Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie
24. Januar 2017
Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ & psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache Methode zur gleichzeitigen Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme und des mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im mitochondrialen Bereich zu beantworten, z. B. wie Mitochondrien als lokale Kalziumspeicher fungieren, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration streng zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl das mitochondriale Kalzium als auch das mitochondriale Membranpotenzial gleichzeitig in lebenden Zellen spezifisch gemessen werden können, ohne dass eine genetische Manipulation erforderlich ist.
Obwohl diese Methode einen Einblick in die Kalziumregulation bei der Pathologie mitochondrialer Erkrankungen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer neuerer degenerativer Erkrankungen verwendet werden, bei denen die Kalziumregulierung im Urinal von entscheidender Bedeutung ist. Bei diesem Verfahren züchten die Zellen auf zehn Zentimeter großen Zellkulturschalen oder 75-Quadratzentimeter-Kolben in Nährmedien bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Um die Zellen zu ernten, entfernen Sie das Medium durch Aspiration und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS.
Entfernen Sie anschließend PBS durch Aspiration. Fügen Sie dann 1,5 Milliliter Trypsin EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Tippen Sie dann vorsichtig auf die Schale, um die Zellen zu entfernen.
Resuspendieren Sie sie in fünf Millilitern Nährmedien. Zählen Sie anschließend die Zellen mit einem Hämozytometer. Am Tag vor der konfokalen Bildgebung werden die Zellen mit einer Konfluenz von 60 bis 70 Prozent in Schalen oder gekammerten Deckgläsern plattiert.
Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen anheften und erholen können. Bereiten Sie bei diesem Verfahren die Schallplattenfärbelösung mit TMRM, Fluo 4 AM und Tensid vor. Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern PBS.
Entfernen Sie anschließend PBS und inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang in 100 Mikrolitern Rekordfärbelösung bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend die Schallplattenfärbelösung und waschen Sie die Zellen in 100 Mikrolitern kalziumfreiem HBSS, um überschüssiges Fluo 4 AM und TMRM zu entfernen. Bereiten Sie dann die intrazelluläre Bildgebungslösung mit Digitonin, TMRM und Thapsigargin vor.
Entfernen Sie anschließend das kalziumfreie HPSS und geben Sie 300 Mikroliter IM-Bildgebungslösung zu den Zellen. Lassen Sie die Zellen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren, bevor Sie mit den Calciumchlorid-Zusätzen abbilden. Verwenden Sie eine geringe Laserleistung von ca. 5 Prozent, um Lichtschäden an den Zellen zu minimieren.
Verwenden Sie die Einstellung an den Mikroskoplasern für die Anregungs- und Emissionsspektren von TMRM und Fluo 4 AM. Verwenden Sie eine geringe Laserleistung von etwa fünf Prozent mit hoher Verstärkung, um die Lichtschäden der Zellen zu minimieren. Stellen Sie als Nächstes das Mikroskop so ein, dass alle fünfundzwanzig Sekunden Bilder gescannt werden. Scannen Sie die Zellen zehn Minuten lang, um die Basiswerte für TMRM- und Fluo 4-Signale zu ermitteln.
Unterbrechen Sie dann den Bildscanvorgang und geben Sie 3 Mikroliter 40 Millimolare Calciumchlorid-Stammlösung direkt in 300 Mikroliter IM-Bildgebungslösung zu den Zellen. Vorsichtig mit einer Pipette mischen. Achten Sie beim Hinzufügen von Kalziumlösung zu den Zellen darauf, die Schale nicht auf dem Mikroskoptisch zu bewegen.
Setzen Sie den Bildscanvorgang etwa vier Minuten lang fort. Wiederholen Sie dann alle vier Minuten die Calciumchlorid-Zusätze, bis die gewünschten TMRM- oder Fluo 4-Signale erreicht sind, normalerweise etwa acht bis zehn Zusätze. Geben Sie anschließend eine Verdünnung von 1 bis 100 Millimolar FCCP direkt zu den Zellen, um das innere Membranpotential zu dispergieren.
Dann bilden Sie die Zellen weitere fünf Minuten lang ab, bevor das Experiment beendet ist. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, bestimmen Sie die Intensität der Fluo 4- und TMRM-Signale mit der Bildanalysesoftware. Öffnen Sie dazu das Bild, klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug und wählen Sie eine Region von Interesse aus, die Mitochondrien enthält.
Mehrere interessante Bereiche können für die Messung ausgewählt werden, indem Sie Analysieren, Tools, ROI-Manager öffnen. Klicken Sie auf Hinzufügen, um den ausgewählten ROI für die Intensitätsmessung einzuschließen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis alle ROIs dem ROI-Manager hinzugefügt wurden.
Messen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der TMRM- und Fluo 4-Signale für jede Region von Interesse, indem Sie die Funktion "Mehr Multi-Measure" auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Option "Alle Segmente messen" ausgewählt und die Option "Eine Zeile pro Segment" deaktiviert ist. Klicken Sie dann auf OK, um eine Tabelle der mittleren Fluoreszenzintensität der TMRM- und Fluo 4-Signale für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.
Kombinieren Sie dann die Daten, um die durchschnittliche Intensität und Standardabweichung für die TMRM- und Fluo 4-Signale zu berechnen. In diesem Experiment wurden 143B-Zellen mit Fluo 4 AM und TMRM vorgeladen, bevor sie mit Digitonin permeabilisiert wurden. Nach jeder Zugabe von Calciumchlorid nimmt das TMRM-Signal ab, da der Einstrom von Calciumionen in die Mitochondrien das mitochondriale Membranpotential abbaut.
Nach dem Übergang der Permeabilität ist ein kleines Membranpotential erkennbar, da die Zugabe von 10 mikromolaren FCCP immer noch einen Kollaps des Membranpotentials induziert. Hier beginnt die mitochondriale Calciumkonzentration, die durch das Fluo-4-Signal angezeigt wird, nach der zweiten Zugabe von Calciumchlorid zu steigen, wenn das freie Calcium im Medium 0,32 Mikromolar erreicht. Jede nachfolgende Calciumchlorid-Zugabe führte zu einem fortschreitenden Anstieg des mitochondrialen Calciums.
Hier sind die Bilder von gleichzeitigen Messungen des Membranpotentials im mitochondrialen Kalzium zu sehen. Das rote Signal zeigt TMRM und das grüne Signal Fluo 4 an. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den mitochondrialen Kalziumspiegel und das mitochondriale Membranpotenzial gleichzeitig in der konfokalen Mikroskopie messen können, indem Sie den permeabilisierten Zellen exogenes Kalzium zusetzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit FCCP und Digitonin äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von PSA getroffen werden sollten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Messung des mitochondrialen Calciumeinstroms und des Membranpotentials in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie vor. Die Technik ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie Mitochondrien die intrazellulären Calciumkonzentrationen ohne genetische Manipulation regulieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mitochondrienforschung
Hintergrund
- Die Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle bei der Kalziumsignalübertragung.
- Das Verständnis der mitochondrialen Funktion ist wichtig für die Untersuchung verschiedener Krankheiten.
- Die Kalziumregulierung ist für die zelluläre Gesundheit lebenswichtig.
- Aktuelle Methoden erfordern häufig genetische Eingriffe, was ihre Anwendbarkeit einschränkt.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Messung mitochondrialer Funktionen bereitzustellen.
- Die Rolle der Mitochondrien als lokale Calciumspeicher zu untersuchen.
- Die Forschung zu mitochondrialen Erkrankungen und anderen degenerativen Zuständen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Die Zellen werden in geeignetem Medium bei 37 Grad Celsius kultiviert.
- Die Zellen werden geerntet und mit PBS gewaschen.
- Fluoreszenzfarbstoffe werden zur Messung der Kalziumaufnahme und des Membranpotentials verwendet.
- Die konfokale Mikroskopie wird für simultane Messungen eingesetzt.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Kalziumdynamik.
- Gleichzeitige Messung von Kalzium und Membranpotential wird erreicht.
- Die Technik kann Einblicke in die Pathologie mitochondrialer Erkrankungen liefern.
- Sie kann angewendet werden, um andere Erkrankungen im Zusammenhang mit der Kalziumregulation zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode vertieft das Verständnis der mitochondrialen Funktionen in lebenden Zellen.
- Sie bietet ein Werkzeug, um die Rolle der Mitochondrien in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
- Der Ansatz ist vielseitig einsetzbar für verschiedene Forschungsanwendungen in der Zellbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die direkte Messung der mitochondrialen Kalziumdynamik und des Membranpotentials in lebenden Zellen und liefert entscheidende Daten für die Zielvalidierung in mitochondrialen Dysfunktionswegen. Durch die Quantifizierung des kalziuminduzierten Permeabilitätsübergangs und des Verlusts des Membranpotentials unterstützt sie die mechanistische Risikominderung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit bioenergetischem Versagen. Die simultane Auswertung erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Forschung, indem Kalziumfluss und mitochondriale Gesundheit ohne genetische Manipulation miteinander verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen zur mitochondrialen Kalziumaufnahme als Regulator der zellulären Kalziumhomöostase.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung mitochondrialer Zielstrukturen in lebenden Zellen mittels fluoreszenter Nachweismethoden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem Verbindungen identifiziert werden, die die kalziuminduzierte Permeabilitätsübergangsreaktion modulieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Fertigkeit: Bereitet permeabilisierte Zellen mit Fluo-4 AM und TMRM für die quantitative, gleichzeitige Detektion von Calciumaufnahme und Membranpotential vor.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet sequenzielle Zugaben von Calciumchlorid, um Dosis-Wirkungs-Kurven zur Bestimmung der Permeabilitätstransitionsschwelle zu erzeugen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Plattformen der konfokalen Mikroskopie für die Anpassung an Mehrbradenformate und die intensitätsbasierte Analyse basierend auf definierten Bildbereichen (ROI).
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Modelliert einen mitochondrialen Calciumüberladungszustand, der für die Neurodegeneration und ischämische Verletzungen relevant ist.
- Translationale Kontinuität: Verbindet akute Messungen des Calciumflusses mit chronischen Funktionsstörungen in präklinischen Modellen mitochondrialer Erkrankungen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Studien basierend auf der Calcium-Retentionskapazität und der Stabilität des Membranpotentials.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Zielstrukturenbindung bis zur funktionalen Validierung ein, insbesondere für Signalwege, die die mitochondriale Kalziumregulation und oxidativen Stress beinhalten.
- Entdeckungsbiochemie: Untersucht, wie Störungen die mitochondriale Kalziumpufferung und die Kopplung des Membranpotentials beeinflussen.
- Screening: Ermöglicht quantitative fluoreszierende Messungen, um die Wirkung von Substanzen auf die kalziuminduzierte Depolarisation zu vergleichen.
- Analytik: Liefert Mittelwerte und Standardabweichungen der Intensität der Fluo-4- und TMRM-Signale über verschiedene Zeitpunkte und definierte Bildbereiche (ROIs).
- Translationale Forschung: Verbindet akute Ereignisse der Permeabilitätsübergänge mit anhaltenden bioenergetischen Dysfunktionen in Krankheitsmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Testplattform für die mitochondriale Sicherheitspharmakologie und die Risikominderung bei Zielstrukturen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem Kalziumeinstrom direkt mit der Depolarisation des Membranpotenzials korreliert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Messung durch den Einsatz von ratiometrischen Farbstoffpaaren und schrittweisen Kalzium-Belastungstests.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem mitochondriale Schwachstellen bereits in der frühen Optimierung von Wirkstoffkandidaten identifiziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf der Kalziumspeicherkapazität und der Anfälligkeit für permeabilitätsvermittelte Übergänge.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung, der Beladung mit Farbstoffen und Permeabilisierungsprotokollen voraus.
- Benötigt eine konfokale Mikroskopie mit geeigneten Laser-Einstellungen für die Anregung und Emission von TMRM und Fluo-4.
- Erfordert eine Standardisierung der Herstellung von calciumfreiem HBSS und der Lösung für die intrazelluläre Bildgebung über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Zelltypen und mitochondriale Dichten.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie das Risiko einer Phototoxizität durch Laserbestrahlung sowie das Auslaufen der Farbstoffe nach der Permeabilisierung.
