Name: Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Lernen Sie die horizontale Schnittpräparation der erwachsenen Mäuseretina zur Untersuchung horizontaler Neuronen mit Patch-Clamp-Techniken. Diese Methode ermöglicht funktionelle Aufnahmen von horizontalen Zellen und Amakrinzellen.

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Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 und FE464/11-1 to A.F. Die Autoren danken Andrea Nerz für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche, herausgegeben von der Bundesrepublik Deutschland durchgeführt. Hinweis: Da das Netzhautgewebe während längerer Teile dieses Verfahren frei von Sauerstoff sein, alle Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden soll. Mäuse sollte mindestens 3 Stunden vor der Dissektion dunkel angepasst werden. Um Licht Anpassung der Netzhaut, die Vorbereitung zu vermeiden und Schneiden sollte unter dim rotes Licht durchgeführt werden. 1. Herstellung von Druckmedien und anderen Chemikalien <ol><li> Bereiten Sie Ames &#39;Medium 6. Netzhautgewebe in Ames &#39;Medium zu jeder Zeit nach der Sektion, einzutauchen. <ol><li> Man löst 2,2 g Ames &#39;Medium und 298 mg HEPES in 250 ml destilliertem Wasser. Die Konzentration von HEPES wird 5 mm betragen. Vorsichtig umrühren, bis alle Partikel gelöst sind. </li><li> Blase Ames &#39;Medium bei Raumtemperatur mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% AutoKohlendioxid) für mindestens 5 min. Versorgungs Carbogen mit einer Glaspasteurpipette zu der Lösung. Schließen Sie das Pasteur-Pipette über entsprechende Schlauch an den Ausgang des Gasregler. </li><li> Hinzufügen, 475 mg Natrium-Bicarbonat zur Lösung. Die Zugabe von Bikarbonat nach Sprudeln verhindert die Ausfällung von Calciumcarbonat. </li></ol></li><li> Bereiten Sie niedrige Geliertemperatur Agarose. Agarose ist erforderlich für die während Vibratom Schnitte von Netzhautgewebe eingebettet ist . <ol><li> Man löst 180 mg Agarose in 9 ml Ames &#39;Medium und 1 ml destilliertem Wasser. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um langsam die Agarose-Lösung erhitzen, bis sich alle Feststoffe gelöst sind. Hitze in 5-10 sec-Schritten Überlauf zu vermeiden. Lösung sollte klar und transparent sein. </li><li> Aufbewahren bei 37 ° C Agarose in einem Wasserbad für die Dauer des Verfahrens gelöst. </li></ol></li></ol> 2. Einrichten des Vibratom HINWEIS: Alle Schnitte wurde mit der durchgeführtVibratom in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt. Die angegebenen Einstellungen beziehen sich auf diese Art von Vibratom nur. Weitere Einzelheiten zu Vibratom Schnitte von Nervengewebe entnehmen Sie bitte 7 zu verweisen. <ol><li> Setzen Sie Vibratom Injektor Klinge in Klingenhalter. </li><li> Messen Sie vertikale Auslenkung der Klinge mit der &quot;VibroCheck&quot; Gerät. Verwenden, um die Einstellschraube an dem Klingenhalter die Klinge zu kippen, bis es auf der Schnittebene parallel ist. Die genaue Positionierung der Klinge notwendig Jalousieeffekte auf der Schnittfläche zu verhindern und um einen flachen Abschnitt zu erzeugen, die von lebenden Zellen auf seiner Oberfläche enthält. </li><li> Stellen Sie Vibratom auf die folgenden Einstellungen: Amplitude, 1,00; Geschwindigkeit, 0,20; Dicke, 180-200 &amp; mgr; m. </li></ol> 3. Dissektion der Maus Retina <ol><li> adult C57BL / 6-Maus durch Verdampfung von etwa 1 ml Isofluran in einem luftdichten Behälter anästhesieren. Wenn Anästhesie abgeschlossen ist, einschläfern Tier durch Genickbruch. DasMaus sollte nicht älter als 3 Monate sein, da sonst die Qualität der Scheiben verschlechtern wird. </li><li> Entfernen Augapfels durch eine gekrümmte Pinzette unter dem Auge platziert. Ziehen Sie das Auge Ball anheben wird den Sehnerv aus. Schneiden Sie den Sehnerv mit einer Feder Schere und übertragen die Augapfels auf eine 35-mm-Petrischale mit 2 ml Ames &#39;Medium. </li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf der Bühne eines Stereomikroskops. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen Wert, der eine optimale visuelle Kontrolle der folgenden Verfahren erlaubt (Schritte 3,4-3,9). </li><li> Durchstechen der Hornhaut am Übergang zu der Sklera mit spitzen Pinzette oder einer 20 G-Nadel. Während dieses Schrittes stabilisieren das Auge Ball mit einer anderen Zange. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut mit dem Stechgerät zu beschädigen. </li><li> Setzen Sie die Feder Schere in das kleine Loch gemacht in Schritt 3.3 und schneiden Sie die Hornhaut einen Kreis um. Auch hier fest mit einer Pinzette die Augapfels während des Schneidens. Halten Sie den Schnitt sehr nahe an der Oberfläche, um nicht zu cut in der Netzhaut. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Hornhaut, Linse und Glaskörper mit einer Pinzette. Der Glaskörper umfasst nur eine dünne transparente Schicht auf der Rückseite des Auges. Jedoch ist es für Vibratom sectioning dass der Glaskörper vollständig entfernt wird. </li><li> In der Petrischale, positionieren Sie die Augenmuschel in einer Weise, dass man durch das Loch nach unten schaut auf die Netzhaut. Der Rand der Öffnung sollte nur von Skleragewebe bestehen. Wenn die Kreisschnitt (Schritt 3.4) wurde zu nahe des Okulars zum Äquator durchgeführt wird, wird Netzhautgewebe auch vorhanden Nähe der Einschnitt sein. Seien Sie vorsichtig, dann nicht auf die Netzhaut zu beschädigen in Schritt 3.8. </li><li> Besorgen Sie sich die Lederhaut mit einer Pinzette vorsichtig in das Gewebe auseinander reißen. Es ist wichtig, nicht die Netzhaut während dieses Schritts zu bersten. Falls erforderlich, entfernen Sie die Netzhaut von der Ora serrata durch den skleralen Teil des Gewebes mit der Zange Verstetigung und sorgfältig auf die Netzhaut mit den anderen Zangen Abziehen. Halten Sie die Zange geschlossen; nie die Wieder Grifftina mit einer Pinzette, da das Gewebe ist sehr weich und wird sofort Platz geben. HINWEIS: Bei diesem Schritt wird die Netzhaut und der Rest des Okulars wird erst am Sehnervenkopf angeschlossen werden. </li><li> Schneiden Sie die Befestigungsstelle am Sehnervenkopf mit den Feder Schere. Die Netzhaut sollte nun frei als ein einziges Stück Gewebe Medium &#39;in Ames zu schweben. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut in 4 - 6 kleine Rechtecke von ca. 23 mm mit einer gekrümmten Skalpellklinge mit von der Netzhaut mit der Zange an den Rändern halten, sie in die richtige Position zu manipulieren. Vermeiden Sie das Netzhautgewebe innerhalb der Rechtecke Kneifen. Nehmen Sie Stücke aus den zentralen Teilen der Netzhaut, nicht weit Peripherie. </li><li> Übertragen retinalen Stücke mit einem großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette zu einer 35 mm Kunststoff-Petrischale, deren Boden wurde durch ein Gitter mit Gittergröße von weniger als 1 mm ersetzt. Befestigen Sie die Petrischale im oberen Drittel eines Bechers oder Erlenmeyerkolben und versenken retinalen Stücke in Ames &#39;Medium bubbled mit Carbogen. </li></ol> 4. Einbettung von Retinal Stück in Agarose <ol><li> Sorgfältig übertragen 2 - 3 Retina-Stücke in eine 35 mm Kunststoff-Petrischale zusammen mit einigen der Ames &#39;Medium. Es ist sehr bequem, einen großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette für die Übertragung zu verwenden. In diesem Schritt wichtig die genaue Ausrichtung der retinalen Stücke nicht. </li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich von der restlichen Ames &#39;Medium mit einem Glas Pasteur Pipette. Sobald die Flüssigkeit entfernt wurde, mit dem Schritt 4.3 fort. Sie nicht das Netzhautgewebe trocknen lassen. </li><li> Unmittelbar bedecken retinalen Stücke mit 2 ml Agarose gelöst (37 ° C). Einsatz der genannten Größe in Schritt 3.10, werden die Stücke nicht in der Agarose einrollen. </li><li> Innerhalb der flüssigen Agarose, drücken Sie vorsichtig retinalen Stücke auf den Boden der Petrischale. Die Ganglienzellschicht sollte nach unten zeigen . Verwenden Sie ein Stereomikroskop zur Beurteilung der exakten Position. Zur Positionierung Griff retinalen piECES mit einem kleinen Spachtel. Positionieren Sie die Netzhaut so schnell und präzise wie möglich, da die Agarose schnell verfestigt. <ol><li> Vereinbaren retinalen Stücke auf den Boden der Glasschale parallel; sonst werden Abschnitte tangential oder schräg sein. Einzelne Stücke sollten einander nicht berühren, aber auch nicht zu weit auseinander liegen. Versuchen Sie, retinale Stück mehr oder weniger auf der gleichen horizontalen Ebene platzieren. </li></ol></li><li> Setzen Petrischale aus Glas mit eingebetteter retinalen Stücke in den Kühlschrank (4-6 ° C) für mindestens 2 min. Dies wird schnell die Agarose zur weiteren Bearbeitung aushärten. Sobald die Agarose wurde mit dem nächsten Schritt fortzufahren polymerisiert. </li></ol> 5. Montage von Retinal Pieces <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die Agaroseblock retinalen Stücke aus der Petrischale enthält. Verwenden Sie einen Spatel oder eine ähnliche Vorrichtung, die Agarose-Block aus dem Glas zu heben. Durch Adhäsionskräfte, kann dies sehr schwierig erweisen. Vermeiden Sie jedoch das BrechenAgaroseblock. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die Agarose-Block auf einem Deckglas und passen Sie seine Größe mit einem Skalpell. Lassen 1 bis 2 mm aus Agarose auf jeder Seite der Netzhautstücken. Die endgültige Größe des Blocks sollte um 1,066 mm (10 mm bezieht sich auf die Höhe des Blocks, 6 mm auf seine Kantenlänge). </li><li> Kleben die Agarose-Block an den Probenhalter des Vibratom eine Sofortkleber. Retinal Stücke sollten im oberen Bereich der 10 mm hohen Block und parallel zu dessen Oberfläche angeordnet sein, während der Boden an der Halterung befestigt ist. </li><li> Decken Sie den Block unmittelbar durch die zuvor sprudelte Ames &#39;Medium in die Pufferwanne des Vibratom Gießen. </li></ol> 6. Herstellung von Horizontal Vibratom Abschnitte <ol><li> Starten Sie sectioning. Zuerst stellen Sie die Dicke des Schneidens manuell bis Fragmente von Netzhautgewebe in der Scheibe erscheinen. Ändern Sie dann auf die Einstellungen in Schritt 2.3. Seit derMaus Netzhaut ist nur etwa 200 &amp; mgr; m dick ist, wird es nicht mehr sein als 2 - 3 Scheiben pro Agaroseblock. </li><li> Entfernen Sie Abschnitte aus dem Pufferwanne mit einem Glasstab und sie auf 2 ml Ames &#39;Medium in einer 35 mm Petrischale. </li><li> Speicherabschnitte unmittelbar in einem Brutschrank bei 37 ° C (5% CO 2/55% O 2). Die Agarose die Abschnitte umgeben wird im Inkubator solide bleiben und verwendet werden können, um die Abschnitte zu behandeln, ohne die Netzhaut schädigen. Bessere Schichtqualität erzielt wird, wenn bei 37 ° C innerhalb der jeweiligen Atmosphäre gegenüber oxygenierten Ames &#39;Medium bei RT lagern. Abschnitte können sofort verwendet werden oder kann mit einer guten physiologischen Ergebnisse zu 4 Stunden im Inkubator gelagert werden. </li><li> nächste retinalen Stücke in Agarose und wiederholen Sie den Abschnitten Einbetten 4 - 6. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Im Gegensatz zu den vertikalen Scheiben wird die dendritische Morphologie von radial ausgerichteten Neuronen wie horizontale Zellen und Amakrinzellen gut erhalten. Im Vergleich zum gesamten Netzhaut Präparate sind diese Zelltypen leicht zugänglich für Mikroelektroden und kann sowohl von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Hier konzentrieren wir uns auf der äußeren Netzhaut; jedoch ein ähnlicher Ansatz wurde insbesondere berichtet für amakrinen Zellen der inneren Retina ...

Visuelle Information wird codiert als dynamisches räumlich-zeitlichen Muster der Photorezeptoraktivierung und die Band Synapse zwischen Photorezeptoren und zweiter Ordnung Neuronen bestimmt die Downstream Übertragung von visuellen Informationen. Die vertikale slice Herstellung der Säugernetzhaut ist ein sehr wertvolles Werkzeug Signalverarbeitung in vertikalen Bahnen zu untersuchen, dh zwischen Photorezeptoren und bipolaren Zellen und zwischen den bipolaren Zellen und einige Arten von amacrine Zelle 1, 2, 3, 4. Allerdings vertikale Schnitte verursacht immer schwerer Abschneiden der dendritischen Felder vieler retinalen Neuronen, zu erheblichen Verlust an synaptischen Kontakten führt. Vor allem in der äußeren Netzhaut werden horizontale Zellen betroffen aufgrund ihrer seitlich ausbreiten erweiterten dendritischen Felder und Axonterminal Systeme 5. In einer vertikalenScheibe Vorbereitung, die synaptischen Eingang von Hunderten von Kegel Photorezeptor-Terminals an den Dendriten einer horizontalen Zelle so zu vereinzelten Kontakten reduziert wird. Dies könnte ausreichen, um die Eigenschaften der einzelnen Synapsen zu studieren, aber es funktioniert bei weitem nicht die Signalverarbeitungsfähigkeiten zugrunde liegen die synchronisierte Aktivierung von Photorezeptor-Band Synapsen darstellen. Wir entwickelten daher eine horizontale Schnittpräparat, die horizontal Zelle Dendriten intakt und funktionsfähig fast alle des Kegels Photorezeptor synaptischen Eingangs verlässt. Die Ebene der Unterteilung läuft an der Oberfläche der Netzhaut parallel, im Idealfall durch die innere Kernschicht zwischen den horizontalen Zellen und amakrinen Zellen zu schneiden. Somit sind horizontale Schnitte der äußeren Netzhaut enthält, erstellt auf der präsynaptischen Ort, Photorezeptoren mit inneren und äußeren Segmente sowie synaptischen Terminals und horizontalen Zellen und bipolare Zellen auf der postsynaptischen Ort. Die Zubereitung ist gut geeignet, to untersuchen koordinierte synaptischen Eingänge in horizontale Zelle Dendriten von allen Zapfen-Photorezeptoren in seinem dendritischen Feld. Es könnte daher als nützlich erweisen, um besser auf die Funktionsweise des Photorezeptors ribbon Synapse verstehen, die für die Übertragung von visuellen Informationen von der Matrix der Fotorezeptoraktivierung in eine postsynaptische Reaktion entscheidend ist.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischale (Kunststoff)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glas Petri Schale</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Dispensary Universitätsklinikum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Injektorklinge</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G Nadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Skalpellklingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Pasteur-Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas-Pasteur-Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung von horizontal scheiben der erwachsenen maus retina für elektrophysiologische untersuchungen

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertikale Schnittpräparate sind in der erwachsenen Säugetier-Netzhaut zu untersuchen Schaltung und Signalübertragung aufgebaut. Die Ebene der in diesen Zubereitungen sectioning senkrecht zu der Netzhautoberfläche, wodurch es ideal für die Untersuchung von radial ausgerichteten Neuronen wie Photorezeptoren und bipolaren Zellen machen. Jedoch sind die großen dendritischen Dorne von horizontalen Zellen, Weitfeld amacrine Zellen und Ganglionzellen meist abgestumpften, in diesen Zellen merklich verringert synaptische Aktivität zu verlassen. Während Ganglionzellen und Vertriebenen Amakrinzellen in einer ganzen montierten Vorbereitung der Netzhaut untersucht werden können, horizontalen Zellen und amacrine in der inneren Kernschicht befindlichen Zellen sind nur schwer zugänglich für Elektroden in ganzen Retinagewebe. Um eine maximale Zugänglichkeit und synaptic Integrität zu erreichen, entwickelten wir eine horizontale Schnittpräparat der Maus Retina und untersucht die Signalübertragung an der Synapse zwischen den Photorezeptoren und horizontalenZellen. Horizontal Sektionieren erlaubt (1) eine einfache und eindeutige visuelle Identifizierung der horizontalen Zellkörper für eine Elektrode Targeting, und (2) Erhaltung der erweiterten horizontalen Zelle dendritischen Feldern, als Voraussetzung für eine intakte und funktionelle cone synaptischen Eingang horizontal Zelle Dendriten. Horizontale Zellen aus horizontalen Schnitten Tonikum synaptische Aktivität im Dunkeln zeigte, und sie reagierten Lichtblitze mit einer Reduktion der nach innen gerichteten Strom und verminderte synaptische Aktivität zu informieren. Immunzytochemische deutet darauf hin, dass fast alle Kegel innerhalb der dendritischen Feld von einer horizontalen Zellsynapsen mit seiner peripheren Dendriten etablieren. Die horizontale Scheibe Zubereitung ist daher gut geeignet, um die physiologischen Eigenschaften von horizontal erweitert Netzhautneuronen sowie sensorischen Signalübertragung und Integration in ausgewählten Synapsen zu studieren.

<html> In horizontalen Schichten der Netzhaut der Maus konnte horizontal Zellkörper leicht nach ihrer einzigartigen Morphologie mit mehreren primären Dendriten von einer polygonal Zellenkörper (1A) austretende identifiziert werden. Horizontal Zellkörper in der Nähe der Oberfläche der Scheibe angeordnet wurden routinemäßig zugänglich für Patch-Clamp-Elektroden. Während der Aufnahmen wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefüllt, ihre komplizierten dendriti...

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Das übergeordnete Ziel dieser horizontalen Schnittpräparation der Mausretina besteht darin, die morphologische und physiologische Integrität horizontal orientierter Neuronen zu bewahren, um ihre funktionelle Rolle in den synaptischen Schaltkreisen der Retina untersuchen zu können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der visuellen Informationsverarbeitung zu beantworten, beispielsweise wie sensorische Signale in den Rippensynapsen der sich wiederholenden Retina kodiert und integriert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass horizontal orientierte Interneurone wie horizontale Zellen und Amacrinzellen funktionell intakt sind und für elektronische Ableitungen zugänglich bleiben.Andrea Nerz, eine Technikerin in meinem Labor, wird den Vorgang demonstrier inflammatorisch. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie das Augapfel entfernen, indem Sie ein Paar gebogener Pinzette unter das Auge platzieren. Heben Sie das Augapfel vorsichtig an, um den Sehnerv freizulegen, und durchtrennen Sie diesen mit einer Feder-Schere.Überführen Sie dann den Augapfel in eine 35 Millimeter große Petrischale, die zwei Milliliter AMS-Medium enthält. Stellen Sie unter dem Stereomikroskop die Vergr&ouml;&szlig;erung auf einen Wert ein, der eine optimale visuelle Kontrolle erm&ouml;glicht. Befestigen Sie anschlie&szlig;end den Augapfel mit einer Pinzette und perforieren Sie die Hornhaut am &Uuml;bergang zur Sklera mit einer weiteren spitzen Pinzette oder einer 20-Gauge-Nadel.Seien Sie vorsichtig, um die Netzhaut nicht zu beschädigen, während Sie die Hornhaut durchstechen. Führen Sie danach die Feder-Schere in das kleine Loch ein. Halten Sie den Augapfel mit einer Pinzette fest, während Sie einen Kreis um die Hornhaut schneiden, und führen Sie den Schnitt so dicht an der Oberfläche durch, dass die Netzhaut nicht verletzt wird.Entfernen Sie vorsichtig die Hornhautlinse und den Glaskörper. Der Glaskörper besteht nur aus einer dünnen, transparenten Schicht im hinteren Augenabschnitt. Es ist jedoch entscheidend, dass der Glaskörper vollständig entfernt wird, um eine Vibratomschnitte durchführen zu können.Positionieren Sie im Petrischalen die Augenschale so, dass ein deutliches Loch bis zur Netzhaut sichtbar ist. Der Rand der Öffnung sollte ausschließlich aus skleralem Gewebe bestehen. Fassen Sie anschließend die Sklera mit einer Pinzette an und reißen Sie das Gewebe vorsichtig auseinander.Es ist entscheidend, die Netzhaut während dieses Schritts nicht zu verletzen. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Netzhaut mit dem restlichen Augenbecher nur am Sehnervenkopf verbunden sein. Durchtrennen Sie die Verbindungsstelle am Sehnervenkopf mit einer Feder-Schere.Die Netzhaut sollte nun frei als ein einziges Gewebestück im AMS-Medium schwimmen. Überführen Sie die Netzhaut anschließend mit einer Pasteurpipette mit großem Durchmesser auf eine Deckglasunterlage und schneiden Sie sie mit einer gekrümmten Skalpellklinge in vier bis sechs kleine Rechtecke von etwa zwei mal drei Quadratmillimetern Größe. Vermeiden Sie es, das Netzhautgewebe innerhalb der Rechtecke einzuklemmen.Überführen Sie bei diesem Verfahren vorsichtig zwei bis drei Netzhautstücke mithilfe einer Kunststoff-Pasteurpipette mit großem Durchmesser zusammen mit etwas AMS-Medium in eine Glas-Petrischale. Entfernen Sie so viel wie möglich vom verbleibenden AMS-Medium mit einer Glas-Pasteurpipette. Decken Sie die Netzhautstücke anschließend unverzüglich mit zwei Milliliter bei 37 Grad Celsius gelöstem Agarose ab.Drücken Sie die Netzhautstücke vorsichtig auf den Boden der Petrischale. Positionieren Sie die Ganglienzellschicht so schnell und präzise wie möglich nach unten gerichtet, da sich das Agarose schnell verfestigt. Ordnen Sie die Netzhautstücke gleichzeitig parallel zum Boden der Glaschale an, um zu verhindern, dass die Schnitte tangential oder schräg verlaufen.Überführen Sie die eingebetteten Netzhautstücke danach in den Kühlschrank, um die Agarose vor der weiteren Verarbeitung aushärten zu lassen. Lösen Sie nun vorsichtig den Agaroseblock, der die Netzhautstücke enthält, von der Petrischale. Heben Sie den Agaroseblock mit einer Rasierklinge vorsichtig von dem Glas ab.Platzieren Sie danach den Agaroseblock auf einem Glas-Deckglas. Passen Sie seine Größe mit einer Skalpellklinge an und lassen Sie an jeder Seite der Netzhautstücke einen bis zwei Millimeter Agarose stehen. Kleben Sie anschließend den Agaroseblock mit einem Schnellkleber auf dem Objekthalter des Vibratoms fest.Decken Sie den Block sofort ab, indem Sie das zuvor mit Luft durchspülte AMS-Medium in das Puffergefäß des Vibratoms gießen. In dieser Abbildung wurde eine horizontale Zelle nahe der Schnittoberfläche mit Dotenkontrastoptik dargestellt. Dieses Bild zeigt eine horizontale Zelle, die über eine Patchelektrode, die noch mit der Zelle verbunden war, mit Oregon Green 488 BAPTA-1 gefüllt wurde.Hier ist die Überlagerung einer mit Farbstoff injizierten horizontalen Zelle und einer Anordnung von Kegel-Pedikeln dargestellt, die mit fluoresceinmarkiertem Erdnussagglutinin markiert wurden und die vermuteten synaptischen Kontakte sichtbar macht. In dieser Abbildung zeigt die Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufzeichnung bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt eine synaptische Aktivität mit hoher Frequenz. Bei höherer zeitlicher Auflösung weisen die synaptischen Ereignisse monophasische Wellenformen oder komplexere Stromverläufe auf.In dieser Abbildung ist die Stromantwort einer horizontalen Zelle auf einen Lichtreiz dargestellt. Licht führt zu einem Schließen von Ionenkanälen und einer Blockade der synaptischen Aktivität. In dieser Abbildung wurden Zapfen-Photorezeptoren elektrisch mit einer extrazellulären Elektrode stimuliert.Postsynaptische exzitatorische Ströme variieren entsprechend der Reizstärkeneinstufung. Wenn man dieses Verfahren einmal beherrscht, kann es bei korrekter Durchführung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Kalzium-Bildgebung angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Verarbeitung visueller Informationen in retinalen Netzwerken.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man horizontale Schnitte der Säugetierretina mit funktionellen synaptischen Eingängen zu horizontal ausgedehnten Zelltypen anfertigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Dieses Video zeigt eine Ganzzell-Patch-Clamp-Technik für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Mausnetzhaut. Eine dünne Glaspipette mit einer Elektrode wird verwendet, um sich den Starburst-Amakrinzellen (SACs) innerhalb der Netzhaut zu nähern. Nach dem Formen einer Versiegelung wird ein Sog angewendet, um die Membran zu brechen und die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu bilden. Schließlich wird der Fluss von Ionen durch die synaptischen SAC-Rezeptoren anhand der...

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Maus-Netzhaut

Das Video beschreibt die elektrophysiologische Aufzeichnung von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen. Die Schnitte, die den dorsalen lateralen Nucleus geniculatus (dLGN) enthalten, werden in eine Aufnahmekammer gelegt. Eine stimulierende Pipette wird entweder auf dem Sehtrakt positioniert, um retinale Ganglienzellen (RGCs) zu stimulieren und retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, oder auf dem Nucleus reticularis thalami, um kortikale Neuronen zu...

Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit...

Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Lernen Sie die horizontale Schnittpräparation der erwachsenen Mäuseretina zur Untersuchung horizontaler Neuronen mit Patch-Clamp-Techniken. Diese Methode ermöglicht funktionelle Aufnahmen von horizontalen Zellen und Amakrinzellen.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

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