Name: Ein Ex Vivo Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Lernen Sie die Ratten-Mesenterium-Kulturmethode für Time-Lapse-Imaging von mikrovaskulären Netzwerken. Diese ex vivo Technik ermöglicht die Untersuchung von Endothelzell-Interaktionen und anti-angiogenen Wirkungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 an WLM und das Tulane Center for Aging. Wir danken Matthew Nice für seine Hilfe bei der Bearbeitung des Protokolltextes.

Alle Tierversuche und Verfahren wurden von der Tulane University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. 1. Chirurgisches Verfahren einrichten <ol><li> Autoklav Instrumente, chirurgische Versorgung und Kultur liefert vor der Operation. Chirurgische Versorgung für jede Ratte umfassen: 1 Tuch, 1 drapieren mit vorgeschnittenen Loch (0,5 Zoll x 1,5 Zoll) in der Mitte, Gazekompressen und 1 saugfähige Unterlage. Chirurgische Instrumente umfassen: 1 Skalpell mit einer Reihe 10 Klinge, 2 Paar Pinzette, und ein Paar von einer feinen Schere. Kultur Lieferungen umfassen: 1 Tuch, 1 Pinzette und vorbereitet 6-Well-Platte Einsätze mit Polycarbonat-Filtern. </li><li> Sterilisieren eine Plexiglas-Plattform, eine chirurgische Bühne und eine chirurgische Benchtop Raum mit 70% Ethanol. Halten Sie die OP-Stufe in einer sterilen Schale bis zum Gebrauch. <ol><li> Erstellen Sie eine chirurgische Bühne durch einen etwa 2 in von 1 in Loch in der Mitte einer 100 mm Kulturschale zu bohren. Als nächstes verwenden Schmirgelpapier glättenScharfe Kanten und eine Schicht aus Silikonkleber auf die Kanten des Lochs fügen Sie eine erhabene Oberfläche für die Gewebe zu schaffen. </li><li> Alternativ entwerfen die chirurgische Phase CAD - Software und von 3-D - Druck (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Legen Sie eine sterile saugfähige Unterlage nach unten und legen ein Plexiglas-Plattform oben drauf. Legen Sie das Tuch, ohne ein vorgeschnittenes Loch, über eine beheizte Pad neben dem absorbierenden underpad. </li><li> Pre-warmer steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Medien und Kochsalzlösung auf 37 ° C. Ort Medien und PBS in getrennten Kulturschalen oben auf dem Heizkissen und Stelle saline in einem 50 ml konischen Röhrchen neben der chirurgischen Einrichtung. </li><li> Sicherstellen, dass alle Pakete vor dem Beginn der Operation geöffnet werden sterile Handhabung aller Materialien zu gewährleisten. Eine vollständige Liste der gemeinsamen Werkzeuge in diesem Verfahren verwendet werden, in der aufgelistet Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge. </li></ol> 2. Mesentery Tissue Ernte <ol><li> Verwenden erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g; 6 - 8 Wochen alt). Andere Stämme und Alter der Ratten kann ersetzt werden. </li><li> Anästhesieren die Ratte über eine intramuskuläre Injektion von Ketamin (80 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (8 mg / kg Körpergewicht). Bestätigen Sie die Ratte unter Narkose ist zwischen den Zehen durch Kneifen für eine Reflexantwort zu überprüfen; sollte es keine geben. Präemptive Analgesie für dieses Terminal Verfahren ist nicht erforderlich. </li><li> Rasieren Sie den Bauchbereich und entfernen Sie restlichen Haare mit Haarentfernungs-Creme. Wischbauchhaut zweimal mit 70% igem Isopropylalkohol gefolgt von Povidon-Iod. Für die Wischtücher in der Mitte der Operationsstelle beginnen und so überlappen, um keine Bereiche in einer kreisförmigen Weise nach außen des vorbereiteten Bereichs bewegen, die zuvor mit dem gleichen Stück steriler Gaze oder steriles Wattestäbchen geschrubbt der Chirurg sollte. Dann übertragen Tier zum sterilen OP-Setup und legen oben auf dem Plexiglas platbilden. </li><li> Mit einem Skalpell, machen Sie eine 0,75 in - 1,25 in Einschnitt im Darm ab dem 1. in unterhalb des Brustbeins. Achten Sie darauf, nicht den Darm oder Gekröse (1 Schicht der Haut, 1 Schicht von Bindegewebe und 1 Muskelschicht) zu durchstechen. </li><li> Legen Sie ein Tuch mit einem vorgeschnittenen Loch über den Einschnitt und legen Sie eine sterile OP-Bühne oben auf dem Tuch. Sicherstellen, dass die Öffnung steht im Einklang mit dem Einschnitt. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen zu lokalisieren und das Ileum durch die chirurgische Bühnenöffnung herausziehen. </li><li> Ziehen Sie 6 - 8 mesenterialen Fenster , durch die Bühne mit Wattestäbchen, und darauf achten , nicht die Fenster zu berühren (Abbildung 1). Gewebe werden typischerweise aus dem Ileum Bereich des Dünndarms ausgehend in der Nähe des Blinddarms geerntet. Halten Sie ausgesetzt Gewebe feucht mit erwärmter steriler Kochsalzlösung als eine sterile Spritze erforderlich unter Verwendung der Lösung tropft. </li><li> Euthanize die Ratte über Intrakardial von Pentobarbital - Natrium (0,2 ml pro Ratte). Vor mir Entfernensenteric Fenster, sicherstellen, dass die Ratte durch Palpation des Herzens eingeschläfert wird; es sollte kein Impuls sein. </li><li> Entfernen gewünschte Gekröse Gewebe durch Pinzette mit dem Fettpolster und einer feinen Schere zu greifen, das Fenster zu schneiden. Lassen Sie eine Grenze von Fett (2 mm) rund um das Fenster. Waschen Sie Gewebe einmal in erwärmte sterile PBS und einmal in den Medien. </li><li> Zurück exteriorisierten Ileum in die Bauchhöhle und entsorgen Tier gemäß gültiger Richtlinien. </li></ol> 3. Mesentery Gewebekultur für Zeitrafferstudien <ol><li> Transfer autoklaviert Kultur liefert und Gewebe zu einer sterilen Laminar-Flow-Haube (siehe Abschnitt 1.1). </li><li> Verwenden einer Pinzette jedes Gewebe auf einem Polycarbonat-Filtermembran zu übertragen. Schnappen Gewebe durch das Fettpolster zu vermeiden, dass die Gefäße schädigen. </li><li> Schnell verbreitete das Gewebe, das die Fettpolster verwenden, wobei darauf geachtet, das Fenster nicht zu berühren. Kehren Sie die Einlage mit dem Gewebe in den Boden einer 6-Well - Platte geben und mit 3 ml Medium (Abbildung 1 </strong&gt;). Typische Medien für dieses Verfahren verwendet wird, umfasst Minimum Essential Medium (MEM) mit 1% Penicillin Streptomycin (PenStrep) und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Medien können mit anderen Seren und / oder Wachstumsfaktoren, die Angiogenese zu stimulieren, ergänzt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 für jedes Gewebe und Kultur in Standard - Inkubator Bedingungen (5% CO 2, 37 ° C) für bis zu 5 Tage. </li></ol> 4. Time-Lapse-Imaging von Mesentery Tissue <ol><li> Am Tag der Bildgebung, ergänzen die Medien in jeder Vertiefung mit konjugierten BSI-Lektin und unter Standardkulturbedingungen für 30 min inkubiert. Waschen Sie Gewebe zweimal mit Lektin-freien Medien. BSI-Lektin Fleck auf dem Gekröse Gewebe für bis zu 3 Tage in der Kultur sichtbar bleiben. </li><li> Übertragen Sie die Platte zu einem Mikroskoptisch. Identifizieren Sie Blut- und Lymphgefäße auf der Grundlage ihrer Morphologie und Netzstruktur. </li><li> Suchen Sie eine gewünschte Netzbereich auf jedem Gewebe und nehmen Bilder. Beachten Sie die BildgebungLage die gleiche Region zu gewährleisten wird für nachfolgende Bilder aufgenommen werden. Wenn eine motorisierte Bühne verwenden, dokumentieren die Koordinaten. </li><li> Zurück Gewebe in den Inkubator und weiter zu Kultur, bis der gewünschte Endpunkt. Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,3 je nach Bedarf, je nach gewünschten experimentellen Zeitpunkten. </li></ol> 5. Gewebeimmunmarkierung <ol><li> BSI-Lektin Labeling <ol><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei 37 ° C mit 1.40 FITC-konjugiertem Lektin in Medien (2,5 ml Antikörperlösung pro Well in 6-Well-Platte) durch zwei Spülungen mit Medien folgt. Für Spülungen, fügen Sie Medien und dann sofort zu ersetzen. </li></ol></li><li> Live / Dead Labeling <ol><li> Inkubieren Gewebe für 10 min bei 37 ° C mit 1: 500 2 mM Ethidium Homodimer-1 und 1: 500 1 mM Calcein AM in Medium (2,5 ml Antikörperlösung pro Well in 6-Well-Platte) durch zwei Spülungen mit Medien folgt. </li></ol></li><li> BSI-Lektin / NG2 Labeling <ol><li> Spread Gewebe auf einem Mikroskop geschobene (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 Kaninchen-polyklonalen Antikörper NG2 und 5% normalem Ziegenserum (NGS). Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 goat anti-rabbit CY2-konjugiertem Antikörper (GAR-CY2) und 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. Für Spülungen, fügen PBS und dann sofort zu ersetzen. </li><li> Um die Folien montieren, decken Gewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Labeling<ol><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 200 monoclonalen Maus-biotinyliertem CD31-Antikörper und 1: 100 Kaninchen polyklonalen LYVE-1-Antikörper in PBS + 0,1% Saponin + 2% Rinderserumalbumin (BSA) + 5% NGS . Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 500 CY3-konjugiertem Streptavidin-Antikörper und 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und setzen Sie ein Deckglas an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-Lektin Labeling <ol><li> 1 mg / ml BrdU auf Medien und Gewebemedien mit BrdU-Lösung zu ersetzen. bei 37 ° C für 2 h inkubiert. </li><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Gewebe DNA in 2 M HCl für 1 h bei 37 ° C denaturieren. Waschen Gewebe in PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 monoklonaler Maus-anti-BrdU in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 Ziegen- anti-Maus-Cy3-konjugiertem Antikörper (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li&gt; Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> BSI-Lektin / CD11b Kennzeichnung <ol><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100-Maus-anti-Ratten-CD11b in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Sie Gewebe mit PBS+ 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll dokumentiert ein Verfahren zur Verwendung der Ratte Gekröse Kulturmodell als Ex - vivo - Werkzeug für Zeitraffer-Bildgebung von mikrovaskulären Netzwerk Wachstum. Frühere Arbeiten in unserem Labor wurde für 1) Angiogenese 8, 2) Lymphangiogenese 8, 3) pericyte-Endothel-Interaktionen 8, die Verwendung unseres Modells etabliert und 4) anti-angiogenen Drogen - Test - 9. Die Fähigkeit zum Abbilde...

Die mikrovaskuläre Netzwerk Wachstum und Umbau sind gemeinsame Nenner für die Gewebefunktion, Wundheilung, und mehrere Pathologien und ein Schlüsselprozess ist die Angiogenese, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden 1, 2. Für das Tissue Engineering neue Schiffe oder angiogenen Therapien entwerfen, das Verständnis der Bedeutung der zellulären Dynamik an der Angiogenese beteiligt ist kritisch. Jedoch ist dieses Verfahren komplex. Es kann an spezifischen Stellen innerhalb einer mikrovaskulären Netzwerk variieren und mehrere Zelltypen (zB endothelialen Zellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Makrophagen, Stammzellen) beinhaltet und mehrere Systeme (lymphatischen Netze und neuronale Netze). Obwohl in vitro Modellen enorm , um die Beziehung zwischen verschiedenen Zellen beigetragen haben , bei der Angiogenese 3, deren physiologische Relevanz beteiligt Prüfung kann aufgrund thei untergraben<html> begrenzter Komplexität r und die Tatsache , dass sie eine in vivo - Szenario nicht genau reflektieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, dreidimensionale Kultursysteme 3, ex vivo - Gewebemodelle 4, mikrofluidische Systeme 5, 6 und Rechenmodelle 7 wurden in den letzten Jahren entwickelt und eingeführt. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf für ein Modell mit Zeitraffer Fähigkeit zur Angiogenese in intakten mikrovaskulären Netzwerke ex vivo zu untersuchen. Der Aufbau neuer Zeitraffer-Modelle für die Angiogenese-Studien mit diesem Grad an Komplexität wird ein unschätzbares Werkzeug zur Verfügung stellen, die zugrunde liegenden Mechanismen regulieren die Angiogenese und zur Verbesserung der Therapien zu verstehen. Ein mögliches Modell, das die Ex - vivo - Untersuchung der Angiogenese in einem intakten mikrovaskulären Netzwerk ermöglicht , ist die Kulturmodell Ratte Gekröse&gt; 8. In einer neueren Arbeit haben wir gezeigt, dass Blut-und lymphatischen mikrovaskuläre Netzwerke nach Kultur lebensfähig bleiben. funktionellen pericyte-Endothel-Interaktionen zu untersuchen, Blut-und lymphatischen endothelialen Zellverbindungen und Zeitraffer-Bildgebung Noch wichtiger ist, kann die Ratte Gekröse Kulturmodell verwendet werden. Das Ziel dieser Arbeit ist unser Protokoll für den Zeitraffer-Bildgebungsverfahren bereitzustellen. Unsere repräsentative Ergebnisse dokumentieren die mehrere Zelltypen, die mit Serum nach der Stimulation der Angiogenese lebensfähig bleiben und bieten Beispiele für die Verwendung dieser Methode für gewebespezifische angiogene Antworten sowie Endothelzellen Tracking-Studien zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Abdecktuch</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12" x 12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Skalpellgriff, #3; Fest; 4" Länge</td></tr><tr><td>sterile chirurgische Klinge</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Edelstahl; Größe 10</td></tr><tr><td>Kulturschale (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette (gebogene Pinzette)</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Mikro-Präparierzange; Gezahnt; Leichte Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette (gerade Pinzette)</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5130</td><td>Mikro-Präparierzange; gezackt, gerade; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge</td></tr><tr><td>Noyes Mikroschere</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Mikro-Präparierfederschere; gerade, scharf-stumpfe Spitzen; 13 mm Schneide; 0,25 mm Spitzenbreite, 4 1/2" Gesamtlänge</td></tr><tr><td>Mullpads</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Unsterile Baumwoll-Mullschwämme; 4" x 4" 12-lagige</td></tr><tr><td>Applikatoren mit Baumwolltipp</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" Länge; Holzschaft; Nur zum Einmalgebrauch</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>mit flachem Boden und Deckel mit geringer Verdunstung; Styropor; Pyrogenfreie</td></tr> sterile <tr><td>Spritze 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Spitze</td></tr><tr><td>Sterile Schüssel</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Peel-Beutel; Blau; Sterile</td></tr><tr><td>Einweg-6-Well-Platteneinsätze (CellCrown-Einsätze)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6-Well-Platteneinsätze; Unsterile</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Filtermembran</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isoporen-Membranfilter; Polykarbonat; Hydrophil; 5.0&nbsp; &Mikro; m, 47&nbsp; mm, White Plain</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Bestellt bei MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Wirkstoff: Pro 100 ml 390 mg Pentobarbital-Natrium, 50 mg Phenytoin-Natrium</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Fort Dodge Animal Health (Bestellt bei MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>LLOYD. Inc. (Bestellt bei MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod</td><td>Operand</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiert Lectin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitinsulfat Proteoglykan Antikörper</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antikörper</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Cy2-konjugierter Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Cy3-konjugierter Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Cy3-konjugierter Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Lebend-/Tot-Lebensfähigkeits-/Zytotoxizitätskit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-2'-Desoxyuridin</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Maus-Anti-Bromodeoxyuridin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Klon Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Ratte CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; ex vivo</em&gt; methode für time-lapse-imaging von kultivierten ratten mesenteriale mikrovaskuläre netzwerke

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen beinhaltet Endothelzellen, Perizyten, glatte Muskelzellen, Immunzellen und die Koordination mit der Lymphgefäße und Nerven. Die Multi-Zelle, erfordern Multi-System-Interaktionen, die Untersuchung der Angiogenese in einem physiologisch relevanten Umfeld. Während also die Verwendung von in vitro-Zellkulturmodelle mechanistische Erkenntnisse zur Verfügung gestellt haben, eine gemeinsame Kritik ist , dass sie rekapitulieren nicht die Komplexität , die mit einer mikrovaskulären Netzwerk verbunden. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fähigkeit zu demonstrieren, Zeitraffer-Vergleiche von intakten mikrovaskuläre Netzwerke vor und nach der Angiogenese Stimulation in kultivierten Ratte Gekröse Gewebe zu machen. Kultivierte Gewebe enthalten mikrovaskuläre Netzwerke, die ihre Hierarchie pflegen. Immunhistochemischen Markierung bestätigt das Vorhandensein von Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Blutgefäße und Lymphgefäße. In einemddition, Etikettieren Gewebe mit BSI-Lektin ermöglicht Zeitraffer-Vergleich von lokalen Netzregionen vor und nach dem Serum oder Wachstumsfaktor-Stimulation durch erhöhte Kapillare sprießen und Gefäßdichte gekennzeichnet. Im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmodelle, stellt dieses Verfahren ein Werkzeug für die Endothel-Zelllinie Studien und Gewebe-spezifische angiogene Arzneimittel Auswertung in physiologisch relevanten mikrovaskuläre Netzwerke.

Nach 3 Tagen in Kultur Gewebe wurden mit einer Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit markiert , um die Lebensfähigkeit des microvasculature bei der Ratte Gekröse Kulturmodell (Abbildung 2A) zu demonstrieren. Die Mehrzahl der Zellen, die in der Gekröse lebensfähig blieben in der Kultur, in der Endothel-Zellen identifiziert wurden in mikrovaskulären Segmente auf ihren Standort. Endothelzellproliferation wurde auch von Lektin / BrdU - Markierung (2D)</stro...

Angiogenese beinhaltet Interaktionen zwischen mehreren Zellen und mehreren Systemen, die in einer physiologisch relevanten Umgebung untersucht werden müssen. Das Ziel dieser Studie ist es, die Fähigkeit des Rattenmesenterienkulturmodells zu demonstrieren, Zeitraffervergleiche von intakten mikrovaskulären Netzwerken während der Angiogenese durchzuführen.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Anwendung des Ratten-Mesenterium-Kulturmodells zur zeitraffenden Untersuchung der ex vivo Remodellierung mikrovaskulärer Netzwerke zu demonstrieren, um Wechselwirkungen zwischen Parasiten und endothelialen Zellen, Verbindungen zwischen blut- und lymphendothelialen Zellen oder die Wirkung antiangiogener Medikamente zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrovaskulären Remodellierung zu beantworten, beispielsweise, wie mikrovaskuläre Strukturen wissen, wohin sie wachsen sollen, und welches Schicksal endotheliale Zellsegmente erleiden. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass intakte, funktionelle mikrovaskuläre Netzwerke vor und nach dem Wachstum ex vivo abgebildet werden können.Den Ablauf wird Sadegh Azimi demonstrieren, ein Doktorand in unserem Labor, der die Methode entwickelt hat. Beginnen Sie damit, eine mit Ethanol sterilisierte Plexiglas-Plattform auf ein steriles, saugfähiges Unterpad und eine anästhesierte erwachsene männliche Ratte auf die Plattform zu legen. Desinfizieren Sie den rasierten Bauchbereich der Ratte mit zwei Abtupfern mit 70 % Isopropylalkohol, gefolgt von Povidon-Iod. Beginnend einen Zoll unterhalb des Sternums, verwenden Sie ein Skalpell, um einen dreiviertel bis eineinviertel Zoll langen Schnitt durch Haut, Bindegewebe und Muskulatur in den Darm vorzunehmen. Legen Sie dann einen Tuchüberzug mit einem vorgeschnittenen Loch über das Tier und platzieren Sie eine chirurgische Halterung über den Tuchüberzug, wobei Sie darauf achten, die Öffnungen beider Materialien mit dem Schnitt zu alignieren. Ziehen Sie mithilfe steriler Wattestäbchen das Ileum zusammen mit sechs bis acht mesenterialen Fenstern durch die Öffnung der chirurgischen Halterung.Bei Bedarf sterile Kochsalzlösung mit einer sterilen Spritze auf die exponierten Gewebe tropfen, die eine Temperatur von 37 Grad Celsius hat. Wenn alle Fenster nach außen geführt wurden, mit einer Pinzette ein Fettlager fassen und mit einer Schere die Fenster entnehmen, wobei ein zwei Millimeter breiter Fettrand um jedes mesenteriale Gewebe belassen wird. Achten Sie darauf, dass die Pinzette die mesenterialen Fenster nicht berührt, indem nur die umgebenden Fettränder angefasst werden.Jedes Fenster nach und nach ein Mal mit 37 Grad Celsius warmer PBS und ein Mal mit 37 Grad Celsius warmem Medium waschen. Nachdem alle Fenster isoliert wurden, das Ileum in die Bauchhöhle zurücklegen. In einer sterilen laminarer Luftstrom-Werkbank mit einer Pinzette jedes mesenterische Gewebe am Fettrand fassen und auf die Polycarbonat-Filtermembran eines Zellkulturplatten-Einsatzes übertragen.Verwenden Sie das Fettpolster, um die Gewebeproben schnell zu verteilen, und achten Sie darauf, die Fenster nicht zu berühren. Drehen Sie danach den Insert um und stellen Sie ihn in eine Vertiefung einer sechswelligen Platte, sodass das Gewebe flach auf dem Boden der Vertiefung liegt. Bedecken Sie das Gewebe mit drei Millimetern Medium und überführen Sie die verbleibenden Fenster auf die gleiche Weise in die Platte.Kultivieren Sie die Mesenteriumfenster anschließend bis zu fünf Tage lang unter standardmäßigen Bedingungen eines Gewebekultur-Inkubators. Ergänzen Sie am Tag der Bildgebung die Kulturen mit konjugiertem BSI-Lektin und stellen Sie die Platte erneut in den Inkubator. Nach 30 Minuten waschen Sie die Proben zwei Mal mit lektinfreiem Medium und übertragen die Platte auf den Objektträger des Fluoreszenzmikroskops.Identifizieren Sie die Blut- und Lymphgefäße anhand ihrer Morphologie und Netzwerkstrukturen. Suchen Sie anschließend einen interessierenden Netzwerkbereich in jedem Gewebe, um Bilder aufzunehmen, und notieren Sie die Position, um sicherzustellen, dass derselbe Bereich in nachfolgenden Aufnahmen erfasst wird. Sobald alle Bilder gewonnen wurden, bringen Sie die Proben in den Inkubator zurück, bis zur nächsten Bildgebungssitzung oder bis zum vorgesehenen experimentellen Versuchsendpunkt.Nach drei Tagen in Kultur sind die meisten Zellen im Mesenterium vital, wobei das Vorhandensein von Endothelzellen durch ihre Lokalisation in den mikrovaskulären Segmenten bestätigt wird. Die Proliferation der Endothelzellen kann ebenfalls durch Lectin/BrdU-Markierung nachgewiesen werden, während das Vorhandensein von glatten Muskelzellen und Parasiten entlang der Gefäße mittels NG2-Markierung bestätigt werden kann. Die Markierung verzweigter lymphatischer und blutgefäßlicher mikrovaskulärer Netzwerke bestätigt zudem die Erhaltung des lymphatischen Zellphänotyps im kultivierten Gewebe.Die Supplementierung des Kulturmediums für das Mesenteriumfenster mit 10 % Serum über einen Zeitraum von drei Tagen induziert eine starke angiogene Reaktion, bei der nach fünf Tagen Stimulationsdauer neue Gefäßabschnitte und Kapillarauswüchse nachweisbar sind. Die Zeitrafferaufnahmen ermöglichen die Quantifizierung der Anzahl der Gefäße pro Gefäßareal sowie der Anzahl der Kapillarauswüchse pro Gefäßareal anhand eines einzelnen 4×-Bildes pro Gewebe. Zeitraffer-Vergleiche von Netzwerkregionen erlauben zudem die Verfolgung von Endothelzellenabschnitten und die Identifizierung von Fehlbildungen bei Blut- und Lymphgefäßen.Außerdem bestätigt die Markierung mit Lectin und Cd11b das Vorhandensein von interstitiellen residenten Makrophagen in den umgestaltenden Netzwerken. Sobald die Technik beherrscht ist, sollte sie in weniger als vier Stunden abgeschlossen werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ratten-Mesenteriumsgewebe gewinnt, kultiviert und mittels Zeitrafferaufnahmen bildet.

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Die Funktion der vaskulären Zellen hängt von der Aktivität der intrazellulären Botenstoffe ab.  Beschrieben wird hier ein ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren, das die Messung des intrazellulären Calcium- und Stickoxidspiegels als Reaktion auf physiologische und pharmakologische Reize in einzelnen endothelialen und glatten Muskelzellen einer isolierten Aorta ermöglicht.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Die modifizierte Landis-Technik ermöglicht die paarweise Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Mesenterium von normalen und genetisch veränderten Ratten unter Kontroll- und Testbedingungen unter Verwendung von Mikroperfusionstechniken. Es bietet eine bequeme Methode zur Bewertung von Mechanismen, die die Durchlässigkeit von Mikrogefäßen und den transvaskulären Austausch unter physiologischen Bedingungen regulieren.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Messung von zytosolischem, freiem Calcium [Ca2+]i und Gefäßdurchmesser in kontrahierenden Lymphgefäßen in Echtzeit und zur Berechnung der absoluten Ca2+ -Konzentrationen sowie der Kontraktilitäts-/Rhythmizitätsparameter. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Ca2+ und kontraktile Dynamik unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu untersuchen.

Echtzeit-Auswertung der absoluten, zytosolischen, freien ca2+ und der entsprechenden Kontraktilität in isolierten, druckbeaufschlagten Lymphgefäßen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Lernen Sie die Ratten-Mesenterium-Kulturmethode für Time-Lapse-Imaging von mikrovaskulären Netzwerken. Diese ex vivo Technik ermöglicht die Untersuchung von Endothelzell-Interaktionen und anti-angiogenen Wirkungen.

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