Name: Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Lernen Sie die simultane Messung von mitochondrialem Calcium und Membranpotential in lebenden Zellen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen ohne genetische Manipulation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Dr. Kirstin Elgass und Dr. Sarah Credo von der Monash Micro Imaging für die technische Unterstützung und den Wellcome Trust und Medical Research Council in Großbritannien für die finanzielle Unterstützung. MMcK ist das Australian Research Council Zukunft Fellowship Scheme (FT120100459), die William Buckland-Stiftung, die australische Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), der Hudson-Institut für Medizinische Forschung und Monash University unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Regierung von Victoria Operational Infrastruktur Support Scheme unterstützt.

1. Herstellung von Zellen <ol><li> Wachsen Zellen auf 10 cm Zellkulturschalen oder 75 cm 2 -Kolben in Kulturmedium [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) , ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 x Penicillin / Streptomycin (P / S )] bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Um Zellen ernten, entfernen Medien durch Absaugen, dann waschen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS). Entfernen 1x PBS durch Absaugen, dann wurden 1,5 ml 0,25% addieren (w / v) Trypsin / 0,25% (w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und inkubiere bei 37 ° C / 5% CO 2 für 2 min. Tippen Sie Teller oder Kolben sanft Zellen zu entfernen, dann Resuspendieren in 5 ml Kulturmedien. </li><li> Zählen von Zellen durch Zugabe von 12 ul resuspendierten Zellen auf einem Hämozytometer. </li><li> Platten-Zellen in Schalen oder chambered Deck für die konfokale Bildgebung. ANMERKUNG: Diese werden eine geeignete Kunststoff- oder Glasboden haben, der für die Verwendung mit inverse Mikroskope konzipiert wurde. </li><li> Plattenzellen so thbei ~ 80% Konfluenz am Tag der Bildgebung erreicht. Beispielsweise etwa 2 x 10 &amp; sup4 ; 143B Osteosarkomzellen können in einer Vertiefung eines 8-Well - Kammerobjektträger einen Tag vor der Abbildungs plattiert werden. </li><li> Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2 an Zellen ermöglichen , zu befestigen und zu erholen. </li></ol> 2. Puffer für TMRM und Fluo-4 Imaging <ol><li> Prepare Record Solution (RS) , enthaltend 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES pH 7,35. Shop RS in Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Vorbereitung intrazelluläres Medium (IM) , enthaltend 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl 2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl 2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM Malat, 2 mM Glutamat, 2 mM ADP und 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mM Stammlösungen von Malat, Glutamat und ADP getrennt, aliquotiert und bei -20 ° C hergestellt werden. Diese stocks kann kurz vor dem Gebrauch mit dem IM hinzugefügt werden. </li><li> Ca 2+ frei können Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) erhalten werden von kommerziellen Anbietern vorbereiteten. Hinzufügen, Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraessigsäure (EGTA) in einer Endkonzentration von 500 uM. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM) in 100% Methanol. Von diesem Lager, machen eine Arbeits Bestand von 2 uM in destilliertem H 2 O </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Verapamil in 100% Ethanol. </li><li> Bereiten Sie eine 1 mg / ml (w / v) Stammlösung von Fluo-4 Acetoxymethylester (Fluo-4, AM) in Dimethylsulfoxid (DMSO). HINWEIS: Fluo-4, AM ist ein Kalzium - Indikator, der Fluoreszenz bei der Bindung Ca 2+ erhöht aufweist. Fluo-4 ist ein Analogon von Fluo-3, mit den beiden Chlorsubstituenten durch Fluoratome ersetzt. Dies führt zu einer erhöhten Fluoreszenzanregung bei 488 nm und eine höhere Fluoreszenzsignalpegel. DasAM Estergruppe führt zu einer ungeladenen Fluo-4-Molekül, das die Zellmembranen durchdringen kann. Einmal in der Zelle, wird der AM-Ester durch unspezifische Esterasen gespalten, was zu einer geladenen Form von Fluo-4, die in der Zelle eingeschlossen ist. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM carbonyl Cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% igem Ethanol. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 25 mg / ml (w / v) Digitonin in destilliertem H 2 O </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 uM Thapsigargin in DMSO. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 40 mM Calciumchlorid (CaCl 2) in destilliertem H 2 O </li></ol> 3. Anfärben von Zellen mit TMRM und Fluo-4, AM <ol><li> Vorzubereiten RS Färbelösung mit 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM und 0,005% Tensid, wie Pluronic F-127 in RS. HINWEIS: Dieses Tensid ist ein nicht-ionisches Polyol, das die Solubilisierung von Fluo-4, AM erleichtert. Anmerkung: 10 uM Verapamil können auch hinzugefügt werden, um inhibit TMRM Export durch die Plasmamembran Multidrug-Transporter wenn es in der Zelltyp exprimiert wird analysiert. </li><li> Entfernen Kulturmedien von Zellen mit einer Pipette und waschen mit 100 ul 1x PBS. </li><li> Entfernen 1x PBS pipettiert und inkubieren Zellen in 250 &amp; mgr; l RS Färbelösung für 45 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Nachdem die Fluo-4, AM in die Zelle eindringt, die AM-Ester durch zelluläre Esterasen gespalten wird. Inkubieren bei Raumtemperatur hemmt Esterase-Aktivität, so dass Fluo-4, AM die Mitochondrien zu betreten. </li><li> Entfernen RS Färbelösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen in 100 &amp; mgr; l Ca 2+ freies HBSS Überschuss Fluo-4, AM und TMRM zu entfernen. </li><li> Bereiten Sie IM Imaging-Lösung mit 25 ug / ml (w / v) Digitonin, 200 nM TMRM und 1 uM Thapsigargin in IM. HINWEIS: Die Konzentration von Digitonin müssen diese Permeabilisierung der mitochondrialen inneren Membran sicherzustellen angepasst werden nicht auftritt. Dies kann empirisch bestimmt werden, indem die Intensität der Beurteilungdes TMRM Signals bei verschiedenen Konzentrationen von Digitonin. </li><li> Entfernen Sie die Ca 2+ freies HBSS mit einer Pipette und 300 ul IM Imaging - Lösung zu den Zellen. Lassen Zellen für 10 min bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Zellen sind nun bereit für die Bildgebung mit CaCl 2 Ergänzungen. </li></ol> 4. Cell Imaging <ol><li> Legen Gericht oder chambered Deckglas mit Zellen in IM Imaging-Lösung auf einem invertierten Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. </li><li> Verwendung auf dem Mikroskop-Laser-Einstellung für die Anregungs- und Emissionsspektren von TMRM und Fluo-4. Verwenden Sie zum Beispiel 543 nm He-Ne und 473 nm Argon-Laser Linien TMRM und Fluo-4 bzw. zu erregen. Verwenden Sie eine niedrige Laserleistung von ca. 5% ein beliebiges Foto-Schäden an den Zellen zu minimieren. </li><li> Stellen Sie Mikroskopbilder alle 25 Sekunden zu scannen. Scan-Zellen für 10 min herzustellen Basisablesungen für die TMRM und Fluo-4-Signale. HINWEIS: Die Fluo-4-Signal bei ruhenden Kalzium concent schwach oder nicht nachweisbar seinVerpflegung. </li><li> In 3 ul 40 mM CaCl 2 Stammlösung direkt auf die Zellen in 300 ul IM Imaging - Lösung (eine 1: 100 - Verdünnung) und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Pause , um die Bildabtastung während das Hinzufügen und die CaCl 2 bei Bedarf mischen. HINWEIS: Die endgültige können freie Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] in der IM - Imaging - Lösung mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC berechnet werden VERLÄNGERT ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) oder Chelator 11. Eine detaillierte Beschreibung, wie die letzte freie Ca 2+ -Ionen - Konzentration zu berechnen [Ca 2+] wird in Abschnitt 6 weiter unten beschrieben. </li><li> Weiter Bildabtastung für ca. 4 min, dann wiederholen CaCl 2 Ergänzungen alle 4 min , bis die gewünschte TMRM oder Fluo-4 Signale erreicht werden, in der Regel um 8 bis 10 Ergänzungen. </li><li> Mit einer Pipette, fügen Sie eine 1: 100 Verdünnung von 1 mM FCCP (endgültige cONZENTRATION von 10 &amp; mgr; M) direkt zu den Zellen ΔΨ m abzuleiten. Bildzellen für weitere 5 min. Das Experiment ist nun abgeschlossen. </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, bestimmen die Intensität der Fluo-4 und TMRM Signale Bildanalyse-Software unter Verwendung beispielsweise ImageJ Software mit dem Bio-Formats Plugin (download &#39;bioformats_package.jar&#39; von http://downloads.openmicroscopy.org/bio -Formate / und speichern sie es in der &quot;C: Program Files ImageJ plugins&quot; Ordner). </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei (zum Beispiel eine .OIF-Datei) in ImageJ. Klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug und wählen Sie eine Region of Interest (ROI), die Mitochondrien enthält. Verwenden Sie das anfängliche TMRM Signal den ROI zu wählen. </li><li> Open &#39;Analysieren&gt; Tools&gt; ROI-Manager&#39;, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, um die ausgewählte ROI zur Intensitätsmessung einzubeziehen. Multiple ROIs können auf einem einzigen Bild für die Messung ausgewählt werden. Wiederholen Sie vorherigen Schritte, bis alle ROIs wurden dem ROI-Manager hinzugefügt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Mehr&gt; Multi Measure&quot;, stellen Sie sicher, dass &quot;alle Scheiben messen&quot; ausgewählt ist, und dass &quot;eine Zeile pro Scheibe &#39;deaktiviert ist, und klicken Sie auf&quot; OK &quot;, eine Tabelle der mittleren Fluoreszenzintensität der TMRM und Fluo-4 Signale zu erhalten, für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Verwenden von Daten aus allen ROIs die mittleren Intensitäten und Standardabweichung für die TMRM und Fluo-4 Signale zu berechnen. </li></ol> 6. Berechnung der letzten freien Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] <ol><li> Die freie Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] in der IM - Imaging - Lösung kann mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC VERLÄNGERT (bestimmt werden <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> 11) oder Chelat. Sie können beispielsweise die Variablen in WEBMAXC VERLÄNGERT wie folgt: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, Stärke Ionic = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M und Mg 2+ = 0,0078 M. Dies führt zu einem Endgehalt an freiem Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] i von 62 nM . Beachten Sie, dass diese Programme nicht berücksichtigt jede Variable annehmen kann, wie beispielsweise Reagenz Reinheit, die Genauigkeit der Messungen und die pH-Bestimmung. Die genaueste Methode für die freie Ca 2+ Konzentration bestimmen , ist eine kalibrierte Ca 2+ selektive Elektrode zu verwenden. </li></ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Calcium spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellprozessen, einschließlich Muskelkontraktion, neuronaler Signalgebung und Zellproliferation 13. Erhöhungen der Zelle Calciumkonzentrationen sind oft mit Energiebedarf verbunden sind , mit Kalzium können direkt mitochondriale oxidative Phosphorylierung zu stimulieren ATP Generation 3 zu erhöhen. Es ist daher wichtig, dass wir die Fähigkeit, effektiv überwachen mitochondriale Calciumakkumulation und der Lage sein, zu vergleiche...

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle intrazelluläre Ca2 + -Konzentration in der Regulation von 1 als lokale Ca 2+ Puffer wirken. Ca 2+ tritt in die Mitochondrien über das Ca 2+ Uniporter, ein Verfahren , mit dem elektrochemischen Gradienten angetrieben, der über den inneren Mitochondrienmembran (ΔΨ m) 2 existiert. Einmal in der mitochondrialen Matrix, Ca 2+ kann die oxidative Phosphorylierung aktivieren , indem drei geschwindigkeitsbegrenzenden stimulierenden Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus 3. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wenn der Ca 2+ -Konzentration in den Mitochondrien sehr hoch wird, kann mitochondrial permeability transition eingeleitet werden, was zur Dissipation von ΔΨ m, die cessation der oxidativen Phosphorylierung und die Induktion von Zelltod - Signalwege 4. Die wichtige Rolle, die Mitochondrien in der räumlichen Pufferung von zellulären Kalzium spielen macht die genaue Überwachung der mitochondrialen Kalzium kritisch. Es wurden verschiedene Verfahren etabliert mitochondrialen Calcium zu überwachen, einschließlich der Verwendung von Rhodamin-basierte Farbstoffe. Ein solcher Farbstoff, Rhod-2, AM, ist sehr effektiv bei der Aufteilung in die Mitochondrien mitochondrialen Ca 2+ -Spiegel 5 zu messen, 6. Jedoch muss darauf verwendet werden, wie einige Farbstoff in anderen Organellen, wie Liposomen ansammelt, oder verbleiben in der Zell-Cytosol. Dennoch können Downstream - Analysen 7 diese Signale von den aus den Mitochondrien zu unterscheiden , eingesetzt werden. Eine andere Technik zur mitochondrialen Kalzium Monitor nutzt fluoreszierende Reporterkonstrukte 8 </s<html> up&gt;. Der Vorteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie gezielt durch die Verwendung endogener N-terminalen Peptide in die Mitochondrien ziel werden, beispielsweise die N-terminale Targeting-Signal des menschlichen COX-Untereinheit VIII. Dieses System wurde verwendet , um eine mitochondriale gezielte Aequorin Sonde zu erzeugen , die extrem nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium erwiesen hat Signalisierungs 9. Der Hauptnachteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie in die Zellen durch transiente Expression eingeführt werden müssen (was nicht durchführbar für bestimmte Zelltypen und unterschiedliche Ergebnisse produzieren kann) oder durch stabile Expressionssysteme zu schaffen (was zeitaufwändig). Um die Probleme zu umgehen oben dargelegt, haben wir ein neues Protokoll zur Messung der mitochondrialen Ca2 + und ΔΨ m gleichzeitig entwickelt. Dieses Protokoll basiert auf einem vorher beschriebenen Verfahren, die permeabilisierten Zellen exogene Calcium fügts = &quot;xref&quot;&gt; 10. Unser Protokoll hat drei wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden: Zum einen nutzen wir Fluo-4, AM und TMRM mitochondrialen Ca 2+ zu überwachen und ΔΨ m, zwei Farbstoffe , die sehr unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen; Zweitens werden die Zellen permeabilisiert so daß der Fluo-4 - Signal nur mitochondrialen Ca 2+ und Ca 2+ nicht an andere Organellen oder Zell - Cytosol lokalisiert ist , zu erfassen; und drittens, die Verwendung von Fluo-4 zu mitochondrialen Ca 2+ erkennen ermöglicht eine schnelle und einfache Zellfärbung, negiert alle Zelle Transfektion oder Transformation Probleme, die bestehen , wenn genetisch kodierte Sonden verwendet.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin/Streptomycin (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/0,25 % EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>8-Well-Deckglas</td><td>mit Kammer ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ frei Hank' s gepufferte Salzlösung (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4-Acetoxymethylester (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanid p-Trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Zellkulturschalen</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Zellkulturflaschen</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

simultane messung von mitochondriale calcium und mitochondrialen membranpotentials in lebenden zellen durch fluoreszenzmikroskopie

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Abgesehen von ihrer wesentliche Rolle bei der ATP zu erzeugen, Mitochondrien wirken auch als lokale Calcium (Ca 2+) Puffer zu eng regulieren intrazelluläre Ca2 + -Konzentration. Dazu nutzen Mitochondrien das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (ΔΨ m) zu sequestrieren Ca 2+. Der Zustrom von Ca 2+ in die Mitochondrien stimuliert drei geschwindigkeitsbestimmend Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus, Erhöhung der Elektronentransfer durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Komplexe. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen konfokalen Mikroskopie. Durch die Permeabilisierung der Zellen, Mitochondrien - Ca 2+ kannVerwendung der fluoreszierenden Ca 2+ Indikator Fluo-4, AM, gemessen werden mit der Messung der ΔΨ m den Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin Verwendung von Methylester, Perchlorat (TMRM). Der Vorteil dieses Systems ist , dass es sehr wenig spektrale Überlappung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen, so dass eine genaue Messung der mitochondrialen Ca 2+ und ΔΨ m gleichzeitig. Verwendung der sequentiellen Zugabe von Ca 2+ Aliquots können mitochondriale Ca 2+ -Aufnahme überwacht werden, und die Konzentration , bei der Ca 2+ mitochondrialen Membranpermeabilität Übergang und den Verlust von ΔΨ induziert m bestimmt.

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Auswirkungen einer MT-ND5 Mutation auf die Fähigkeit der Zelle 143B Mitochondrien zu untersuchen Erhöhungen 12 Calcium zu puffern. In dem hier gezeigten Beispiel wurden Kontroll 143B Zellen beladen mit TMRM und Fluo-4, AM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Nach 5 min der Bildgebung, acht aufeinanderfolgende Zugaben einer 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl 2 exogene hergestellt wurden, mit der letz...

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache Methode zur gleichzeitigen Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme und des mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitochondrien zu beantworten, beispielsweise wie Mitochondrien als lokale Kalziumspeicher wirken, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration präzise zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sowohl das mitochondriale Kalzium als auch das mitochondriale Membranpotential spezifisch und gleichzeitig in lebenden Zellen gemessen werden können, ohne dass eine genetische Modifikation erforderlich ist.Obwohl diese Methode Einblicke in die Kalziumregulation bei mitochondrialen Erkrankungen ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung anderer neuartiger degenerativer Erkrankungen einsetzen, wenn die kalziumregulatorischen Vorgänge im Urin von entscheidender Bedeutung sind. Züchten Sie die Zellen in diesem Verfahren auf zehn Zentimeter großen Zellkulturschalen oder 75 Quadratzentimeter-Flaschen in Kulturmedium bei 37 Grad Celsius über einen Zeitraum von 24 S

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Mitochondrien-Fusion wurde durch das Verfolgen der Äquilibrierung von photokonvertiertem Matrix-bezogenen GFP über die mitochondriale Netzes über die Zeit gemessen. Bisher konnte nur eine Zelle zu einer Stunde lange kinetische Analyse bei einer Zeit unterworfen werden. Wir präsentieren eine Methode, die misst gleichzeitig mehrere Zellen und beschleunigt so den Prozess der Datensammlung.

Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

Dieses Video beschreibt einen auf Plattenlesern basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien. Der Assay analysiert das Fluoreszenzsignal eines kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, um die Kinetik der mitochondrialen Kalziumaufnahme und der Kalziumüberladung zu untersuchen.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf konfokaler Mikroskopie basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in kultivierten Zellen. Der Assay verwendet den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhod-2/AM zur Messung des mitochondrialen Calciums in permeabilisierten kultivierten Zellen.

Calcium-Influx-Assay zur Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme in kultivierten Zellen

Das Video zeigt die gleichzeitige Messung des intrazellulären Kalziumspiegels und der Veränderungen des Membranpotentials in Endothelzellen von Hirnarteriensegmenten von Mäusen. Die isolierte Endothelröhre wird mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator beladen und mit einem Medikament behandelt, das die intrazelluläre Kalziumfreisetzung induziert, was zu einer Änderung des Membranpotentials führt. Die Fluoreszenz des Indikators ermöglicht die Messung des Kalziumspiegels, und eine...

Gleichzeitige Messung des intrazellulären Calcium- und Membranpotentials in einem zerebralen Endothel der Maus

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca2 + Import Assay mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca2 + Farbstoffs Rhod-2/AM.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

Lernen Sie die simultane Messung von mitochondrialem Calcium und Membranpotential in lebenden Zellen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen ohne genetische Manipulation.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Weitere Videos entdecken