zur Insulinsekretion, Genexpression, parazellulären Überlebensfähigkeit und funktionellen Stabilität.Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie einfach und unkompliziert ist und dennoch neuen Forschern ermöglicht, eine beträchtliche Anzahl intakter Inseln für nachfolgende Untersuchungen zu isolieren. Beginnen Sie damit, ein Neugeborenes in Rückenlage mit 70 %igem Ethanol zu besprühen. Heben Sie dann mit einer Pinzette die Haut über dem Bauch an und schneiden Sie die Haut- und Muskelschichten längs entlang der Mittellinie von den Genitalien bis zum Brustkorb auf.Überführen Sie anschließend sämtliche inneren Organe in eine 100 cm große Schale und lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse, ein weißes, verstreutes Organ, dessen ventraler Teil am Duodenum und dessen dorsal gelegener Teil am Magen und an der Milz anhaftet. Geben Sie HBSS in die Schale, um die Organe zu bedecken, sodass das Pankreasgewebe nicht mehr am Duodenum, Magen oder an der Milz haftet. Anschließend lösen Sie mithilfe einer Pinzette die Bauchspeicheldrüse vorsichtig von dem umgebenden Gewebe ab.Überführen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine neue 60-Millimeter-Schale, die HBSS enthält, und schneiden Sie ein bis fünf Bauchspeicheldrüsen mit einer Schere in fünf Millimeter große Stücke oder kleiner. Sobald das gesamte Gewebe zerkleinert ist, überführen Sie die Stücke in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie die kollagenasehaltige Arbeitslösung zu den Proben hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Gewebefragmente bei 37 Grad Celsius, wobei Sie die Röhrchen alle Minute zweimal umdrehen.Nach fünf Minuten klopfen Sie leicht auf das Röhrchen, um den Verdauungsstatus der Gewebestücke zu überprüfen. Setzen Sie die Verdauung weitere zehn Minuten fort, bis das Lysat trüb ist und die meisten Pankreasgewebe als fragmentierte Zellverbände mit einem Durchmesser von weniger als zwei Millimetern erscheinen. Am Ende der Verdauung wird das Lysat durch Mikrozentrifugation pelletiert und das Überstandmedium vorsichtig mit einer P1000-Pipette abgenommen, das trüb erscheinen sollte, jedoch frei von Zellverbänden sein muss.Fügen Sie anschließend ein Milliliter frisches vollständiges RPMI 16/40-Medium zum Pellet hinzu. Klopfen Sie dann vorsichtig, um die fragmentierten Lysatstücke erneut in Suspension zu bringen, und drehen Sie das Röhrchen zehnmal um. Nach der Zentrifugation kehren Sie das resuspendierte Lysat mindestens zweimal erneut um, wie gerade gezeigt, bis das Überstand klar ist.Resuspendieren Sie das endgültige Pellet anschließend in einem Milliliter frischem vollständigem Medium und geben Sie zwei Milliliter Polysucrose und Natriumdiatrizoat mit einer Dichte von 1,077 g/ml in ein 15-Milliliter-Kegelrohr auf Eis. Schichten Sie den Lysat vorsichtig mit einer Pasteurpipette unter Vermeidung von Vermischung der Phasen auf die Gradientenlösung auf und trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Überführen Sie das Medium und die Inseln enthaltende Zwischenphase in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie die Inseln vorsichtig, aber gründlich, mit zehn Milliliter frischem Medium für die Zentrifugation.Nach einer zweiten Wäsche und frischem kompletten Medium resuspendieren Sie das Pellet, das Inseln und Gangstrukturen enthält, in vier Millilitern frischem kompletten Medium. Impfen Sie nun die Inseln auf eine 60-Millimeter-Schale aus und geben Sie fünf Milliliter komplettes Medium zu den Zellen hinzu. Überführen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung ein, wobei Sie die Lichtintensität auf etwa 50 % der maximalen Leistung einstellen.Bei einer 50-fachen Vergr&ouml;&szlig;erung erscheinen die Inseln als leicht rosa gef&auml;rbte Zellverb&auml;nde, w&auml;hrend die azin&auml;ren Zellen dunkle, unregelm&auml;&szlig;ig geformte Cluster bilden. Mit einer p20-Pipettenspitze werden die einzelnen Inseln abgesammelt, wobei sorgf&auml;ltig darauf zu achten ist, die azin&auml;ren Cluster zu vermeiden, und die an Inseln angereicherten Fraktionen in eine neue 60-Millimeter-Schale mit vollst&auml;ndigem Medium abgegeben. Sobald alle Inseln aus der urspr&uuml;nglichen Schale entnommen wurden, werden die Inseln aus der Sammelschale zweimal nacheinander in jeweils eine neue 60-Millimeter-Schale mit vier Milliliter frischem vollst&auml;ndigem Medium &uuml;berf&uuml;hrt, bis in der endg&uuml;ltigen Sammelschale ausschlie&szlig;lich reine Inseln vorliegen.Eine korrekte Verdauung und Isolierung führt zu Inseln mit glatten Oberflächen. Eine unzureichende Kollagenase-Verdauung kann zu großen, leicht sichtbaren Inseln führen, die nicht vollständig von den azinären Geweben getrennt werden können, was die Gesamtausbeute an Inseln verringert, obwohl größere Inseln entstehen. Bei einer Überverdauung können die azinären Gewebe zwar vollständig von den Inseln getrennt werden, doch ist die Inselstruktur anfällig für Beschädigungen, was unter dem Mikroskop zu Inseln mit rauer Oberfläche führt.Neonatale Inseln, die mit dieser Methode isoliert wurden, weisen hohe basale Insulinsekretionsniveaus sowie Glukose-stimulierte Insulinsekretionsprofile auf, die typisch für unreife Insel-Betazellen sind, was darauf hindeutet, dass dieses Isolationsverfahren weitgehend die funktionellen Eigenschaften neonataler Inseln erhält. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von nur zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Kollagenase vorzuzentrifugieren, um unlösliche Rückstände zu entfernen, sowie Calcium- und Magnesium-supplementiertes Waschpuffer zu verwenden und vorgebehandelten Waschpuffer einzusetzen, um die Gewebedissoziation schnell zu stoppen.Denn bei diesem Verfahren können wir Experimente wie die glucosestimulierte Insulinsekretion durchführen, um zusätzliche Fragen zur Dynamik der Insulinsekretion in neonatalen Beta-Zellen zu beantworten. Außerdem eröffnet diese Technik für Forscher im Bereich der Beta-Zell-Biologie neue Möglichkeiten, zusätzliche Analysen wie Genexpressions- oder andere Stoffwechseluntersuchungen durchzuführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intakte Inseln aus dem Pankreas neonataler Mäuse für Ihre nachfolgenden Studien isoliert.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Kollagenase-Pulver äußerst gefährlich ist, weshalb stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Gesichtsmaske getroffen werden sollten, wenn dieses Material verwendet wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Lernen Sie die Isolation intakter Langerhans-Inseln aus dem Pankreas neonataler Mäuse. Diese einfache Kollagenase-Methode liefert 20 bis 80 Inselcluster für Studien zur Insulinsekretion und Genexpression.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

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