Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, quantitative räumliche und zeitliche Beweise für die Kolokalisation von Angiotensin-Typ-1-Rezeptor-Lysosomen nach Angiotensin-2-Behandlung zu erhalten. Diese Methode wurde entwickelt, um Unterschiede in der subzellulären Verarbeitung von Y-Typ- und mutierten Rezeptoren zu erkennen, wie während des Internalisierungsprozesses, der als Reaktion auf die Ligandensimulation ausgestoßen wird. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört, dass durch die Bildgebung lebender Zellen Artefakte von fixierten und detergenderen permeabilisierten Zellen eliminiert werden und dass dynamische Veränderungen in der Rezeptorlokalisation in Echtzeit beurteilt werden können.

Beginnen Sie mit der Auswahl eines geeigneten Objektivs mit 1,4 numerischer Apertur und zentrieren Sie das Objektiv über dem Mikroskoptisch. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl mit hoher Viskosität und geringer Autofloreszenz auf das Objektiv und übertragen Sie die Kammer mit den transfizierten Zellen auf den Mikroskoptisch. Heben Sie das Objektiv vorsichtig an, bis das Öl gerade noch den unteren Rand des ersten Objektträgers berührt, und lokalisieren Sie die schwachen Zellen.

Wechseln Sie mit einer gesunden Zelle von Interesse in der Mitte des Sichtfelds in den konfokalen Modus und bestätigen Sie, dass die Zelle gut verteilt ist, wobei ihre Bauchseite eng mit dem Deckglas verbunden ist. Öffnen Sie das Dialogfeld Z-Stapel, klicken Sie auf Live, fokussieren Sie den Fokus auf den oberen Rand der Zelle, und klicken Sie dann auf Start. Fokussieren Sie dann auf den unteren Rand der Zelle, geben Sie die Schrittweite Z 1,00 Mikrometer ein, und klicken Sie dann auf Ende.

Wählen Sie dann oben unter Erfassungseinstellungen die Option XYZT-Modus aus. Stellen Sie abschließend das Zeitintervall für den Scan und die Dauer des Scans ein, um das Targeting des GFP-markierten Angiotensin-Typ-1A-Rezeptors auf die Lysosomen zu beobachten. Um dann mit der Ligandenstimulation zu beginnen, geben Sie drei Mikroliter einer 100-fachen Stammligandenlösung in die Vertiefung, die abgebildet wird, und klicken Sie auf Start, um die Reaktion in 3D für den gewünschten Zeitraum und die gewünschte Häufigkeit darzustellen.

Um die Live-Zellbilder zu analysieren, öffnen Sie die entsprechende 3D-Bildquantifizierungssoftware. In diesem Protokoll wird Velocity. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Bildfeld und wählen Sie Eigenschaften.

Geben Sie die entsprechenden XY- und Z-Bildpixeleigenschaften ein, um eine Messsequenz zu erstellen, um das GFP-markierte Rezeptorvesikel und die Lochzellintensitäten als Reaktion auf die Ligandenbehandlung zu analysieren. Wählen Sie im Menü 2D den erweiterten Fokusmodus aus, um die Zelle zu beobachten. Verwenden Sie als Nächstes das Freestyle-Bereichswerkzeug, um einen Interessenbereich um die Zelle zu zeichnen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild, um Auf Auswahl zuschneiden auszuwählen.

Ein neues Bildelement wird generiert. Klicken Sie auf den Bildnamen, um das zugeschnittene Zellenbild auszuwählen und die Registerkarte "Messung" zu öffnen. Um die GFP-Expression der internalisierten Vesikel zu messen, ziehen Sie "Objekte suchen" aus "Suchen" in das Sequenzfeld oben.

Stellen Sie den Kanal "Objekte suchen" auf GFP und öffnen Sie das Einstellungssymbol, um den Schwellenwert auf die Standardabweichung und die untere Grenze auf sechs festzulegen, um Objekte mit den hellsten GFP-Intensitäten auszuwählen. Legen Sie die minimale Objektgröße auf null Mikrometer pro Kubikmeter fest. Klicken Sie dann auf Messen und wählen Sie die Kanäle und die Messarten aus.

Um den Schwellenwert und die Filter zur Identifizierung der gesamten Zelle zu definieren und die gesamte GFP-Intensität zu messen, ziehen Sie ein zweites Feld Objekte suchen. Legen Sie als Nächstes den Kanal "Objekte suchen" auf GFP und die Standardabweichung auf Null fest, um Objekte mit beliebiger GFP-Intensität und minimaler Objektgröße von zwei Mikrometern kubisch auszuwählen. Ziehen Sie "Filterpopulation" in das Feld "Population zwei Objekte suchen" und wählen Sie ein Volumen von Mikrometern kubisch aus, das größer als 100 ist, um die gesamte Zelle auszuwählen und alle kleineren Objekte zu entfernen.

Wählen Sie dann Messungen und das Element Messung durchführen aus, um die Messung zu allen Zeitpunkten durchzuführen. Um die gemessene GFP-Expression in Vesikeln und die gesamte Zelle über die Zeit zu analysieren, klicken Sie auf den Dateinamen des Messobjekts unter dem Bildnamen. Um die Daten für GFP und Vesikel aus den Gesamtdaten zu extrahieren, öffnen Sie die Registerkarte Rohdaten und wählen Sie Population eins aus.

Öffnen Sie dann die Registerkarte "Analysiert", klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Daten, wählen Sie "Analyse" aus, gefolgt von der Einschränkung der Analyse, um "Grundgesamtheit eins" auszuwählen. Um die Menge an GFP in der gesamten Zelle zu messen, ändern Sie beide auf Population zwei. Wählen Sie unter Diese Daten analysieren und zusammengefasst nach die Option Summe, GFP-Farbkanal und Summe aus.

Wählen Sie dann unter Daten organisieren nach und Zeile die Option Zeitpunkt aus. Um die Daten für die Menge an GFP in Lysosomen zu extrahieren, legen Sie in der Objektsuche für die erste Population den Kanal für Objekte auf den roten Kanal fest. Legen Sie im Radsymbol im Dialogfeld den Schwellenwert auf die Standardabweichung, die untere Grenze auf sechs fest, um rote Objekte mit den hellsten Intensitäten auszuwählen, und die minimale Objektgröße auf 0,017 Mikrometer kubisch.

Wählen Sie Messungen aus, und machen Sie Messelement, um Messungen zu allen Zeitpunkten durchzuführen. Um die gemessene GFP-Expression in Lysosomen zu analysieren, klicken Sie auf den Dateinamen des Messobjekts unter dem Bildnamen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Roh" die Option "Population eins" aus, wählen Sie dann "Population eins und GFP-Farbkanal und -Summe summieren" auf der Registerkarte "Analysieren" aus, und klicken Sie wie zuvor mit der rechten Maustaste, um die Menge an GFP in den roten Vesikeln zu messen.

Vor der Ligandenstimulation sind GFP-markierte Angiotensin-Typ-1A-Rezeptoren überwiegend in der Plasmamembran lokalisiert. Aber innerhalb von 2,5 Minuten nach der Zugabe von Angiotensin zwei werden diese Rezeptoren internalisiert und bilden helle Vesikel und später Clusterbildung und große paranuklearzome Vesikel. Das durch Angiotensin zwei induzierte Kräuseln erschwert die Quantifizierung der GFP-Intensität des gesamten Vesikels, wie sie für diese repräsentativen GFP-Expressionsmessdaten beobachtet wurde.

Die Größenfilterung unterscheidet nicht zwischen den größeren Rüschen und den geclusterten Vesikel, zeigt aber, dass die GFP in kleineren Objekten früher zunimmt als die GFP in größeren Objekten. In diesem repräsentativen Zeitverlauf der GFP-Expression ohne Autofokus wurde das internalisierte GFP als prozentuales gesamtzelluläres GFP gemessen. Die Analyse des Gesamt-GFP innerhalb der Zelle zeigte, dass diese Zelle im Laufe der Zeit keine nennenswerte Photobleiche aufwies.

Die Quantifizierung des GFP in den Lysosomen transfizierter Zellen deutet auch darauf hin, dass die Intensität des in den Lysosomen vorhandenen Angiotensin-Typ-1A-Rezeptors bis zu 24 Minuten nach der Verabreichung von Angiotensin zwei nicht variiert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gesundheit der Zellen vor und während der Bildgebung zu überwachen, da das Verfahren zeitaufwändig ist und das Experiment abgebrochen werden sollte, wenn die Zellkulturen in irgendeiner Weise abnormal sind. Nach diesem Verfahren können Immunfärbung und FRET oder FLIM verwendet werden, um die subzelluläre Lokalisation der Rezeptoren zu erkennen und zu bestätigen.

Western Blots können durchgeführt werden, um die Identität und Veränderungen der Signalmoleküle zu untersuchen, die während des Rezeptortransports beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildgebung und Analyse von lebenden Zellen durchführen, um den ligandeninduzierten Transmembranrezeptor zu messen, der sowohl auf Lysosomen als auch auf andere subzelluläre Kompartimente abzielt.