Nicht-invasiv In vivo Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mithilfe optischer Bildgebung eine aktivierbare Sonde zur Beurteilung der in vivo-Aktivität von Schlüsselmatrix-Metalloproteasen (MMPs) in experimentellen Entzündungsmodellen zu visualisieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen bei entzündlichen Erkrankungen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, billig und leicht zu erlernen ist.

Darüber hinaus steht eine große Vielfalt an Sonden zur Verfügung, um verschiedene biologische Prozesse zu unterstützen. Verwenden Sie für die Induktion der rheumatoiden Arthritis zunächst ein Mikrometer, um alle Knöcheldurchmesser jedes Tieres zu messen. Heben Sie dann die erste Maus vorsichtig am Schwanz an und injizieren Sie intraperitoneal 200 Mikroliter verdünntes KBN-Mausserum, das Antikörper gegen Glucose-Six-Phosphat-Isomerase oder GPI enthält.

Setzen Sie das Tier dann wieder in seinen Käfig und messen Sie die Knöchelschwellung täglich bis zum sechsten Tag. Für die Sensibilisierung gegen Kontaktüberempfindlichkeit rasieren Sie mit einem kleinen Tierhaarschneider vorsichtig einen zwei mal zwei Zentimeter großen Bereich des Bauches einer anästhesierten Maus und tragen Sie mit einer 100-Mikroliter-Pipette 80 Mikroliter frisch zubereitete 5%ige TNCB-Lösung auf die exponierte Haut auf. Es ist sehr wichtig, Verletzungen der Haut zu keinem Zeitpunkt während des Eingriffs zu vermeiden, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen und die Ergebnisse der Studie beeinträchtigen kann.

Setzen Sie das Tier vorsichtig zurück in seinen Käfig und vermeiden Sie niedrige Körpertemperaturen während der Erholungsphase. Sechs Tage später tragen Sie mit einer Pipette 20 Mikroliter 1%ige TNCB-Lösung auf beide Seiten des rechten Ohrs auf, gefolgt von der Anwendung von 100 Mikrolitern 1%iger TNCB jeden zweiten Tag für bis zu 10 Tage und der täglichen Messung der Ohrdicke. Um die in vivo MMP-Aktivität zu messen, wirbeln Sie zunächst den aktivierbaren optischen Bildgebungsfarbstoff vorsichtig vor und beladen Sie eine 0,5-Milliliter-Insulinspritze mit zwei Nanomolaren des Farbstoffs pro Maus.

Rüsten Sie dann eine weitere Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel aus, die an einem Polyethylenkatheter befestigt ist, und legen Sie den Schwanz der ersten Maus in warmes Wasser. Wenn sich die Venen erweitert haben, führen Sie den Katheter mit der Schnittkante der Nadel in einem Winkel von 20 Grad an der distalen Seite des Schwanzes in eine erweiterte Schwanzvene ein und befestigen Sie die Spritze erneut, um die korrekte Platzierung des Katheters zu testen. Wenn der Katheter richtig positioniert ist, setzen Sie die Spritze wieder ein und injizieren Sie zwei Nanomolare der Sonde.

Ersetzen Sie dann die Spritze der optischen Bildgebungssonde durch eine Spritze mit 0,9 % Kochsalzlösung und injizieren Sie 25 Mikroliter Kochsalzlösung in die Schwanzvene, um das Totvolumen des Polyethylenröhrchens vollständig zu entfernen. Stellen Sie als Nächstes die bildgebende Scannerbox des optischen bildgebenden Scanners auf 37 Grad Celsius ein und platzieren Sie bis zu fünf Mäuse in der Scannerbox in der Mitte des Sichtfeldes. Öffnen Sie 24 Stunden nach der Injektion die Bildgebungssoftware und initialisieren Sie das System, sodass die CCD-Kamera auf die Arbeitstemperatur abkühlen kann.

Wenn das System bereit ist, stellen Sie die entsprechenden Wellenlängen und Bildgebungsparameter entsprechend der Fluoreszenz der Bildgebungssonde ein. Das Bedienfeld für die Erfassung des In-vivo-Bildgebungssystems wird angezeigt. Klicken Sie dann auf Sequenz erfassen, um die Messung zu starten.

Um die aufgenommenen Bilder zu speichern, wählen Sie den gewünschten Speicherort aus. Darüber hinaus können weitere Informationen im Fenster "Bildbeschriftungen bearbeiten" hinzugefügt werden. Hier kann unser deutlich verstärktes Fluoreszenzsignal am sechsten Tag nach der Krankheitseinleitung in den Vorderpfoten und Knöcheln von Mäusen mit rheumatoider Arthritis beobachtet werden, verglichen mit dem minimalen Signal, das bei Kontrolltieren beobachtet wurde.

Die Bioverteilungsanalyse der MMP-Aktivität in den Organen der Versuchs- und Kontrolltiere zeigt ein stark verstärktes Signal in den Knöcheln und Vorderpfoten ausschließlich in den Gelenken der Mäuse mit rheumatoider Arthritis. Interessanterweise wurde auch in beiden Nieren der Mäuse mit rheumatoider Arthritis ein erhöhtes MMP-Signal beobachtet, während die Leber und der Darm unabhängig von ihrem Status der rheumatoiden Arthritis ein robustes MMP-Signal aufweisen. Während einer chronischen Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion, die durch fünf TNCB-Herausforderungen am rechten Ohr induziert wurde, zeigte sich eine stark erhöhte MMP-Aktivität im rechten entzündeten Ohr im Vergleich zum linken, gesunden Kontrollohr.

Die semiquantitative Analyse der Signalintensität von arthritischen und gesunden Knöcheln bzw. Pfoten zeigt eine siebenfach erhöhte MMP-Signalintensität in den arthritischen Knöcheln mit einer dreifach höheren MMP-Signalintensität in den Vorderpfoten im Vergleich zu den gesunden Tieren. Akute und chronische Kontaktüberempfindlichkeitsreaktionen an den Ohren zeigen ebenfalls ein signifikant erhöhtes MMP-Signal, selbst nach nur einer Provokation, das bis zur fünften Provokation erhöht bleibt. Diese Methode lässt sich leicht in verschiedenen Versuchstiermodellen umsetzen und ermöglicht eine langfristige Nachverfolgung der zugrundeliegenden biologischen Prozesse und Therapien in vivo.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede optische Bildgebungssonde ein anderes Injektionsverfahren und eine andere Aufnahmezeit hat. Daher sollten für jeden neuen Fluoreszenzfarbstoff und jede neue optische Bildgebungssonde Längsschnittstudien durchgeführt werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei bis zu fünf Tieren in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Diese Methode ist in der Lage, Einblicke in die in vivo Mechanismen von Entzündungen zu geben, kann aber auch zur Untersuchung anderer Krankheiten wie Krebs oder Neurodegeneration eingesetzt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die optische In-vivo-Bildgebung mit einer aktivierbaren Bildgebungssonde in Modellen für entzündliche Erkrankungen einsetzen können.