Name: Nicht-invasiv In vivo Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Fluoreszenzoptische Bildgebung zur Visualisierung der MMP-Aktivität in entzündlichen Erkrankungen. Diese schnelle Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung biologischer Prozesse im lebenden Organismus.

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Wir danken Daniel Bukala, Natalie Altmeyer und Funda Cay für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Jonathan Cotton, Greg Bowden und Paul Soubiran das Manuskript für die Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung und der Medizinischen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen ( ‚‘ Promotions ‚‘) und von der DFG durch den CRC 156 (Projekt C3) unterstützt.

Alle Verfahren in diesem Papier beschrieben, folgten die Richtlinien und internationale Standards der Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der lokalen Tierschutz und Tierethikkommission des Land Kommission Tübingen, Deutschland zugelassen. 8 bis 12 Wochen alt BALB / c und C57BL / 6-Mäuse gehalten wurden auf einem 12 h: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus und wurden in IVCs und standardisierten Umweltbedingungen bei 22 ± 1 ° C in Gruppen von 2 untergebracht - 5 mit Wasser und Lebensmittel Zugang ad libitum. 1. Material Vorbereitung <ol><li> Verdünne die OI-Farbstoff für Nah-Infrarot-Fluoreszenzabbildung entsprechend dem jeweiligen Datenblatt unmittelbar vor der Injektion. Der aktivierbare OI Farbstoff (Handel Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) MMPs in vivo zu messen , ist bereit , in einer Konzentration von 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS zu verwenden. Vorsichtig schütteln oder die Lösung vor der Verwendung vortexen. für bis zu 6 Monate 8 ° C unter Lichtschutz - OI Farbstoff kann bei 2 gespeichert werden. </liAufrechtzuerhalten <li> Für intravenöse ( iv ) Injektionen bereiten wir einen venösen Katheter vor. Verwenden Sie eine 20 U (0,5 ml) Insulinspritze, gefüllt mit 0,9% Kochsalzlösung (mit 10 Injektionseinheiten von Heparin in 50 ml) und einer 30-Gauge-Nadel, die an einem Polyethylen-Katheter befestigt ist. Injektion der empfohlenen Dosis von 2 nmol pro Maus des OI-Farbstoffs. </li></ol> 2. Induktion von rheumatoider Arthritis und chronischer Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion <ol><li> Rheumatoide Arthritis: <ol><li> Verdünnen Sie 100 μl Serum (gewonnen aus K / BxN-Mäusen 10 ), die Antikörper (AB) gegen Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) 1: 1 mit 1x PBS (200 μL) enthalten, um RA zu induzieren. Das verdünnte Serum bei -80 ° C aufbewahren. Detaillierte Verfahren zur Induktion von RA werden von Monach et al. 8 </li><li> Um RA zu induzieren, heben Sie jede Maus sanft an den Schwanz und injizieren 200 μl des verdünnten Serums intraperitoneal ( ip ) am Tag 0 von tEr experimentiert. Nach der Injektion die Maus direkt zurück in den Käfig bringen. </li><li> Wahlweise messen Sie die Knöchel-Durchmesser jedes Knöchels, vor AB-Injektionen und definieren eine &quot;arthritische Punktzahl&quot; (Abbildung 1A ). Fortsetzung der Messung der Knöchelschwellung täglich bis zum Tag 6 nach GPI-Serum mit einem mechanischen Messgerät (Mikrometer). </li><li> Injizieren Sie den aktivierbaren OI-Farbstoff (Schritt 1.1 - 1.2), um die vivo- MMP-Aktivität iv in die Schwanzvene von RA-Mäusen zu messen Am Tag 5 nach GPI-Serum-Injektion und in die Schwanzvene von Kontrollmäusen. Führen Sie optische Bilderzeugungsexperimente 24 h nach der Schwanzveneninjektion durch. </li></ol></li><li> Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion: <ol><li> Zur Sensibilisierung von C57BL / 6-Mäusen wird eine 5% ige TNCB-Lösung, gelöst in einer 4: 1-Mischung aus Aceton / Öl, hergestellt. </li><li> Anaesthetize C57BL / 6 Mäuse mit 1,5% Isofluran verdampft in 100% Sauerstoff (1,5 l / min). Sobald die Mäuse anästhesiert sind, legen Sie sie in eine Selbstverrückte<html> E-Nase-Konus (eine geschnittene 5 ml Polyethylen-Spritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluran-Rohr verbunden ist) und die Anästhesie aufrecht zu erhalten. Tragen Sie Tierarzneimittel auf anästhesierte Tiere auf, um die Trockenheit der Augen zu verhindern, während sie anästhesiert werden. </li><li> Rasieren Sie den Bauch vorsichtig (2 x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann. </li><li> 80 μl der 5% TNCB-Lösung langsam auf den rasierten Abdomenbereich mit einer 100 μl Pipette auftragen, um das Tier zu sensibilisieren. Legen Sie die Maus sanft wieder in den Käfig, wobei darauf geachtet wird, dass die Augen der Maus nicht mit den Bettwaren in Berührung kommen, um Hornhautverletzungen zu vermeiden und niedrige Körpertemperaturen während der Erholungsphase zu vermeiden. </li><li> Sechs Tage nach der Sensibilisierung wird eine 1% ige TNCB-Lösung (gelöst in einer 9: 1-Mischung aus Aceton / Öl) hergestellt und 20 μl am rechten Ohr mit einer Pipette aufgetragen, um akute und chronische CHSR hervorzurufen.„&gt; 1 <ol><li> Beginnen Sie mit der 1. Herausforderung auf beiden Seiten des rechten Ohrs mit 20 &amp; mgr; l von 1% TNCB Lösung einer 100 &amp; mgr; l - Pipette und wiederholen Sie die Herausforderung jeden zweiten Tag bis zu fünf Mal (Tag 15 nach der Sensibilisierung) zu entlocken CHR (1B) . Messen Sie Ohrdicke täglich, mit einem Mikrometer Messgerät. </li></ol></li><li> Injizieren Sie den aktivierbare OI Farbstoff (ein handelsübliches Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) (Schritt 1,1-1,2) MMP - Aktivität in vivo in Mäusen CHR 12 h nach der Herausforderung zu messen. Führen optische Abbildungs Experimente 24 h nach Injektion in die Schwanzvene (iv). </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung der Tiere für Optical Imaging <ol><li> Schalter Mäusefutter (mindestens 3 Tage vor imaging) zu gering oder nicht fluoreszenzFutter (zB Mangan frei) , um die Interferenz von Auto-Fluoreszenz zu vermeiden (um 700 nm) mit dem Fluoreszenzsignal der verwendeten OI Mittel. </li><li> Legen Sie das Tier inZu einer Anästhesiebox und betäubt mit 1,5 Vol .-% Isofluran, verdampft mit Sauerstoff (1,5 l / min) (Sauerstoff kann durch Luft ersetzt werden, muss aber innerhalb eines Experiments standardisiert werden). </li><li> Wenn die Maus sichtbar anästhesiert wird, legen Sie sie in einen selbstgemachten Nasenkonus (bauen Sie durch eine geschnittene 5 ml Polyethylenspritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluranrohr verbunden ist) und pflegt die Anästhesie. </li><li> Rasiere das Tier vorsichtig auf dem Zielort (2 cm x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann. HINWEIS: Haare können das Fluoreszenzsignal während OI (abhängig vom Mausstamm, mehr oder weniger Absorption beobachtet) abhängig von der Region von Interesse (ROI) absorbieren. </li><li> Für iv Injektion, legen Sie den Schwanz der Maus in erwärmtes Wasser, um Vasodilatation zu induzieren, reinigen Sie sanft die Haut an der Injektionsstelle mit Alkohol und beginnen Sie mit dem Platzieren des KathetersDie distale Stelle des Schwanzes Legen Sie die &quot;Schnitt&quot; -Kante der Nadel in einem Winkel von 20 ° in die Schwanzvene und testen Sie die korrekte Platzierung des Katheters durch erneutes Aufhängen der Spritze. </li><li> Wenn der Katheter korrekt platziert ist, ersetzen Sie die Spritze und injizieren Sie die OI-Sonde (2 nmol). Nach der Injektion die Spritze austauschen und 25 μl 0,9% Kochsalzlösung einspritzen, um das Totvolumen des Polyethylenrohres vollständig zu löschen. HINWEIS: Die Gewebe-Halbwertszeit des verwendeten OI-Farbstoffs (eine kommerzielle Sonde mit Anregung bei 680 nm) zur Messung der MMP-Aktivität in vivo beträgt 72 h. Um einen vollständigen Abstand zu gewährleisten, wird eine Wiederinjektion des Farbstoffes nicht früher als 7 Tage nach einer vorherigen Injektion empfohlen. </li></ol> 4. Optische Bildgebung <ol><li> Legen Sie ein schwarzes Plastik- oder Papierblatt in die schwarze Schachtel des OI-Scanners in die Mitte des Gesichtsfeldes (FOV). </li><li> Stellen Sie ein Messprotokoll ein und wählen Sie die richtige Wellenlänge (Anregung: 680 ± 10 nm und eAuftrag: 700 ± 10 nm) und Abbildungsparameter. HINWEIS: In einigen Systemen OI, das Setup für mehrere Bildfarbstoffe ist vordefiniert. </li><li> Um das richtige Protokoll für Fluoreszenz-Imaging zu wählen, öffnen Sie die Imaging-Software (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) und das System initialisieren. Die meisten CCD-Kameras benötigen, um ihre Arbeitstemperatur abzukühlen, und diese 10 Minuten dauern kann. Für zuverlässige Ergebnisse, warten, bis das System bereit ist. </li><li> Beachten Sie die in vivo - Bildgebungssystem Erfassungs - Steuertafel Pop - up und jedes Filterpaar ausgewählt wird repräsentiert ein Bild in der Sequenz. In diesem Fall erwirbt ein Bild mit den Filterpaaren für die kommerzielle Farbstoff mit und eine Anregungs- und Emissionswellenlänge von 680 ± 10 nm und 700 ± 10 nm, bzw., und startet die Messung (Press „Acquire sequence“). Weitere detaillierte Anweisungen finden Sie in der Betriebsanleitung des Herstellers zu sehen. </li><li> Beschriften Sie die Bilder in geeigneter Weise und speichert die Informationen in dem „Bild bearbeitenLabels &quot;, die nach der&quot; Acquire sequence &quot;auftauchen wird. </li><li> Nehmen Sie einen Baseline-Scan von jedem Tier vor der Injektion des OI-Farbstoffs, oder verwenden Sie naive Kontrolltiere, um das Hintergrundsignal zu unterscheiden. </li><li> H nach der Schwanzveneninjektion des OI-Farbstoffs die Tiere in die Mitte des FOV stellen, in einer Position, um das höchste Signal im OI-System zu messen und die Messungen zu starten. HINWEIS: Wichtig: Hypothermie kann die Verteilung der bildgebenden Mittel signifikant beeinflussen. Stellen Sie sicher, dass die Bühne auf 37 ° C erwärmt wird, um eine Unterkühlung des Tieres zu vermeiden. Die Bildgebung kann gleichzeitig mit Tieren in Gruppen von 1 bis 5 Mäusen durchgeführt werden. Wählen Sie die Größe der FOV abhängig von der Anzahl der Tiere zur Messung zur gleichen Zeit. Sie können ein helles Feldbild aufnehmen, um zu prüfen, ob jede Maus sichtbar ist. </li></ol> 5. Datenanalyse HINWEIS: Führen Sie die Datenanalyse mit der folgenden Bildsoftware durchHerstellerprotokoll <ol><li> Für Messungen von RA, verwenden Sie die kalibrierte Einheit der Photonenemission, wie in Abbildung 2 gezeigt , während chronische CHSR als Signalintensität in Prozent (Effizienz) dargestellt werden. </li><li> Um die ROIs manuell zu zeichnen, verwenden Sie die Werkzeugplatte. Für die Analyse der RA-Bilder verwenden Sie einen standardisierten Kreis, der um das höchste Signal in allen Knöcheln und Pfoten eines jeden Tieres platziert ist. Um die CHSR zu analysieren, platziere die ROIs um das ganze rechte und linke Ohr nach dem hellen Feldbild. </li><li> Um die Photonenemission oder die Signalintensitätswerte im geplanten ROI zu messen, drücken Sie &quot;measure&quot;. Das System liefert Werte in den gezeichneten ROI für die deskriptive statistische Analyse. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

OI ist ein sehr nützliches, schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die nicht-invasive in vivo molekulare Bildgebung in der präklinischen Forschung. Eine besondere Stärke von OI ist die Fähigkeit, hochdynamische Prozesse wie entzündliche Reaktionen zu überwachen. Darüber hinaus erlaubt OI, den Kurs einer Krankheit für einen längeren Zeitraum zu verfolgen, von Tagen bis Wochen. OI hat mehrere Vorteile gegenüber anderen in vivo -Bildgebungsmodalitäten wie Positronenemissio...

Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis (RA) oder Psoriasis vulgaris werden als verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) eingestuft. 1 RA ist eine gemeinsame Autoimmunerkrankung, die durch erosive Synovitis und Gelenkzerstörung gekennzeichnet ist. 2 Inflamed arthritische Gelenke zeigen Infiltration und Proliferation von entzündlichen Zellen, eine erhöhte Expression von entzündungshemmenden Zellen, die zu Pannusbildung, Knorpel und Knochenzerstörungen führen. 3 , 4 Die Spaltung von extrazellulären Matrixmolekülen wie Kollagen durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) ist für die Gewebeumwandlung und Angiogenese essentiell und verursacht Gewebezerstörungen. 5 , 6 Kontaktüberempfindlichkeitsreaktionen (CHR) zeichnen sich durch Aggregation von Neutrophilen aus, die zu einem oxidativen Burst führen. 7 Ähnlich wie bei RA sind MMPs in CHR involviertved in Gewebeumwandlung, Zellmigration und Angiogenese, um eine chronische Entzündung zu etablieren. Um zu untersuchen, RA, die Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) -Serum Injektionsmausmodell verwendet wurde. 8 Serum aus transgenen K / B × N - Mäuse - Antikörpern gegen GPI enthält, wurde in naiven BALB / c - Mäuse injiziert , nach der rheumatischen Entzündungen innerhalb von 24 h mit maximal Knöchelschwellung am Tag 6 nach der GPI-Seruminjektion (siehe 1.1) zu entwickeln begann. chronischen CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit Trinitrochlorbenzol (TNCB) sensibilisiert auf dem Bauch zu analysieren. Das rechte Ohr wurde auf 5 mal beginnend 1 Woche nach der Sensibilisierung in Frage gestellt (siehe auch 1.1 und 1.2). Noninvasive Kleintier OI ist eine Technik , basierend auf die in - vivo - Untersuchung von Fluoreszenz-, chemiluminescent- und Biolumineszenz-Signalen, die in der präklinischen Forschung hauptsächlich verwendet werden. Die erworbenen semi-quantitativen Daten geben Einblicke in die molecular Mechanismen in den Organen und Geweben von gesunden als auch erkrankten experimentellen Tiermodellen und Längs ermöglicht Messungen verfolgen (zB therapeutische Reaktion Profile in vivo zu bewerten). Ein großer Vorteil der Langzeitstudien ist die Verringerung der Anzahl der Tiere, wie die gleichen Tiere können in Folgestudien zu mehreren Zeitpunkten anstelle der Verwendung von verschiedenen Mäusen pro Zeitpunkt gemessen werden. Die Auflösung von OI ermöglicht eine detaillierte funktionelle Bildgebung von Organen und sogar kleinere Gewebestrukturen bei Versuchstieren. Die Verwendung spezieller Anregungs- und Emissionsfilter mit einem schmalen Transmissionsspektrum, ein Schutz gegen Streulicht durch eine lichtundurchlässigen „Dunkelkammer“ sowie ein sensitiver Charged-Coupled Device (CCD) -Kamera, die in vielen Geräten bis -70 ° C abgekühlt wird, ermöglicht hochspezifische und empfindliche Messungen von Fluoreszenzsignalen. Durch die Verwendung von Fluoreszenzmitteln mit Anregungs- undEmissionsspektren im Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster (650 - 950 nm) können Signal-Rausch-Verhältnisse deutlich verbessert werden. Das Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster zeichnet sich durch eine relativ geringe Absorption des Signals durch Hämoglobin und Wasser sowie eine niedrige Hintergrund-Auto-Fluoreszenz aus. 9 Dies ermöglicht eine Eindringtiefe von bis zu 2 cm im Gewebe von kleinen Tieren. OI-Sonden können direkt ein Ziel adressieren ( zB durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper) oder im Zielgewebe ( zB durch Proteasen) aktiviert werden. Aktivierbare OI-Sonden sind aufgrund ihrer Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) in ihrer inaktivierten Form optisch schweigend zu einer Quench-Einheit, die die Anregungsenergie im Molekül in eine andere Domäne überträgt. Wenn der Farbstoff gespalten wird (z. B. durch eine Protease), wird die Energie nicht mehr innerhalb des Moleküls übertragen und ein Fluoreszenzsignal kann von OI detektiert werden. Dies ermöglicht die Konstruktion von OI-Sonden mit hohem spezifischemY für unterschiedliche biologische Prozesse und ausgezeichnete Signal-Rausch-Verhältnisse. Das folgende Protokoll erläutert im Detail die Vorbereitung der Tiere, die OI-Messungen unter Verwendung einer aktivierbaren OI-Sonde zur Abbildung der MMP-2, -3, -9 und -13-Aktivität in vivo und zwei experimentelle Modelle der Entzündung (RA, CHR).

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>Augensalbe&nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>U40 Insulinspritze</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0,28 x 0,61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>Polyethylenschlauch, Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Reguläre Schrägnadeln, 30 g</td><td>Becton Dickinson & Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>30 G Injektionskanüle</td></tr><tr><td>RTA-0011 Isofluran-Verdampfer</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeichenpapier</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>kohlschwarz</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Optisches Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Chlor-1,3,5-trinitrobenzol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>Fluoreszenz-Bildgebungsfarbstoff</td></tr><tr><td>Oditest&nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>mechanische Messung</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL-Öl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratorien&nbsp;</td><td>-</td><td>Mäuse für Versuche</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>Zur Verdünnung des RA-Serums&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette (100 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>Wird für TNCB-Anwendungen verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Rasierer&nbsp;</td><td>Wahl&nbsp;</td><td>9962</td><td>Tierhaarschneider</td></tr><tr><td>Lebendiges Bild&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td>Imaging-Software zur Messung von OI</td></tr></tbody></table>

nicht-invasiv<em&gt; in vivo</em&gt; fluoreszenzoptische bildgebung der entzündlichen mmp-aktivität unter verwendung eines aktivierbaren fluoreszenzbildgebers

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Dieses Papier beschreibt ein nicht-invasives Verfahren zur Abbildung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -Aktivität durch eine aktivierbare Fluoreszenzsonde über in vivo Fluoreszenz-optische Bildgebung (OI) in zwei verschiedenen Mausmodellen der Entzündung: eine rheumatoide Arthritis (RA) und einen Kontakt Hypersensitivitätsreaktion (CHR) Modell. Licht mit einer Wellenlänge im nahen Infrarot (NIR) Fenster (650 - 950 nm) ermöglicht eine tiefere Gewebepenetration und minimale Signalabsorption im Vergleich zu Wellenlängen unter 650 nm. Die großen Vorteile mit Fluoreszenz OI ist, dass es billig, schnell und einfach in verschiedenen Tiermodellen zu implementieren ist. Aktivierbare Fluoreszenzsonden sind in ihren inaktivierten Zuständen optisch leise, werden aber bei der Aktivierung durch eine Protease stark fluoreszierend. Aktivierte MMPs führen zur Gewebezerstörung und spielen eine wichtige Rolle für die Progression von Krankheiten bei verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) wie RA und CHR. Darüber hinaus sind MMPsDer Schlüssel Proteasen für Knorpel- und Knochenabbau und wird von Makrophagen, Fibroblasten und Chondrozyten in Reaktion auf proinflammatorische Cytokine induziert. Hier verwenden wir eine Sonde, die durch die Schlüssel MMPs wie MMP-2 aktiviert wird, -3, -9 und -13, und ein Bildgebungsprotokoll für Nah-Infrarot-Fluoreszenz OI der MMP-Aktivität in RA und Kontroll-Mäuse 6 Tage nach der Krankheitsinduktion beschreiben und wie bei Mäusen mit akuter (1x Herausforderung) und chronische (5x Herausforderung) CHR am rechten Ohr im Vergleich zu gesunden Ohren.

Rheumatoide Arthritis (RA) in naiven BALB / c - Mäusen zu induzieren, Tiere wurden ip mit Auto-Antikörper injizieren (1: 1 - Verdünnung mit 1 x PBS) gegen GPI am Tag 0. Die maximale Entzündung (Schwellung Knöchel) in diesem GPI-Serum induzierten RA - Modell ist am Tag 6 nach der Injektion 11. Daher 2 nmol des aktivierbaren OI Farbstoff wurde hergestellt und injiziert iv in die Schwanzvene von arthritischen Mäusen und gesunden Kontrolltieren am Ta...

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von Fluoreszenz - Bildgebung einer aktivierbare optische Abbildungssonde mit der in vivo Aktivität von Schlüsseln Matrixmetalloproteinasen in zwei verschiedenen Versuchsmodellen der Entzündung zu visualisieren.

Nicht-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe optischer Bildgebung einen aktivierbaren Sondenstoff zur Beurteilung der in-vivo-Aktivität wichtiger Matrix-Metalloproteasen, oder MMPs, in experimentellen Modellen der Entzündung sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den zugrundeliegenden biologischen Mechanismen bei entzündlichen Erkrankungen zu beantworten. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind ihre Schnelligkeit, Kostengünstigkeit und einfache Erlernbarkeit.Außerdem ist eine große Vielfalt an Sonden zur gezielten Untersuchung unterschiedlicher biologischer Prozesse verfügbar. Zur Induktion einer rheumatoiden Arthritis messen Sie zunächst mit einem Messschieber den Durchmesser aller Knöchel jedes Tieres. Heben Sie danach die erste Maus vorsichtig am Schwanz an und injizieren Sie intraperitoneal 200 µL verdünntes KBN-Mausserum, das Antikörper gegen Glucose-6-phosphat-Isomerase oder GPI enthält.Stellen Sie das Tier anschließend zurück in seinen Käfig und messen Sie die Schwellung des Sprunggelenks täglich bis zum sechsten Tag. Für die Kontakt-Hypersensibilisierung verwenden Sie einen kleinen Haarschneider für Tiere, um vorsichtig einen zwei mal zwei Zentimeter großen Bereich des Bauchs einer anästhesierten Maus zu rasieren, und tragen Sie mithilfe einer 100-Mikroliter-Pipette 80 Mikroliter frisch zubereiteter 5%-TNCB-Lösung auf die freigelegte Haut auf. Es ist äußerst wichtig, die Haut während des gesamten Verfahrens nicht zu verletzen, da dies zu unspezifischen fluoreszierenden Signalen im Tier führen und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann.Stellen Sie das Tier vorsichtig in seinen Käfig zurück und vermeiden Sie niedrige Körpertemperaturen während der Erholungsphase. Sechs Tage später tragen Sie mit einer Pipette 20 Mikroliter einer 1%igen TNCB-Lösung auf beide Seiten des rechten Ohrs auf, gefolgt von der Applikation von 100 Mikrolitern 1%igem TNCB alle zwei Tage über einen Zeitraum von bis zu 10 Tagen sowie täglicher Messung der Ohrdicke. Um die in-vivo-MMP-Aktivität zu messen, wirbeln Sie zunächst den aktivierbaren optischen Imaging-Farbstoff vorsichtig an und befüllen eine 0,5-Milliliter-Insulin-Spritze mit zwei Nanomolar des Farbstoffs pro Maus.Danach eine weitere Spritze mit einer Nadel der Größe 30 Gauge, die an einen Polyethylen-Katheter angeschlossen ist, bestücken und den Schwanz der ersten Maus in warmes Wasser legen. Wenn sich die Venen erweitert haben, den Katheter mit der abgeschnittenen Kante der Nadel in einem Winkel von 20 Grad von der distalen Seite des Schwanzes in eine erweiterte Schwanzvene einführen und die Spritze wieder anbringen, um die korrekte Position des Katheters zu überprüfen. Wenn der Katheter richtig positioniert ist, die Spritze austauschen und zwei Nanomolar der Sonde injizieren.Danach die Spritze der optischen Bildgebungsprobe durch eine Spritze mit 0,9 %iger Kochsalzlösung ersetzen und 25 Mikroliter Salzlösung in die Schwanzvene injizieren, um das Totvolumen des Polyethylenrohrs vollständig zu spülen. Anschließend die Kammer des optischen Bildgebungssystems auf 37 Grad Celsius einstellen und bis zu fünf Mäuse in der Mitte des Sichtfeldes in die Kammer platzieren. 24 Stunden nach der Injektion die Bildgebungssoftware öffnen und das System initialisieren, wobei die CCD-Kamera auf die Betriebstemperatur abgekühlt wird.Wenn das System bereit ist, stellen Sie die geeigneten Wellenlängen und Bildgebungsparameter gemäß der Fluoreszenz der Bildgebungs-Sonde ein. Die Steuerungsoberfläche des In-vivo-Bildgebungssystems wird angezeigt. Klicken Sie anschließend auf „Sequenz erfassen“, um die Messung zu starten.Um die aufgenommenen Bilder zu speichern, wählen Sie den gewünschten Speicherort aus. Zusätzlich können weitere Informationen im Fenster zur Bearbeitung der Bildbeschriftungen hinzugefügt werden. Hier ist unser deutlich verstärktes fluoreszierendes Signal an den Vorderpfoten und Knöcheln von Mäusen mit rheumatoider Arthritis am sechsten Tag nach der Erzeugung der Erkrankung im Vergleich zum minimalen Signal bei Kontrolltieren zu beobachten.Die Bioverteilungsanalyse der MMP-Aktivität in den Organen der Versuchs- und Kontrolltiere zeigt ein stark erhöhtes Signal in den Knöcheln und Vorderpfoten ausschließlich in den Gelenken der Mäuse mit rheumatoider Arthritis. Interessanterweise wurde ein erhöhtes MMP-Signal ebenfalls in beiden Nieren der Mäuse mit rheumatoider Arthritis beobachtet, während Leber und Darm unabhängig vom rheumatoiden Arthritis-Status ein starkes MMP-Signal aufweisen. Während einer chronischen Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion, die durch fünf TNCB-Herausforderungen am rechten Ohr ausgelöst wurde, zeigt das entzündete rechte Ohr im Vergleich zum linken, gesunden Kontroll-Ohr eine stark erhöhte MMP-Aktivität.Eine semiquantitative Analyse der Signalintensität arthritischer und gesunder Knöchel oder Pfoten zeigt eine siebenfach erhöhte MMP-Signalintensität in den arthritischen Knöcheln, wobei in den Vorderpfoten eine dreifach höhere MMP-Signalintensität im Vergleich zu gesunden Tieren nachgewiesen wurde. Auch bei akuten und chronischen Kontakt-Hypersensitivitätsreaktionen an den Ohren tritt bereits nach nur einer Provokation eine signifikant erhöhte MMP-Signalintensität auf, die bis zur fünften Provokation erhöht bleibt. Diese Methode kann problemlos in verschiedenen experimentellen Tiermodellen eingesetzt werden und ermöglicht eine Langzeit-Beobachtung der zugrundeliegenden biologischen Prozesse und Therapien in vivo.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass jede optische Bildgebungs-Sonde ein anderes Injektionsverfahren und eine unterschiedliche Aufnahmedauer aufweist. Daher sollten für jeden neuen fluoreszierenden Farbstoff und jede neue optische Bildgebungs-Sonde Längsschnittstudien durchgeführt werden. Wenn das Verfahren einmal beherrscht ist, kann es bei bis zu fünf Tieren in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, sofern es korrekt angewendet wird.Diese Methode ermöglicht Einblicke in die In-vivo-Mechanismen der Entzündung, kann aber auch zur Untersuchung anderer Erkrankungen wie Krebs oder Neurodegeneration angewendet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die In-vivo-Optische Bildgebung mit einer aktivierbaren Bildgebungssonde in Modellen entzündlicher Erkrankungen verwendet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Beurteilung der intestinalen Makrophageninfiltration in einem Mausmodell der Kolitis mittels Fluoreszenz-vermittelter Tomographie (FMT). Bei der Induktion einer Kolitis bei einer Maus über Dextran-Natriumsulfat (DSS) werden dem Tier Antikörper injiziert, die den F4/80-Glykoproteinmarker auf infiltrierten Makrophagen im Dickdarm erkennen. Die Maus wird dann in einem FMT-Gerät abgebildet, wo die Fluoreszenz- und Reflexionssignale in ein dreidimensionales...

Verwendung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie zur Beurteilung von Darmentzündungen bei Mäusen

Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.

In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Die Verwendung von Fluorophoren für die In-vivo-Bildgebung kann durch Opsonisierung, schnelle Clearance, geringe Nachweisempfindlichkeit und zytotoxische Effekte auf den Wirt stark eingeschränkt werden. Die Verkapselung von Fluorophoren in Liposomen durch Filmhydratation und Extrusion führt zu einer Fluoreszenzlöschung und einem Schutz, der eine in vivo-Bildgebung mit hoher Nachweisempfindlichkeit ermöglicht.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur In-vivo- Optical Imaging

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Erfahren Sie die nicht-invasive Fluoreszenzoptische Bildgebung zur Visualisierung der MMP-Aktivität in entzündlichen Erkrankungen. Diese schnelle Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung biologischer Prozesse im lebenden Organismus.

Nicht-invasiv In vivo Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers (Video) | JoVE Journal

Nicht-invasiv

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