Name: Die Prüfung der Host-Phänotypen in Gambusia affinis Nach der Behandlung mit Antibiotika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Antibiotikabehandlung bei Gambusia affinis die Haut- und Darmmikrobiomzusammensetzung verändert und physiologische Phänotypen beeinflusst. Diese kostengünstige Methode ermöglicht nichtinvasive Störungen des Mukosalmikrobioms.

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Dieses Projekt wurde teilweise durch einen FAST (Faculty and Student Team) Award an TPP und JMC von EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) an der Sam Houston State University finanziert.

Alle Tierversuche wurden unter Genehmigung von IACUC Protokolle durchgeführt, nummeriert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 und 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, Handhabung und Ethical Pflege <ol><li> Sammeln Sie Gambusia affinis aus dem Feld Website (Bestimmungsführer bei http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) mit einem kleinen Kescher und Platz in 19 L Eimer mit. Verwenden Sie visuelle Inspektion Arten zu identifizieren. </li><li> Rest Fisch für 1 bis 2 d in einem Eimer mit Teichwasser. Danach übertragen Fisch in 76 oder 189 Tanks L Aquarium gefüllt mit Halbteichwasser / Halbleitungswasser bei 25 ° C, belüftet mit einer sprudelnden airstone. Mit einem kleinen Kescher, wenn der Fisch Handhabung als minimal, um ihre Haut microbiome stören. HINWEIS: Fischdichte sollte nicht höher sein als 20 Fische / 38 l Aquarienwasser. Die Fische werden für mindestens 5 d vor dem Experiment in das Aquarium akklimatisiert. </li><li> Feed-Fisch auf einer täglichen Gabe mit 5 mg Flockenfutter pro Fisch. Hold Fisch mit einem 12 h Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. </li></ol> 2. Initial Antibiotika Exposition für alle Experimente <ol><li> Zeichnen Sie alle Fische aus jedem Experiment aus dem gleichen Aquarium, legen Sie in zwei getrennte Gruppen (behandelt: ausgesetzt Antibiotikum &amp; Kontrolle: unbelichtet) in 19 L Eimer. Frühere Daten zeigt gesammelt, dass die Fische in der gleichen Aquarium haben Haut microbiomes homogenisiert, die wenig Variation in der Gemeinschaft Zusammensetzung haben. 12 </li><li> Bei Versuchen, halten Fisch in 2 l künstlichen Teichwasser (APW; 0,33 g / l CaCl 2, 0,33 g / l MgSO 4, 0,19 g / l NaHCO 3) , die im Autoklaven vor dem Gebrauch sterilisiert wird. </li><li> Bereiten Sie die Rifampicin Antibiotika-Stammlösung durch Zugabe von 50 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO). Rifampicin ist ein repräsentatives Breitspektrum-Antibiotikum, das für die Fische nicht toxisch ist. Bei Menschen und Mäusen, es verteilt sich gut in den Geweben. </li><li> Von der Rifampicin Lager verwalten eine endgültigeKonzentration von 25 ug / ml in 2 l APW für antibiotische Exposition der 3 Tage Fischgruppe behandelt. Beachten Sie, dass nach 3 d, kultivierbaren Haut Bakterienzahlen, die der vorbehandelten Fischhaut ähnlich zurückzukehren. </li><li> Parallel dazu halten eine Gruppe von unbehandelten Fischen in APW und geben eine äquivalente Menge von DMSO (0,5 ml pro Liter APW) in die Wassersäule als Kontrollgruppe zu handeln. </li><li> Wie Versuche sollen Wirkungen eines Antibiotikums veränderten microbiome auf Fisch Phänotypen zu messen, um Effekte direkt aus dem Antibiotikum selbst zu vermeiden, nach der dreitägigen Antibiotika-Exposition (oder Kontrolle) Zeit, Transfer Fisch in einen Eimer mit 2 l frisch APW. <ol><li> Verwenden Sie eine 10 h Ruhezeit so das Antibiotikum durch die Körper der Fische entfernt wird. Basis dieser Eliminationszeit auf Experimente, in denen Fische für drei Tage auf 25 ug / ml Antibiotikum ausgesetzt waren. Euthanize die Fische durch das Rückenmark von Schlacht gefolgt schnippeln, homogenisieren dann den ganzen Körper eine Gewebemühle verwendet wird.</li><li> Bestimmen Sie Antibiotikum Anwesenheit von 50 &amp; mgr; l dieser Suspension nach 0,2 &amp; mgr; m-Filterung in der Mitte einer Agar-Petrischale platzieren. Machen Sie ein Loch für diese Suspension durch ein auf dem Kopf nach unten drücken sterilen 200 ul Pipettenspitze in den Agar, die einen kleinen Stecker entfernt. </li><li> Verwenden Sie Agarplatten mit 20 ml gemessenes Volumen von Nähragar und gleichmäßig verteilt ein Wattestäbchen mit einem Indikatororganismus, Bacillus subtilis, die Rifampicin empfindlich ist. Beziehen Sie die B. subtilis aus einem Nähragar bei 25 ° CO / N inkubiert und das Wattestäbchen mit einer Kolonie zu erhalten. bei 25 ° C eine Hemmzone nach Inkubation über Nacht Beobachtung zeigt das Vorhandensein von Antibiotika in den Fischgeweben. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extraction <ol><li> Extrahieren einer Haut microbiome Probe aus der äußeren Schleimhaut Epidermis durch den Fisch in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml sterilem PBST (137 mM Na gefüllt PlazierenCl, 10 mM Phosphat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) Lösung und Vortexen bei einer Einstellung von 10 für 1 min mit 10 s Pausieren Inkrementen. Waschmittel und Salz im Puffer fördert eine gleichmäßige Dispersion von Bakterien in der Lösung. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit 0,85% Kochsalzlösung gefunden, aber senkte Bakterienzahlen mit reinem Wasser. </li><li> Bringen Sie den Fisch aus dem konischen Rohr zu einer Erholung Eimer. Die Letalität der Haut Extraktion ist in der Regel weniger als 10%. Entweder, analysieren die Bakteriensuspension in dem Rohr unmittelbar nach Extraktion oder die Bakterien durch einen 2 min Spin in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 15.000 × g und bei -80 ° C für eine spätere Analyse pelletieren. HINWEIS: Alle Kultur und biochemische Analysen sind unmittelbar; DNA oder Proteinextraktion aus gefrorenen Proben sein. </li><li> Um eine gut microbiome Probe zu erhalten, legen Sie zuerst die Fische in eine sterile Petrischale. Euthanize die Fische durch den zervikalen Rückenmark direkt hinter dem Kopf mit chirurgische Scheren Trennen, gefolgt von SchlachtUnd dann sterilisieren extern den Körper mit 70% Ethanol wischt. </li><li> den gesamten Darm nach der Sektion, zu entfernen, nachdem der Speiseröhre und vor dem After durch Schneiden. </li><li> Schneiden Sie den Darm in kleine Abschnitte 1 bis 2 mm in der Länge und legen Sie alle Abschnitte in zwei ml PBST-Lösung in einem konischen Rohr. Nach Vortexen für 1 min, entfernen Überstand in ein anderes sauberes Röhrchen (Vorsicht, um nicht die Darmabschnitte aufstellen). HINWEIS: Der Überstand enthält extrahiert Darmbakterien, die entweder für Hautproben erwähnt durch die bisherigen Verfahren für die direkte Analysen oder pelletiert werden. </li></ol> 4. Infektion Modellvorbereitung und Bad eines spezifischen Pathogen <ol><li> Erhalten infektiösen Stamm von Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) und halten Sie die Kultur bei -80 ° C gelagert. Der Stamm 93-146 in dieser Studie verwendet wurden, isoliert von einem infizierten Wels, wurde von Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University erhalten. </li><li> streak E. ictaluri Lager auf ein selektives &amp; Differential Medien genannt E. ictaluri Medien (EIM) Agar 19 zur Kultur der Bakterien und bei 27 ° C für 2 d inkubiert. </li><li> Übertragen einer rein isolierten Kolonie aus der Kultur und impfen einen 150-ml-Kolben, die 40 ml Nährbrühe (NB; 5 g / l Pepton, 4 g / l Fleischextrakt). Danach wird der Kolben in einem Schüttler bei 150 Umdrehungen pro Minute eingestellt für 2 d bei 27 ° C. </li><li> Nach der Inkubation wird eine Probe der Kultur in PBST zu einem Spektrometer Lesen von OD 0,2 bei 650 nm verdünnt für gewünschte Infektionsdosisvolumina E. ictaluri Kultur zu kalibrieren. </li><li> Als nächstes Transfer beide behandelt (nach 3 d der Antibiotika-Exposition) und unbehandelten Fischgruppen in einzelne Plastikbecher, die 130 ml frischem künstlichen Teichwasser oder APW für ca. 10 h für Arzneimittel-Clearance von Fischgewebe. </li><li> Dann aus beiden Gruppen, Transfer wieder jeden Fisch in 8-Unzen-Plastikbecher, die 130 ml sauber APW. </li&gt; <li> Geben Sie jedem Fisch eine tödliche Dosis enthält 2,8 x 10 6 KBE / ml E. ictaluri Kultur in die APW (Bad Infektionsmodell) und halten in einem 27 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Nach dem E. ictaluri Bad, übertragen die Fische einzeln in neue Becher mit 130 ml APW. </li><li> Nach Wasseraustausch, Rekordfischsterblichkeit über die Dauer von einer Woche. Die Fische werden nicht über diesen Zeitraum zugeführt. Im Gegensatz zu Wels, zeigen Gambusia keine äußeren Anzeichen einer Infektion, daher ist es wichtig , die Letalität als experimentelle Endpunkt zu verwenden. </li></ol> 5. polymikrobiellen Herausforderung mit Exkremente &amp; Boden <ol><li> Exkremente Behandlung <ol><li> Erhalten Sie frische menschliche Fäkalien von einem gesunden Freiwilligen unterworfen, die Antibiotika in den letzten zwei Wochen mit sterilen Handschuhen und einer sterilen 50 ml konischen Röhrchen nicht erhalten hat. </li><li> Nach dem Sammeln, sammeln Fäkalien in einem sterilen Beutel aus Kunststoff und übertragen dann in ein steriles 15 ml conical Rohr. Erstellen Sie eine Stammkonzentration von Kot in PBST zu geben, um eine Stammlösung von 500 suspendiert - 800 mg / mL. Diese dicke Mischung ist am besten eine 1 ml oder mehr Kunststoff-Pipettenspitze zu übertragen verwenden, die an der Unterseite mit einer sterilen Schere geschnitten wurde, so dass die Öffnung größer ist. </li><li> Nach anfänglichen Antibiotika-Exposition von behandelten und unbehandelten Fischgruppen steuern, getrennt in einzelne Plastikbecher Fäkalsuspension bei Endkonzentrationen von entweder 15 mg / ml oder 10 mg / ml in APW mit einem Gesamtvolumen von 130 ml enthält. Halten cups in einem Inkubator bei 25 ° C. </li><li> Nehmen Sie die Fischsterblichkeit während fäkale Belastung durch genaue Beobachtung über 2 d. </li></ol></li><li> Bodenbehandlung <ol><li> Sammeln Sie 1 bis 2 kg reichen organischen Krume (sollte die höchste Dichte und Vielfalt der Mikroben enthalten) ca. 7-15 cm nach unten in der Tiefe und in einen sauberen Plastikbehälter. Beachten Sie, dass der Boden sollte innerhalb von zwei Tagen nach der Gewinnung verwendet werden. </li><li> schrecklichctly nach der anfänglichen Belichtungsperiode, trennen die beiden Gruppen von Antibiotikum behandelten und unbehandelten Fisch in einzelne Plastikbecher 18,2 g Boden in 130 ml APW enthält. Mischen Sie den Boden im Wasser gut mit der Hand vor dem Hinzufügen des Fisches. Die meisten der Teilchen nicht suspendieren und am Boden des Bechers zu bleiben. </li><li> Expose Fisch für eine Dauer von 3 d bei 25 ° C und jede Sterblichkeit aufzuzeichnen. </li></ol></li></ol> 6. osmotischer Stress Herausforderung <ol><li> Nach der Behandlung durch eine 10 h Ruhezeit gefolgt, wie oben beschrieben, individualisieren Fisch in einzelne Tassen, enthaltend NaCl bei 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 ml APW. Das ist die Hälfte des typischen Salinität des Meerwassers, die nicht vollständig tödlich (&lt;50%) zu steuern Fisch ist, sondern stark belastend und erfordert wirksame osmoregulation. </li><li> Beachten Sie für die Fischsterblichkeit über eine Dauer von 36 Stunden. </li></ol> 7. Nitrat Toxizität Herausforderung <ol><li> Rest Fisch für eine 10-h-Zeitraum nach einer Antibiotika-Exposure, und dann trennen Fisch in einzelne Schalen einer Natriumnitratkonzentration von entweder 10 mg / ml (118 mM) oder 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 ml APW enthält. </li><li> Die Bilanz für die Mortalität über 4 d für niedrige Dosis und 1 d für hohe Dosis. </li></ol> 8. Wachstumsanalyse von Fisch Individualisierte oder gruppierte <ol><li> Complete 3 d Antibiotika Exposition oder Kontrollperiode als Gruppen in Eimern. </li><li> Für einzelne, füllen 8-Unzen Styroporbecher mit 150 ml APW jeder Transfer eines einzelnen Fisches in die Tasse und Rekord für die Erstprüfung Gesamtkörpergewicht. <ol><li> Wiederholen Sie dies für alle Arten von Fisch in den beiden behandelten und unbehandelten Gruppen. Verwenden Sie weiße Styroporbecher, anstatt klare Plastikbecher, weil Fische nicht essen, wenn sie in den klaren Tassen. </li></ol></li><li> Fische füttern täglich mit der Standard-Diät von zwei Pellets pro Fisch. Die Pellets wurden eher als Flocken verwendet, weil Pellets geringe Varianz in einzelnen Masse haben (3,53 ± 0,42 mg jeder oder 8% Abweichung), Resul-g in Fisch ähnliche Mengen an Nahrung zu erhalten. Überwachen Sie Verbrauch durch visuelle Aufzeichnung uneaten Pellets. Verbrauchsraten lagen typischerweise über 80%. </li><li> Am Ende jeder Woche über 4 Wochen, bestimmen Fisch Gewicht. Bereiten Sie eine neue Tasse mit frischem APW, auf ein Gleichgewicht, und dann das Gewicht aufgezeichnet. Dann gießen Sie einen Fisch in einem Kescher aus dem ursprünglichen Tasse und Transfer in den neuen Becher, der dann wieder gewogen wird. Die Fische werden nicht Stress zu vermeiden behandelt. </li><li> Für Gruppen, Platz 2 L von APW in einen 19 L Eimer und tarieren. Halten Sie Fisch zusammen in beiden Gruppen, wenn sie in neue APW Eimer übertragen dann Gesamtgruppe Gewicht aufgezeichnet. Nehmen Sie Fischgruppe Gewicht jede Woche über einen Monat Zeitraum von auf einen neuen Eimer zu übertragen. </li></ol> 9. Gut Transitzeit <ol><li> Verwenden Fluorescein-markierten 70 kDa anionischen Dextran. Dextran nicht wesentlich abgebaut und ist zu groß für die Darmschicht absorbiert werden, so werden Durchgang messen Gangszeit durch den Darm.Beschriftete Dextran wurde in Fischfutter eingearbeitet. </li><li> In einem sterilen 1,7 ml-Röhrchen, fügen Sie 360 ​​ul sterilem VE-Wasser und 52 mg Gelatine (13% ige Lösung), und legen Sie den Schlauch auf 60 ° C Wärmeblock, bis die Gelatine schmilzt und vollständig gelöst ist. <ol><li> Grind Goldfischfutter Flocken zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel, und fügen Sie 40 mg dieses Pulvers auf das Rohr, zusammen mit 20 &amp; mgr; l von Fischöl. Nach dem Mischen hinzufügen 1,6 mg FITC-Dextran. </li></ol></li><li> Dispense die heiße flüssige Mischung in 20 &amp; mgr; l auf dem Labortisch auf Parafilm fällt, und lassen Sie sie schnell abgekühlt und verfestigt. Tropfen können für bis zu 4 d gespeichert werden, bevor sie zu hart für Fisch zu essen. Shop fällt im Kühlschrank durch die Parafilm auf die Hälfte einer Petrischale platziert, die dann auf sterilem Wasser in einem verschlossenen Plastikbehälter schwimmt, der die Tropfen befeuchtete hält. </li><li> Kurz vor Fütterung, fällt Quartal in Abschnitte mit einer Rasierklinge. Akklimatisieren die Fische an die StyroSchaumbecher einzeln für 2 Tage ohne Fütterung (Hinweis: Es werden nur unbelichteten Kontrolle Fisch verwendet wurden). Legen Sie vier Viertel des Lebensmittels in die Tasse mit dem Fisch, und beobachten Sie die Fische für 30 Minuten, wie viele Stücke der Nahrung, die sie je essen. </li><li> Um die Überwachungsperiode beginnen, übertragen die Fische einzeln in Becher mit 80 ml APW einen Kescher mit. Jede 2 h vorsichtig schwenken die APW mit der Hand, und dann nehmen Sie eine 1 ml Probe und Speicher in einem markierten 1,7 ml-Röhrchen bei 4 ° C. Proben für 36 Stunden. </li><li> Record Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzspektrophotometer, aller Proben zur gleichen Zeit nach Abschluß des Assays. Legen Sie die gesamte 1 ml Probe in eine Küvette, und notieren Sie die Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregung bei 495 nm und Emission bei 520 nm gemessen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Einige Herausforderungen erfordern eine Ruhezeit in einem sauberen APW nach einer Antibiotika-Behandlung für das Medikament in Fischgewebe aufgebraucht werden. Wenn die Ruhezeit übersprungen wird, dann können die Ergebnisse antibiotische Anwesenheit vermengen, insbesondere wenn der Assay Exposition gegenüber Bakterien beinhaltet. Um Effekte aus einer veränderten microbiome Zusammensetzung ohne große Änderungen in der Gesamtzahl von Mikroben auf dem Host, Vorversuche Überwachung microbiome Zusammensetzung (16S Profiliere...

Es wurde festgestellt, dass Antibiotika können die menschliche microbiome stören zu dysbiosis führt, eine mikrobielle Gemeinschaft Ungleichgewicht bedeutet. Die kompositorische Veränderung der Mikrobiota nach einer Antibiotika - Behandlungen wurde die Vielfalt der Gemeinschaft gezeigt zu senken, wichtige Mitglieder zu reduzieren und Gemeinschaft Stoffwechsel verändern, vor allem im Darm 1, 2. Antibiotic Störung des Darms microbiome kann Kolonisationsresistenz auf Clostridium difficile 3, 4 und 5 Salmonella verringern. Zusätzlich hat die Unterbrechung der Mikrobioten zur Entwicklung vieler Syndromen und Krankheiten bei Menschen in Verbindung gebracht worden (zB Antibiotika-assoziierter Enterokolitis, entzündliche Darmerkrankungen, Stoffwechselstörungen, etc.). Antibiotika sind ebenfalls weit verbreitet in der Landwirtschaft als Wachstumsförderer umgesetzt inVieh und Geflügel Produktion 6. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Tools ist nicht ohne Nebeneffekte, die im raschen Anstieg der Antibiotikaresistenz offensichtlich ist, sowie die Auswirkungen eines gestörten microbiome hat mit seinem bewohnter Gastgeber. Viele Studien haben gezeigt, dass Breitspektrum-Antibiotikum Nutzung hat langfristige Folgen für die Struktur und Funktion der Mikrobiota, aber die Nebenwirkungen von einem antibiotika gestört microbiome Auswirkungen auf Host-Physiologie sind nur Spekulationen, die noch unterstützt werden. Das Zusammenspiel zwischen Gastgeber, Mikrobiota und Antibiotika ist bei weitem nicht in prägnanter Weise verstanden zu werden. Daher ist ein einfaches und besser lenkbar Modell vorteilhaft Licht auf die hochkomplexen Säugersystem zu vergießen. Schleimhäuten beim Menschen, einschließlich Darm, Hafen die höchste Dichte und Vielfalt von Mikroben, und auch die intimsten Mikrobe-Wirt-Interaktionen. Die Schleimhaut Haut microbiome Fisch Angebote sehrere Vorteile als Modellsystem. Die Teleostei (Knochenfische) ist eine der frühesten Abstammungslinien innerhalb der Vertebrata Bedeutung zu divergieren , dass teleosts sowohl angeboren haben und erworbene Immunsystem , die eine Beziehung mit symbiotischer Bakterien-Gemeinschaften 7 zusammen entwickelt haben. Fischhaut teilt viele Eigenschaften mit Typ - 1 - Schleimhautoberflächen von Säugetieren, wie physiologische Funktionen, Immunität Komponenten und die Anordnung von Schleim-produzierenden Zellen 8. Die äußere Lage der Fischhaut Schleimhautoberfläche bietet eine microbiome leicht experimentell manipulieren und Probe. Die westliche mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), ist ein Modell , Fisch, 9 Paarung und Toxikologie in der Vergangenheit verwendet wurde , für das Studium, 10, 11. In Anbetracht der geringen Größe, Bevölkerung Hülle und Fülle in der Wildnis als eine invasive Spezies, m<html> inimal Pflegekosten und hardy Natur, haben wir G. affinis als Schleimhaut microbiome Modell entwickelt. Ferner teilen Gambusia die Physiologie der Geburt mit viviparous Säugetiere junge leben, die in Fischarten ungewöhnlich ist. Wir haben die umfangreichste Studie zum Zeitpunkt der Fisch normalen Mikrobiota Haut mit 16S Profilierung mit Gambusia 12. Weitere Arbeiten zeigten , drei negative Auswirkungen auf die Host folgende Störung der Haut und der Darmflora mit einem Breitspektrum - Antibiotikum 13. Fünf verschiedene Effekte wurden in der Fisch folgenden Antibiotika Exposition untersucht. Die meisten etablierten Host Nutzen der microbiome ist wettbewerbsfähig Ausschluss von Krankheitserregern. Der Fisch Erreger Edwardsiella ictaluri ist bekannt , 14 Ausbrüche von magensaftresistenten Septikämie in kommerziellen Wels Farmen zu verursachen. E. ictaluri hat auch Zebrabärbling zu letal infizieren gezeigtclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 und 17 Gambusia. Eine Herausforderung mit diesem Erreger aus der Wassersäule kann als Maß der Ausgrenzung dienen. Als Vergleich zu Anfälligkeit für einen einzelnen Erreger, Überleben während der Exposition gegenüber einer hohen Dichte von gemischten Organismen wurde ebenfalls durchgeführt. Exkremente und organisch-reichen Boden wurden als häufig angetroffene Quellen mikrobieller Gemeinschaften eingesetzt. Eine andere etablierte Rolle der bakteriellen Darm Gemeinschaft durchführt, ist Nährstoffverarbeitung und Energieertrag, wodurch die Gesamtnahrungsaufnahme für den Wirt zu beeinflussen. Als grobe Messung der Ernährung wurde Fischkörpergewicht im Vergleich vor und nach einem Monat eine Standard-Diät gefüttert. Antibiotika-behandelten Fische als ein durchschnittliches Gewicht verloren, während die Steuerung Fisch im Durchschnitt Gewicht im Laufe des Monats gewonnen. Der Mechanismus für diesen Mangel an Gewichtszunahme ist unklar. Ein möglicher Faktor ist Transitzeit der Nahrung im Darm. Ein GI Motility-Methode wurde von Zebrabärbling (Adam Rich, SUNY Brockpo, persönliche Mitteilung) angepasst Laufzeit zu bestimmen. Es wurde noch nicht bestimmt worden, wenn Antibiotika-behandelten Fische eine veränderte Laufzeit haben. Eine gemeinsame Herausforderung von allen Organismen in der Natur erlebt, vor allem Fisch, ist osmotischer Stress. Gambusia wurden schnell anpassen angezeigt , wenn akut in hohen Konzentrationen von Salinität 18 betont. Überraschenderweise Fisch mit einem Antibiotikum veränderten microbiome zeigte gesenkt Überleben zu einem hohen Salzstress. Der Mechanismus für diesen neuartigen Phänotyp wird untersucht. Eine weitere häufige Belastung auf Wassertiere, insbesondere in Aquarien, ist toxisch Formen von Stickstoff (Ammoniak, Nitrat und Nitrit). Überleben gegen Nitrat war nicht signifikant verschieden zwischen Antibiotika-behandelten und Kontrollfische. Die Methoden in diesem Manuskript präsentiert mit Gambusia oder ähnlichen Fischmodellorganismen wie Zebra verwendet werdenFisch und Medaka, Phänotypen in der Fisch folgenden experimentellen Manipulation zu messen.

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-markiertes 70 kDa anionisches Dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>Tabletten lösen sich in Wasser auf, um PBS herzustellen</td></tr></tbody></table>

die prüfung der host-phänotypen in<em&gt; gambusia affinis</em&gt; nach der behandlung mit antibiotika

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Die Gemeinsamkeit des Antibiotikaeinsatzes in der Medizin bedeutet, dass das Verständnis der daraus resultierenden Folgen für den Wirt von entscheidender Bedeutung ist. Antibiotika verringern oft die Vielfalt der Mikrobiomgemeinschaften des Wirts und verändern die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft. Viele Krankheiten wie Antibiotika-assoziierte Enterokolitis, entzündliche Darmerkrankungen und Stoffwechselstörungen wurden mit einer gestörten Mikrobiota in Verbindung gebracht. Das komplexe Zusammenspiel zwischen Wirt, Mikrobiom und Antibiotika erfordert ein handhabbares Modell für die Untersuchung von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen. Unser Süßwasserwirbeltier dient als nützliches Modell für die Untersuchung der universellen Aspekte der Struktur und Funktion des mukosalen Mikrobioms sowie für die Analyse der daraus resultierenden Wirtseffekte durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft. Zu den Methoden gehören Herausforderungen für den Wirt wie z. B. die Infektion mit einem bekannten Fischpathogen, die Exposition gegenüber Stuhl- oder Bodenmikroben, osmotischer Stress, Nitrattoxizität, Wachstumsanalysen und die Messung der Darmmotilität. Diese Techniken demonstrieren ein flexibles und nützliches Modellsystem für die schnelle Bestimmung von Wirtsphänotypen.

Ein Gesamtschemadiagramm des experimentellen Systems verwendet , um Fischaufnahmeeffekte aus antibiotischen Belichtungs 13 ist in 1A dargestellt und beinhaltet die Technik zum Extrahieren der Haut (1B) und gut (1C) microbiomes vom Fisch studieren. Drei Tage wurde als Antibiotikum Einwirkungszeit ausgewählt, weil früheren Daten, die zeigt, während die gesamte Haut kultivierbaren Zahl zu Beginn der Behandlung fällt,...

Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren.

Die Prüfung der Host-Phänotypen in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Nach der Behandlung mit Antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Systems besteht darin, die negativen Nebenwirkungen an einem Wirtsorganismus nach einer Antibiotikabehandlung zu untersuchen. Diese Methode kann daher helfen, zentrale Fragen im Mikrobiom-Bereich zu beantworten, beispielsweise welche Nebenwirkungen mit Enbac verbunden sind und die durch ein gestörtes Mikrobiom vermittelt werden. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass das System einfach und kostengünstig ist, um physiologische Phänotypen von Wirbeltierwirten zu untersuchen, und eine nichtinvasive Störung des Mukosamikrobioms ermöglicht.Die Auswirkungen dieser Technik verdeutlichen, wie eine Störung des Mikrobioms eines Tieres zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen kann. Streichen Sie zunächst einen zuvor gewonnenen und eingefrorenen infektiösen Stamm von Edwardsiella ictaluri auf Agar mit selektivem und differenzierendem E.Ictaluri-Medium. Inkubieren Sie die Kultur zwei Tage lang bei 27 Grad Celsius.Überführen Sie eine reine, isolierte Kolonie aus der Kultur und impfen Sie einen 150-Milliliter-Kolben mit 40 Milliliter Nährbouillon an. Stellen Sie den Kolben für zwei Tage in einen schüttelnden Inkubator bei 27 Grad Celsius und 150 U/min. Um nach der Inkubation die E.Ictaluri-Kultur für die gewünschten infektiösen Dosisvolumina zu kalibrieren, verdünnen Sie eine Probe der Kultur mit PBST auf einen OD 650 von 0,2.Nachdem Gambusia affinis gesammelt wurden und die Fische drei Tage lang mit Rifampicin in der Wassersäule behandelt wurden, überführen Sie sowohl die antibiotikabehandelten als auch die unbehandelten Kontrollfischgruppen in einzelne Plastikbecher mit jeweils 130 Milliliter frischem künstlichem Teichwasser (APW) für etwa 10 Stunden, um eine Ausscheidung des Wirkstoffs aus dem Fischgewebe zu ermöglichen. Danach trennen Sie die Fische erneut in einzelne Acht-Unzen-Plastikbecher mit jeweils 130 Milliliter sauberem APW. Verabreichen Sie jedem Fisch eine letale Dosis der E.Ictaluri-Kultur und inkubieren Sie die Fische 24 Stunden lang bei 27 Grad Celsius.Nach dem E. ictaluri-Bad überführen Sie jeden Fisch in einen neuen Becher mit 130 Milliliter APW. Ohne die Fische zu füttern, dokumentieren Sie die Fischmortalität über eine Woche hinweg. Sammeln Sie den gesammelten Kot in einer sterilen Plastiktüte, bevor Sie ihn in ein steriles 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Verwenden Sie PBST, um eine Stammlösung des Kotes mit einer Konzentration von 500 bis 800 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Mit einer ein Milliliter oder größeren Plastikpipette, deren Spitze abgeschnitten wurde, stellen Sie 130 Milliliter pro Becher einer 15-Milligramm-pro-Milliliter- oder 10-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von Kot in APW her.Überführen Sie antibiotikabehandelte oder unbehandelte Fische in einzelne Becher mit der Lösung und inkubieren Sie die Fische dann zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius, wobei Sie die Mortalität während dieser Zeit genau beobachten und dokumentieren. Um die Fische mit Boden zu behandeln, sammeln Sie ein bis zwei Kilogramm nährstoffreichen organischen Oberbodens, etwa sieben bis 15 Zentimeter tief, und überführen Sie diesen in einen sauberen Kunststoffbehälter. Bereiten Sie einzelne Kunststoffbecher vor, die jeweils 18,2 Gramm Boden und 130 Milliliter APW enthalten, und vermischen Sie den Boden gründlich per Hand. Danach überführen Sie die antibiotikabehandelten oder unbehandelten Fische in die Becher und lassen sie drei Tage lang bei 25 Grad Celsius stehen, wobei jede Mortalität erfasst wird.Nach einer 10-stündigen Ruhephase in APW im Anschluss an die Antibiotikabehandlung die Fische in einzelne Becher überführen, die 17,5 Milligramm pro Milliliter Natriumchlorid und APW enthalten, und die Fische über einen Zeitraum von 36 Stunden auf Mortalität beobachten. Um eine Nitrat-Toxizitätsprüfung durchzuführen, nach einer 10-stündigen Ruhephase wie zuvor die Fische in einzelne Becher aufteilen, die entweder 10 oder 17,5 Milligramm pro Milliliter Natriumnitrat und 130 Milliliter APW enthalten. Die Fische über einen Tag hinweg bei der hohen Dosis an Natriumnitrat und über vier Tage bei der niedrigen Dosis auf Mortalität beobachten. Nach Abschluss einer dreitägigen Antibiotika- oder Kontrollbehandlung in Gruppen für einzelne Fische acht-Unzen-Styroporbecher mit 150 Millilitern APW füllen, nach dem Wiegen der befüllten Becher die Fische in die Becher überführen und anschließend das Gesamtkörpergewicht zur initialen Beurteilung aufzeichnen.Füttern Sie die Fische täglich mit zwei Futterpellets pro Fisch und überwachen Sie den Verzehr, indem Sie nicht gefressene Pellets visuell dokumentieren. Am Ende jeder Woche über einen Zeitraum von vier Wochen bestimmen Sie das Fischgewicht, indem Sie zuerst ein Becherglas mit frischem APW wiegen und das Gewicht notieren, dann die Fische in ein Kescher hineinleiten und in das neue Becherglas überführen, bevor Sie das Becherglas erneut wiegen. Bei Fischgruppen geben Sie 150 Milliliter APW in ein Becherglas und tarieren die Waage.Halten Sie die Fische beider Gruppen zusammen, wenn Sie sie in neue Behälter mit APW umsetzen, und notieren Sie das Gesamtgruppengewicht. Wiederholen Sie die Wägung am Ende jeder Woche über einen Zeitraum von einem Monat. Um die Darmtransitzeit zu analysieren, geben Sie 360 Mikroliter sterilem deionisiertem Wasser und 52 Milligramm Gelatine in ein steriles 1,7-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie es auf einen Wärmeprobeblock mit 60 Grad Celsius, bis die Gelatine geschmolzen und vollständig gelöst ist.Das Goldfischfutter in Flockenform mit einem Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zermahlen und 40 Milligramm des Pulvers zusammen mit 20 Mikrolitern Fischöl in das Röhrchen geben. Nach dem Mischen 1,6 Milligramm FitC-Dextran hinzufügen. 20-Mikroliter-Tropfen der heißen Flüssigkeit auf Parafilm auf der Laborbank abgeben und schnell abkühlen und erstarren lassen.Legen Sie die Parafilmfolie auf die Hälfte einer Petrischale und lassen Sie sie in einem verschlossenen Plastikbehälter auf steriler Wasser schwimmen. Bewahren Sie die erstarrten Tropfen bis zu vier Tage im Kühlschrank auf, da sie danach für die Fische zu hart werden. Schneiden Sie die Tropfen kurz vor der Fütterung mit einer Rasierklinge in Viertelabschnitte.Die Fische zwei Tage lang ohne Fütterung an individuelle Styroporschalen akklimatisieren, vier Viertel des Futters in die Fischschale geben und die Fische 30 Minuten lang beobachten, wie viele Stücke Futter sie jeweils fressen. Zum Beginn der Überwachung einzelne Fische in Schalen mit 80 Milliliter APW überführen und alle zwei Stunden eine 1-Milliliter-Probe entnehmen. Diese in einem beschrifteten 1,7-Milliliter-Röhrchen bei vier Grad Celsius lagern.Nach Abschluss des Assays eine gesamte Probe von einem Milliliter in eine Küvette geben und mit einem Fluoreszenzspektrophotometer die Fluoreszenz bei einer Anregung von 495 Nanometern und einer Emission von 520 Nanometern für alle Proben gleichzeitig aufzeichnen. Wie hier gezeigt, waren Fische mit einem antibiotikabedingt veränderten Mikrobiom anfälliger für eine E. Ictaluri-Infektion als Kontrollfische. Der Unterschied in der mittleren Überlebenszeit zwischen behandelten und Kontrollfischen war nicht signifikant.Dies liegt wahrscheinlich an der geringen Gruppengröße. Dieses Diagramm zeigt, dass Fische, die Rifampicin ausgesetzt waren, anfälliger für osmotischen Stress waren als Kontrollfische; bei diesem Assay führten Salzgehalte über 18 Milligramm pro Milliliter zu einem schnellen Absterben der Fische. Wie in dieser Tabelle dargestellt, hatte eine Vorbehandlung mit Antibiotika keinen Einfluss auf das Überleben, wenn die Fische dem Gift Nitrat in der Wassersäule ausgesetzt waren.Bei 10 Milligramm pro Milliliter wurde für beide Gruppen – die mit Antibiotika behandelte und die Kontrollgruppe – nach 90 Stunden eine 50%ige Letalität beobachtet. In diesem Experiment mit Kontrollfischen in einem Aquarium wurden entweder zwei Abschnitte oder ein Abschnitt Futter mit markiertem FitC-Dextran an die Fische verfüttert, um die Nahrungstransitzeit durch Messung der Fluoreszenz im umgebenden Wasser über die Zeit zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung der gesamten Körperfettreserven und die Quantifizierung der Schleimproduktion der Haut durchgeführt werden, um Mechanismen zu verstehen und störende Faktoren einzugrenzen, die möglicherweise zu negativen Wirtseffekten beitragen könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Bernut, A., et al., Entschlüsselung und Bildgebung der Pathogenese und Cording von Mycobacterium abscessus in Zebrafisch-Embryonen. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung und Quantifizierung des Mycobacterium abszescessus aus einem infizierten Zebrafischembryo. Das Verfahren umfasst Embryonen-Euthanasie, Gewebelyse und Homogenisierung zur Freisetzung der Bakterien, gefolgt von Zentrifugation und Resuspension in einem Tensidpuffer. Abschließend wird...

Isolierung und Kultivierung von Bakterien aus Zebrafisch-Embryonen zur Einschätzung der Infektionslast

Quelle: Le, T. A. N. et al., Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Quantifizierung der Darmpermeabilität von C. elegans, der Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt ist. Im Vergleich zu Kontrollen, die mit Escherichia coli gefüttert wurden, zeigen pathogen-behandelte Würmer eine erhöhte Fluorophor-Leckage in die Körperhöhle, was auf Schäden an der...

Beurteilung der Darmpermeabilität bei C. elegans nach bakterieller Exposition

Ein Ei-in-Wurm (EIW)-Assay ist eine nützliche Methode, um Eiablageverhalten quantifizieren. Änderungen in Eiablage kann eine Verhaltensreaktion des Modells...

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

Optisch transparente Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen pathogenen Mikroorganismen und den angeborenen Immunzellen in Echtzeit zu untersuchen und zu visualisieren. Die Mikroinjektion von Mycobacterium abscessus, kombiniert mit Fluoreszenzbildgebung, wird verwendet, um wesentliche pathogene Merkmale wie die Nabelschnurbildung in Zebrafischembryonen zu untersuchen.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Sumpf Tupfer und Schlamm Analyse der Zebrafisch Systeme führt zu erhöhten Erkennung im Vergleich zu den alleinigen Einsatz von Wächter, Krankheitserreger wie Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und zu erkennen Pseudocapillaria Tomentosa. Außerdem wird ein System zur Überwachung von p. Tomentosa Eiern in Quarantäne vorgeschlagen.

Environmental Screening von Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa im Zebrafisch-Systeme

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

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Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

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Derzeit fehlt es an in vivo-Modellen , die sich für ein Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen eignen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Wundinfektion mit einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa , um eine persistierende Infektion bei Zebrafischlarven zu erzeugen.

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