Name: QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Erfahren Sie QTL-Mapping und CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Identifizierung von Resistenzgenen bei Toxoplasma gondii. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Analysen für Parasitologie-Forschung.

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Wir danken L. David Sibley und Asis Khan für ihren Beitrag zur ursprünglichen Publikation, auf der diese Protokolle basieren. Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health gewährt AI108721 finanziert.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Protokolle stellen mehrere Methoden vor, die, wenn sie kombiniert sind, die Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in T. gondii ermöglichen . Vor allem zwei waren integraler Bestandteil des Projektes, der relativ erfahrenen Methode der QTL-Kartierung und der kürzlich entwickelten Methode der CRISPR / Cas9-Genbearbeitung. Lander und Botstein veröffentlichten 1989 ihr einflussreiches Papier, das eine QTL-Kartierung zeigte, die genetische Loci mit Phänotypen korreliert 36 . In jüngster Zeit haben Dounda und Charpentier im Jahr 2012 das CRISPR / Cas9-Editing-System in Streptococcus pyogenes 22 beschrieben , das in vielen verschiedenen Modellen, wie zB T. gondii 13 , 17, als genetisches Werkzeug schnell angepasst wurde . Beide Methoden waren hier nützlich, wo QTL-Mapping den Locus definiert, der die Arzneimittelresistenzmutation enthielt, die letztlich mit der WGS-basierten SNP-Detektion identifiziert wurde, und die CRISPR / Cas9-Bearbeitung lieferte die ich<html> Ans zu bestätigen, dass SNR1 das Sinefungin-Arzneimittelresistenzgen ist. Die ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kreuz 8 wurde ursprünglich entwickelt, um einen Virulenz-Phänotyp 19 zu verhören, aber die Elternstämme hatten auch einen zusätzlichen phänotypischen Unterschied, für den das kausale Gen nicht bekannt war, Sinefungin-Resistenz im VAND-Elternteil. Dies unterstreicht einen Vorteil von Kreuzen, dass sie wiederverwendet werden können, wenn zusätzliche phänotypische Unterschiede in den Eltern beobachtet werden. Dies war der Fall für ein weiteres Toxoplasma- Kreuz, Typ 2 x Typ 3, wo mehrere Gene, die an Virulenz beteiligt waren, durch die Abbildung mehrerer Phänotypen 37 , 38 , 39 , 40 gefunden wurden . Bisher wurden vier verschiedene T. gondii Kreuze beschrieben und verwendet, um Gene zu kennzeichnen, die für Phänotypen verantwortlich sindSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , die alle das Potenzial haben, wiederverwendet zu werden, um neue Phänotypen abzubilden, für die die genetische Basis unbekannt ist. Entlang dieser Linien wurden die Genome für 62 T. gondii- Stämme, die die bekannte globale genetische Diversität darstellen, sequenziert 43 . Neue Kreuze konnten aus diesem Pool für Stämme gemacht werden, die sich in interessanten Phänotypen unterscheiden. Nachdem ich die Vorteile der QTL-Kartierung gepriesen habe, muss man sagen, dass die Erzeugung eines Kreuzes kein geringfügiges Unternehmen ist. Es gibt andere Methoden, die verwendet werden können, um kausale Gene zu identifizieren. Eine leistungsstarke Technik nutzt die chemische Mutagenese, um Mutanten zu erzeugen, die auf Phänotypen untersucht werden können. Um das kausale Gen zu finden, können Mutanten entweder mit Cosmid-Bibliotheken 44 ergänzt werden oder Genom-Resequencing-Verfahren können verwendet werden, um die kausale Mutation zu finden. Für moSiehe hierzu zwei JoVE-Artikel von Coleman et al. Und Walwyn et al. Die diese Ansätze 46 , 47 skizzieren. Viele der Schritte zur Identifizierung der kausalen SNF-Mutation (Protokolle 2 und 3) beruhen auf Rechenmethoden, die mit Software durchgeführt werden, die für den akademischen Gebrauch frei verfügbar ist. Detaillierte Befehle für jeden Schritt werden zur Verfügung gestellt und wenn mit den richtigen Dateien ausgeführt wird es dem Benutzer, die Datensätze neu zu erstellen, die notwendig sind, um den ursächlichen SNF r SNP zu finden. Denken Sie daran, dass einige der Syntax in den Befehlen auf Dateinamen oder Verzeichnisstruktur ($ PATH) verweisen, die auf die Benutzerpräferenz geändert werden können. Obwohl die hier angegebenen Befehle sicherlich nicht ausschließen, wie man ein Kreuz mit QTL-Analyse und WGS-basierter SNP-Identifikation analysieren kann, sind sie umfangreich genug, um das in diesem Artikel beschriebene Experiment zu wiederholen und es dem Benutzer zu ermöglichen, m zu werden<html> Erz vertraut mit, wie diese Ansätze in einer Schritt-für-Schritt-Mode genutzt werden. Obwohl QTL-Mapping und WGS-Sequenz-basierte SNP-Detektion ausreichend waren, um ein Kandidaten-SNF- r- Gen zu identifizieren, sind zusätzliche Experimente erforderlich, um seine Rolle in der Arzneimittelresistenz zu bestätigen. Dies kann durch Genunterbrechung oder Knockout-Techniken überzeugend gezeigt werden, die beide mit Hilfe von CRISPR / Cas9-Genbearbeitung erreicht werden können. Detaillierte Verfahren zur Verwendung von CRISPR / Cas9, um entweder Indel-Mutationen zu erzeugen oder transgene Konstrukte in ein Zielgen in T. gondii einzufügen, sind gegeben. Die Zielspezifität, die CRISPR / Cas9 bietet, erhöht die Effizienz der Genbearbeitung über traditionelle Methoden. Auch dies hat es effizienter ermöglicht, nicht-laborgerechte Stämme für genetische Untersuchungen zu verwenden, die bisher schwer zu modifizieren waren 13 . Obwohl in den Kinderschuhen CRISPR / Cas9 bereits verwendet wurde, um Genunterbrechungen zu machenLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , markieren Gene 17 und machen Gen-Knockouts 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 in T. gondii und versprechen, ein nützliches Werkzeug zu sein Für viele andere Studien in der Zukunft. Die Entdeckung, dass die SNR1- Inaktivierung zu einer Sinefungin-Resistenz führt, macht den SNR1- Locus zu einer vielversprechenden Stelle für die Transgen-Insertion oder genetische Komplementierung. Um den Erfolg der Verwendung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Targeting zu maximieren, um die Integration von Transgen in den SNR1- Locus zu lenken , sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werdenRot während des experimentellen Designs. Zuerst wird empfohlen, ein Selektionsmarker in das transgene Konstrukt einzubeziehen, um die Effizienz der Dehnungskonstruktion zu erhöhen. Wenn ein Selektionsmarker enthalten ist, können sowohl positive als auch negative Selektion verwendet werden, was dazu führt, dass fast 100% der doppelt ausgewählten Parasiten mit dem im SNR1- Locus integrierten GOI transgen sind. Im Gegensatz dazu, wenn das transgene Konstrukt keine zusätzlichen auswählbaren Merkmale enthält und auf einer negativen Selektion am SNR1- Locus beruht , hängt die Effizienz der erfolgreichen Transgenese weitgehend von der Effizienz der Cotransfektion des CRISPR-Plasmids und des transgenen Konstrukts ab. Zweitens, obwohl die CRISPR / Cas9-vermittelte ortsspezifische Integration eines nicht-homologen DNA-Fragments häufig zur Komplementierung und Transgenese verwendet wird, ist zu beachten, dass die Orientierung der Insertion in solchen Fällen nicht gewährleistet werden kann, dass entweder eine Richtung möglich ist. Dies kann sich als sinnvoll erweisenMs zu einigen Anwendungen. Zum Beispiel, um eine Mutante mit verschiedenen Gen-Allelen zu ergänzen, ist es schwierig, sicherzustellen, dass alle Allele in die gleiche Orientierung eingefügt werden, und Diskrepanzen in der Orientierung können Ausdrucksunterschiede verursachen. Für diese Art der Anwendung werden DNA-Konstrukte mit Sequenzen empfohlen, die homolog zum SNR1- Locus sind, was die richtige Integrationsorientierung antreibt ( Abbildung 6 ). Drittens ist während der Transfektion das Verhältnis zwischen dem CRISPR-Plasmid und dem transgenen DNA-Molekül entscheidend für eine erfolgreiche transgene Dehnungskonstruktion. Dieses Verhältnis muss nach den Auswahlstrategien angepasst werden. Folgende Richtlinien werden empfohlen: 1) Wenn das transgene Konstrukt einen drogenresistenten Marker enthält und das entsprechende Medikament die einzige Selektion ist, die verwendet wird, um transgene Parasiten zu erzeugen, dh Sinefungin wird nicht verwendet, das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-PlasmaId ist 1: 5. Die Verwendung von mehr CRISPR-Plasmiden in diesem Fall erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Parasiten, die das transgene Konstrukt erhalten, auch das CRISPR-Plasmid erhalten werden, weshalb die Arzneimittelresistente Parasiten eher die Markierung an der CRISPR-Targeting-Stelle aufweisen. Wenn das Verhältnis umgekehrt ist, werden die meisten Parasiten, die das transgene Konstrukt erhalten, das CRISPR-Plasmid nicht erhalten. Infolgedessen erhält die überwiegende Mehrheit der drogenresistenten Parasiten das transgene Konstrukt durch zufällige Integration, die nicht mit der CRISPR / CAS9-vermittelten ortsspezifischen Insertion assoziiert ist. 2) Wenn das transgene Konstrukt einen drogenresistenten Marker enthält und das entsprechende Medikament zusammen mit Sinusfungin zur Selektion transgener Parasiten verwendet wird, beträgt das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-Plasmid 1: 1. Diese Strategie bietet die höchste Effizienz der transgenen Dehnungskonstruktion. 3) Wenn das transgene Konstrukt keinen selektierbaren Hersteller enthält, der sich auf eine negative Selektion stützt,Von Sinefungin allein, um transgene Parasiten zu erhalten, beträgt das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-Plasmid 5: 1. Die Begründung für dieses Design ist die gleiche wie in der ersten Leitlinie oben. Da sowohl Pyrimethamin als auch Sinusfungin zur Selektion in Protokoll 5 verwendet wurden, wurde das Verhältnis zwischen DHFR * mini Gen und dem SNR1 Targeting CRISPR Plasmid als 1: 1 eingestellt. Zusammengenommen haben die hier skizzierten Methoden ein Detaillierungsgrad, das in der ursprünglichen Publikation, die SNR1 2 identifizierte, nicht möglich war. Diese Protokolle; Insbesondere die Kommandozeilen-Syntax, das sequentielle Layout der verwendeten Programme und die Verwendung von CRISPR / Cas9 sollten zukünftige Bemühungen unterstützen, neue Gene zu identifizieren, die für Phänotypen verantwortlich sind.

Host-Bereich bestimmt das Ausmaß der Prävalenz einer Parasiten. Einige Parasiten haben sehr spezifische Host-Anforderungen, die den Bereich begrenzen, von dem sie gefunden werden, andere sind Generalisten. Ein solcher Generalist ist Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Dieser Parasit wird weltweit gefunden, da er alle Säugetiere und viele Vögel infizieren kann. Menschen sind auch anfällig und es wird geschätzt, dass etwa 1/3 der Weltbevölkerung infiziert wurde. Glücklicherweise kontrolliert eine robuste Immunantwort normalerweise das Wachstum des Parasiten, aber in Situationen, in denen das Immunsystem kompromittiert wird, kann der Parasit unkontrolliert wachsen und Krankheiten verursachen, oftmals Enzephalie. Auch dieser Parasit kann angeborene Krankheiten verursachen, wenn zuvor nicht infizierte Frauen während der Schwangerschaft infiziert sind, da ihnen das Immungedächtnis fehlt, um die Ausbreitung des Parasiten schnell zu begrenzen. Darüber hinaus gibt es eine Belastung der okulären Toxoplasmose, die zu Sehverlust führen kann 1 . Für diese reasoNs T. gondii hat sich zu einem Schwerpunkt der Studie, und aufgrund der vielen molekularen Methoden für seine Studie entwickelt, ein Modell für Apikomplexan Parasiten. Zwei Methoden, die hier diskutiert werden, sind Quantitative Trait Locus (QTL) Mapping und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9 Gen Editing. QTL-Mapping und CRISPR / Cas9-Bearbeitung sind jeweils Vorwärts- und Reverse-Gen-Ansätze, die in früheren Studien zur Identifizierung und / oder Charakterisierung von T. gondii- Virulenzgenen verwendet wurden. Hier werden diese Methoden kombiniert, um die Funktion eines Sinefunginresistenz- (SNF r ) -Gens, TgME49_290860, und seiner Orthologen (als SNR1 bezeichnet ) 2 zu identifizieren und zu bestätigen. Obwohl T. gondii eine Vielzahl von Zwischenwirten infizieren kann, muss es die intestinalen Epithelzellen eines Felids durchlaufen und infizieren, um den Lebenszyklus abzuschließen. Katzen sind die endgültigen Gastgeber des Parasiten, wo die sEs werden exakte Stadien produziert und eine genetische Rekombination via Meiose auftritt. Um eine QTL-Studie durchzuführen, muss man ein genetisches Kreuz erzeugen, und im Falle von Toxoplasma bedeutet dies, dass zwei verschiedene Parasitenstämme passieren, die sich in einem phänotypischen Merkmal unterscheiden, die Elternflecken durch eine Katze, um rekombinante Nachkommen zu produzieren 3 . Bevor sie den Katzen zugeführt werden, werden die Elternstämme resistent gegen getrennte Medikamente, um eine effizientere Identifizierung von Rekombinanten durch doppelte Arzneimittelselektion der Nachkommenschaft zu ermöglichen. 4 Drei T-Shirts wurden zu diesem Zweck in T. gondii verwendet; Fluorodeoxyribose (FUDR), für die Uracil-Phosphoribosyltransferase ( UPRT ) das Resistenzgen 5 ist , Adenosin-Arabinosid (ARA), für das Adenosin-Kinase ( AK ) das Resistenzgen 6 ist , und Sinusfungin (SNF), für das das Resistenzgen unbekannt war 7 . Mehrere genetische Kreuze warenErstellt für T. gondii , aber nur die 24 Nachkommen des ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kreuz wurden mit der ganzen Genomsequenzierung (WGS) 8 genotypisiert. Dies eröffnete die Möglichkeit, das SNF-Resistenzgen unter Verwendung dieses Kreuzes zu markieren und zu identifizieren, da das VAND-Elternteil durch chemische Mutagenese des medikamentenempfindlichen VAND (VAND-SNFs) -Stammes Sinefungin resistent wurde und das VAND-Referenzgenom unter Verwendung des VAND- SNF s- Stamm, so dass die Identifizierung aller Polymorphismen zwischen der Nachkommenschaft WGS und dem VAND-SNF-Referenz-Genom, einschließlich der ererbten parenteralen VAND-SNF r Mutation, die einige der Nachkommen-Sinusfungin resistent gemacht. Um den kausalen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) in der SNF r- Nachkommenschaft zu identifizieren, können mehrere rechnerbasierte Open-Source-Ressourcen verwendet werden, um die Daten zu analysieren. Um die genetische Karte für die ME49-FUDR r X VAND-SNF r überqueren die REDHORSE Software-Suite 9 wurde entwickelt, die WGS-Ausrichtungen der Eltern und Nachkommen verwendet, um genau die genomischen Positionen von genetischen Crossovers zu erkennen. Diese Abbildungsinformation kann dann mit den phänotypischen Daten (SNF r in der Nachkommenschaft) kombiniert werden, um einen mit dem &#39;qtl&#39;-Paket 10 kompatiblen Datensatz in der R-statistischen Programmiersoftware zu formatieren, wo ein QTL-Scan ausgeführt werden kann, um signifikante Loci mit dem zu identifizieren Phänotyp Um das kausale SNP, das sich innerhalb des QTL-Locus befindet, zu identifizieren, kann das WGS-Liest der Nachkommenschaft individuell an das sinefunginempfindliche VAND-Genom mit dem Bowtie 2-Ausrichtungsprogramm 11 angepasst werden, aus dem SNPs mit dem VarScan mpileup2snp-Variantenaufrufprogramm 12 aufgerufen werden können. Mit diesen SNPs kann der QTL-Locus dann auf Polymorphismen gescannt werden, die im SNF r vorhanden sind, aber nichtIn der SNF-Nachkommenschaft. Mit dem in der kodierenden Region eines Gens identifizierten kausalen SNP kann die genetische Veränderung des Kandidaten-SNF- r- Gens in einem SNF- s- Stamm durchgeführt werden, um die Arzneimittelresistenzfunktion zu verifizieren. Das CRISPR / Cas9-Genom-Editing-System wurde vor kurzem in Toxoplasma 13 etabliert , das wichtige Instrumente für die Erforschung der komplexen Biologie dieses Parasiten, insbesondere für genetische Studien in nicht-laborgerechten Stämmen, hinzugefügt hat. Aufgrund der hochaktiven nicht homologen Endverknüpfung (NHEJ) -Aktivität in WT- Toxoplasma- Zellen ist eine gezielte Genom-Modifikation schwer zu erreichen, da exogen eingeführte DNA zufällig in das Genom mit extrem hoher Frequenz 14 integriert wird . Um die Erfolgsrate der ortsspezifischen Modifikation zu erhöhen, wurden verschiedene Ansätze verwendet, um die Effizienz der homologen Rekombination zu erhöhen und / oder zu verringernE NHEJ Tätigkeit 15 , 16 . Eines dieser Ansätze ist das CRISPR / Cas9-System. Im Vergleich zu anderen Methoden ist das CRISPR / Cas9-System effizient bei der Einführung ortsspezifischer Modifikationen und ist einfach zu entwerfen 13 , 17 , 18 . Darüber hinaus kann es in jedem Toxoplasma- Stamm ohne zusätzliche Modifikation an den Parasiten 13 , 19 verwendet werden . Das CRISPR / Cas9-System entstand aus dem adaptiven Immunsystem von Streptococcus pyogenes , das es verwendet, um die Invasion von mobilen genetischen Elementen wie Phagen 20 , 21 , 22 zu verteidigen. Dieses System nutzt das RNA-geführte DNA-Endonuklease-Enzym Cas9, um den doppelsträngigen DNA-Break (DSB) in das Target einzuführen, das anschließend repa istEntweder durch das fehleranfällige NHEJ, um Zielgene durch kurze Indelmutationen zu inaktivieren, oder durch Homologie gerichtete Rekombination, um den Zielort genau wie entworfen zu modifizieren 23 , 24 . Die Zielspezifität wird durch ein kleines RNA-Molekül namens Single Guide RNA (gRNA) bestimmt, das eine individuell gestaltete 20 nt Sequenz enthält, die 100% Homologie zur Ziel-DNA 22 hat . Das gRNA-Molekül enthält auch Signaturen, die von Cas9 erkannt werden, die die Nuklease zur Zielstelle führen, die ein spezielles Protospacer-benachbartes Motiv enthält (PAM, Sequenz ist &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Daher arbeiten das gRNA-Molekül und die PAM-Sequenz zusammen, um die Cas9-Schnittstelle im Genom zu bestimmen. Man kann leicht die gRNA-Sequenz ändern, um verschiedene Standorte für die Spaltung zu zielen. Als das CRISPR / Cas9-System erstmals in Toxop entwickelt wurdeLasma, ein einzelnes Plasmid, das die Cas9-Nuklease exprimiert, und das gRNA-Molekül wurde verwendet, um DSB an der Zielstelle 13 , 17 einzuführen. Es wurde gezeigt, dass das CRISPR / Cas9-System die Effizienz der ortsspezifischen Genommodifikation nicht nur durch homologe Rekombination, sondern auch durch nicht homologe Integration exogener DNA 13 drastisch erhöht. Es tut dies in Wildtyp-Stämme, die NHEJ-Aktivität enthalten. Daher kann dieses System im Wesentlichen jedem Toxoplasma- Stamm für effiziente Genom-Bearbeitung verwendet werden. In einem typischen Experiment werden das zielspezifische CRISPR-Plasmid und das zur Modifizierung des Targets verwendete DNA-Fragment in Parasiten co-transfiziert. Wenn das zur Bestimmung des Targets verwendete DNA-Fragment homologe Sequenzen zum Zielort enthält, kann eine homologe Rekombination zur Reparatur des durch CRISPR / Cas9 eingeführten DSB verwendet werden, um eine präzise Modifikation des Targets zu ermöglichen. Auf der anderen Seite, wenn die intInduzierte DNA-Fragment enthält keine homologe Sequenz, sie kann noch in die CRISPR / Cas9-Targeting-Site integriert werden. Letztere wird häufig verwendet, um Gene durch Insertion von selektierbaren Markern zu stören oder Mutanten an Loci zu ergänzen, die eine negative Selektion erlauben 13 . Hier dient der SNR1- Locus als Beispiel, um zu zeigen, wie CRISPR / Cas9 für die Genunterbrechung und die Erzeugung von transgenen Parasiten verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>T25 Kolben</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 Stamm</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND Stamm</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (ohne Natriumbicarbonat)</td><td>Life Sciences</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS) Premium Grade</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (10 mg/ml)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15710064</tr><tr><td>Zellschaber für Kolben</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>stumpfe Nadeln 22 G x 1"</td> <td>BRICO Products</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Nukleporenfilter 3.0 & Mikro; m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Filterhalter 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>The R Foundation</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>The Churchill Group</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>John Hopkins University</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>Washington University, St. Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii CRISPR-Plasmid zum Schneiden des UPRT-Gens</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii CRISPR-Plasmid zum Schneiden des TG*_290860 SNR1-Gens</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Vorlage für DHFR* Mini-Gen</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenese Kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriposhpat (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Elektroporationssystem</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette&nbsp; 4 mm</td><td>Harvard Apparatur</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-TC-Platte</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-TC-Platte</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 12 mm rund</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-TC-Platte</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-Fragment)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrimethamin</td><td>TCI AMERIKA</td><td>P2037-1G</td><td>Verwenden Sie Cuation bei der Verwendung von Pyrimethamin-resistenten Parasiten - siehe Protokoll</td></tr></tbody></table>

qtl mapping und crispr / cas9 bearbeitung zur identifizierung eines drug resistance gen in<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Wissenschaftliches Wissen ist mit den verfügbaren Technologien und Methoden verbunden. In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die die Identifizierung und Verifizierung eines Arzneimittelresistenzgens im Apikomplexan-Parasiten Toxoplasma gondii , der Methode der quantitativen Trait Locus (QTL) -Kartierung unter Verwendung einer GGG-basierten genetischen Karte und der Methode ermöglichen Von Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9-basierte Gen-Bearbeitung. Der Ansatz der QTL-Abbildung erlaubt es, zu testen, ob eine Korrelation zwischen einer genomischen Region (en) und einem Phänotyp besteht. Es sind zwei Datensätze erforderlich, um einen QTL-Scan durchzuführen, eine genetische Karte, die auf der Nachkommenschaft eines rekombinanten Kreuzes basiert und ein quantifizierbarer Phänotyp, der in jedem der Nachkommen dieses Kreuzes beurteilt wird. Diese Datensätze werden dann so formatiert, dass sie mit einer R / qtl-Software kompatibel sind, die einen QTL-Scan erzeugt, um signifikante Loci zu identifizieren, die mit dem Phänotyp korreliert sind. Obwohl dies die Suche erheblich einschränken kannIndow von möglichen Kandidaten, QTLs Bereiche, die eine Reihe von Genen enthalten, aus denen das kausale Gen identifiziert werden muss. Nachdem WGS der Nachkommenschaft war entscheidend, um die kausale Arzneimittelresistenz Mutation auf der Gen-Ebene zu identifizieren. Einmal identifiziert, kann die Kandidaten-Mutation durch genetische Manipulation von medikamentenempfindlichen Parasiten verifiziert werden. Die einfachste und effizienteste Methode zur genetischen Veränderung von T. gondii ist das CRISPR / Cas9 System. Dieses System umfasste nur 2 Komponenten, die beide auf einem einzigen Plasmid codiert sind, eine einzelne Leitungs-RNA (gRNA), die eine 20 bp-Sequenz enthält, die komplementär zum genomischen Ziel ist, und die Cas9-Endonuklease, die einen doppelsträngigen DNA-Bruch (DSB) am Ziel erzeugt, Reparatur, die das Einfügen oder Löschen von Sequenzen um die Bruchstelle ermöglicht. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Verwendung von CRISPR / Cas9-basierten Genom-Editing-Tools, um das für die Sinefungin-Resistenz verantwortliche Gen zu überprüfen und transgene Parasiten zu konstruieren.

Dieser Artikel beschreibt im Detail mehrere Methoden, die nacheinander verwendet werden können, um ein für die Arzneimittelresistenz verantwortliches Gen zu identifizieren ( Abbildung 1 ). Die 24 Nachkommen des ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kreuzes wurden auf Resistenz gegen das Medikament Sinefungin, wie in Protokoll 1 beschrieben, beurteilt. Unter Verwendung der genetischen Karte und des SNF r- Phänotyps der Nachkommenschaft wurde ein QTL-Scan in R / Qtl - Protokoll 2 ( Abbildung 2 ). Dies führte zu einem signifikanten Peak auf Chromosom IX, der etwa 1 Mbp überspannte. In dieser Region befindet sich die Kausalmutation. Um die kausale Mutation zu identifizieren, wurde die WGS aus der Nachkommenschaft mit dem Vend-SNF-Referenzgenom unter Verwendung von Bowtie2 - Protokoll 3.1 ausgerichtet, SNPs wurden mit VarScan mpileup2snp - Protokoll 3.2 aufgerufen und der QTL - Locus im VAND - Genom wurde mit MUMmer - ProtocOl 3.3. Nachkommen-SNPs innerhalb des QTL-Locus wurden extrahiert und auf ein Muster gescannt, bei dem die SNF r- Progogen einen SNP und die SNFs nicht haben, was möglich ist, weil die Nachkommen-SNPs im Vergleich zum VAND-SNF-Referenzgenom erhalten wurden ( Abbildung 3 ) . Nur ein SNP stimmt mit diesem Muster überein, das zu einem frühen Stopcodon in einem mutmaßlichen Aminosäuretransportergen namens SNR1 führt . Bestätigung, dass SNR1 das SNF- r- Resistenzgen ist, wurde mit dem CRISPR / Cas9-System durchgeführt. Ein neues CRISPR / Cas9-Plasmid, das für die T. gondii- Genbearbeitung entwickelt wurde, wurde mit einer gRNA, die auf das SNR1- Gen in der Nähe der SNF- R- Mutation hinweist, die in dem Nachkommen-Protokoll Nr. 4 ( 4A ) identifiziert wurde, durchgeführt. Das SNR1- Targeting-CRISPR / Cas9-Plasmid wurde in einen SNF-WT-Parasitenstamm elektroporiert und resistente Mutanten wurden bei Kult erhaltenÖst in 0,3 μM Sinusfungin. Es wurden keine SNF- r- Parasiten erhalten, wenn sie mit dem UPRT-Targeting-CRISPR / Cas9-Plasmid elektroporiert wurden. Mehrere SNF r CRISPR-Mutanten wurden kloniert und die Region um das SNR1- gRNA-Target wurde sequenziert. Jede Mutante hatte einen Indel, der die kodierende Sequenz des SNR1- Gens störte ( Abbildung 4B ). Diese Methode kann auch verwendet werden, um ein Targeting-Konstrukt in den SNR1- Locus über NHEJ einzufügen ( Abbildung 5) oder HR ( Abbildung 6 ) - Ergänzende Datei 2 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematischer Workflow für Experimente, die in den Protokollen skizziert wurden. Die Hauptschritte bei der Identifizierung und Bestätigung des SNF r- Gens unter Verwendung des ME49-FUDR r X VAND-SNF r- Kreuzes werden unter Bezugnahme auf die in t skizzierten entsprechenden Protokolle gezeigtSein artikel <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Abbildung 2: R / qtl Befehle zum Ausführen von QTL Scan auf dem SNF r Phänotyp. Die Befehle, wie in Protokoll 2 skizziert, wurden in R mit dem qtl-Paket ausgeführt. Repräsentative Befehle und Plots werden angezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Abbildung 3: Ort des Causal SNP. Nachkommen WGS-Lesungen wurden auf das VAND-SNF-Referenz-Genom mit Bowtie 2 ausgerichtet, SNPs wurden mit VarScan aufgerufen und entsprechen<html> VAND QTL locus mit MUMmer identifiziert. SNPs, die sich innerhalb des QTL-Locus befinden, wurden in eine Kalkulationstabelle importiert und das kausale SNP wurde identifiziert. SNF r Nachkommen (gelb), SNF s Nachkommen (grün), SNF r SNP (rot) (siehe Daten Datei 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Abbildung 4: Bestätigung von SNR1 als SNF r Gen mit CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 induzierte Indel-Mutationen (grün) im SNR1- Locus. ( B ) Repräsentative Indels in SNR1, die durch zwei verschiedene SNR1 spezifische CRISPR-Plasmide (C5 und C6) verursacht wurden. RH ist der WT-Stamm und C5 und C6 sind SNF- R- Mutanten. (B wird aus der Referenz genommenS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Abbildung 5. Insertionsmutagenese mit CRISPR / Cas9. ( A ) Insertion von komplementären oder transgenen Genen in den SNR1- Locus durch CRISPR / Cas9-vermittelte ortsspezifische Integration. Zwei mögliche Orientierungen des eingefügten DHFR * mini-Gens und der zur Identifizierung verwendeten Primer, F1 / 2 und R1 / 2, repräsentieren die Priming-Stellen von Oligos, die in diagnostischen PCRs verwendet werden. ( B ) Diagnostische PCRs von einem snr1 :: DHFR * Klon, RH wird als WT-Kontrolle verwendet. PCR des GRA1p ist als Kontrolle zur Überprüfung der Qualität der genomischen DNA als Vorlagen enthalten. Asterisks zeigen Bahnen mit unspezifischen Bändern an (Abbildung 5B wird von referen genommenCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Abbildung 6: Gen-Knockout mit CRISPR / Cas9. Ein klassisches Design für CRISPR / Cas9 vermittelten homologen Genaustausch in T. gondii . Die Orientierung des eingefügten Transgens ist in diesem Fall festgelegt. F1 / R1, F2 / R2 und F3 / R3 repräsentieren die Priming-Stellen von Oligos, die in diagnostischen PCRs verwendet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Datendatei 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Querdatei fOder verwenden Sie in R / qtl, &quot;csv&quot; Format. Eine .csv-Datei, die in R / qtl mit der Format = &quot;csv&quot; Option geladen werden kann. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Datendatei 2: (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt und phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Cross-Dateien zur Verwendung in R / qtl, &quot;gary&quot; Format. Sechs .txt-Dateien, die in R / qtl mit dem Format = &quot;gary&quot; -Option geladen werden können. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Datendatei 3. Spreadsheet mit Nachkommen-SNPs über den SNF r <stronG&gt; QTL Locus Enthält ein Arbeitsblatt mit den Nachkommen-SNPs und ein zweites Arbeitsblatt mit den phänotypischen Daten der Eltern und der Nachkommenschaft des Kreuzes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Datei 1: Zusätzliche Protokolldetails. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Akte 2: Protokoll 5 - Verwendung der Negativselektion am SNR1 Locus für genetische Komplementierung oder transgene Dehnungsherstellung <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a></a>

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Kartierung quantitativer Merkmalsloci und zur CRISPR/Cas9-Genomeditierung besteht darin, ein Gen zu identifizieren und anschließend zu verifizieren, das an der Sinefungin-Resistenz in Toxoplasma beteiligt ist. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in der Parasitologie zu beantworten, beispielsweise nach den genetischen Grundlagen von Variabilität, Pathogenese und Arzneimittelresistenz. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt in der Nutzung von Whole-Genome-Sequenzierungsdaten für eine präzise QTL-Analyse sowie der Anwendung von CRISPR/Cas9-Genomeditierung für eine effiziente genetische Manipulation in Toxoplasma.Den Vorgang wird Dr. Robin Powell, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Die Toxoplasma gondii-Parasiten werden in konfluenten humanen Vorkautpenfibroblasten oder HFF-Zellen kultiviert, die in T25-Flaschen mit D10-Medium ausgesät wurden. Um einzelne Nachkommenklone auf Sinefungin-Resistenz zu testen, züchten Sie jeden Klon bis zu einer hohen Parasitendichte, bis die Mehrheit der Parasiten beginnt, die Wirtszellen zu lysieren.Nach der Herstellung der Parasitenlösung gemäß dem schriftlichen Protokoll überführen Sie mit einer Pipette 2,5 × 10⁵ Parasiten in einen neuen T25-HFF-Kulturkolben, der D10-Medium mit einer Arbeitskonzentration von 0,3 µM Sinefungin enthält. Kultivieren Sie die Parasiten sieben bis zehn Tage bei 37 °C und 5 % CO₂. Untersuchen Sie die HFF-Zellmonoschicht unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop und bewerten Sie die Nachkommen hinsichtlich des Wachstumsphänotyps in Gegenwart des Sinefungin-Medikaments.Beispielsweise wird keine Wachstumserscheinung mit null bewertet und Wachstum mit Lyse der Monoschicht mit eins. Sobald alle Nachkommen bewertet wurden, werden die Daten als binäres Phänotyp für die quantitative Merkmalslokus- oder QTL-Kartierung verwendet. Um die ursächliche Mutation zu identifizieren, werden die Whole-Genome-Sequenzierungs-Leser der Nachkommen an das Sinefungin-empfindliche Van-Strand-Referenzgenom ausgerichtet, SNPs werden bestimmt und der QTL-Lokus wird auf einen mit Sinefungin-Resistenz assoziierten SNP untersucht.Die Bestätigung, dass SNR1 das Sinefungin-Resistenzgen ist, erfolgt durch die Inaktivierung von SNR1 in einem wildtypischen, Sinefungin-empfindlichen Hintergrund mittels CRISPR/Cas9-induzierter InDels-Mutationen. Um das SNR1-spezifische CRISPR-Plasmid zu konstruieren, wird das UPRT-zielgerichtete CRISPR-Plasmid als Vorlage für eine PCR-basierte, standortspezifische Mutagenese unter Verwendung speziell entworfener Primer verwendet. Die Mutageneseprodukte, die die CRISPR-Plasmide spezifisch für das Gen von Interesse enthalten, werden in E. coli-Zellen transformiert.Anschließend werden einzelne Klone ausgewählt und in LB-Medium kultiviert, und die extrahierten Plasmide werden mittels DNA-Gelelektrophorese auf ihre Größe überprüft. Die Plasmide werden anschließend sequenziert, um die zielspezifische Leit-RNA-Sequenz zu bestätigen. Wenn das zielspezifische CRISPR-Plasmid in eine Toxoplasma-Zelle eingeführt wird, leitet die Leit-RNA das Cas9-Protein zur Zielstelle, wodurch ein Doppelstrangbruch an einem bestimmten Locus im Zielgenom verursacht wird.Der DNA-Bruch wird anschließend durch fehleranfällige, nicht-homologe Verknüpfungsaktivität repariert, was zu InDels-Mutationen im Zielgen führt. Zwei bis drei Tage, bevor die Parasiten mit dem SNR1-spezifischen CRISPR-Plasmid transfiziert werden, genügend Parasiten in einen T25-Flasche mit einer konfluenten HFF-Zellmonoschicht geben, um innerhalb von zwei bis drei Tagen eine Lyse von 70 % bis 80 % der HFF-Zellen zu erreichen. Die Kultur unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop untersuchen, um zu bestätigen, dass die HFF-Monoschicht zu 70 % bis 80 % von den Parasiten lysiert ist.Entfernen Sie vorsichtig das Medium mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen mit fünf Milliliter Cytomix-Puffer von der Oberfläche des Kolbens ab. Überführen Sie die Parasitenlösung in ein 15-Milliliter-Konischglas. Führen Sie die Parasitenlösung zwei- bis dreimal durch eine 10-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 22-Gauge-Nadel.Um HFF-Zellen und zellulären Abfall zu entfernen, filtrieren Sie die Parasitenlösung durch eine Membran mit einer Porengröße von drei Mikrometern in ein neues kegelförmiges Reagenzglas. Pellettieren Sie die filtrierten Parasiten durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 Minuten. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die pelletierten Parasiten mit 10 Milliliter Cytomix-Puffer. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Aliquotprobe, um die Parasitenkonzentration mit einem Hämozytometer zu bestimmen. Pellettieren Sie den Rest der Suspension erneut durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem Mischpuffer, um eine Dichte von 4 × 10⁷ Parasiten pro Milliliter zu erhalten.In einer Küvette mit vier Milliliter Abstand 250 bis 300 Mikroliter der Parasitenlösung mit 7,5 Mikrogramm CRISPR-Plasmid, sechs Mikrolitern ATP und sechs Mikrolitern Glutathion mischen. Die Parasiten mittels Elektroporation übertragen, gemäß einem Standardverfahren für T gondii Transvektion. Eine separate Elektroporation als negativen Kontrollversuch einbeziehen, bei dem ein CRISPR-Plasmid eine andere Zielstelle ansteuert.Züchten Sie die elektroporierten Parasiten in einem T25-Fläschchen, das mit HFF-Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Tage beimpft wurde. Um mit dem Verfahren zur Untersuchung der induzierten Mutationen zu beginnen, ersetzen Sie zunächst das Medium im Fläschchen durch fünf Milliliter D10, das 0,3 Mikromol Sinefungin enthält. Kultivieren Sie die Parasiten in diesem Selektionsmedium für mindestens drei Passagen, bis der resistente Pool stabil ist.Wie durch das Fehlen des Parasitenwachstums in der Negativkontrollgruppe, jedoch starkes Parasitenwachstum in der Versuchsgruppe angezeigt. Subklonieren Sie den sinefunginresistenten Pool, um koloniale Stämme zu erhalten. Sammeln Sie frisch ausgeschlüpfte Parasiten, reinigen Sie diese durch Filtration über eine 3-Mikron-Membran und subklonieren Sie sie in 96-Well-Platten, die mit konfluenten HFF-Zellen in 150 Mikroliter D10-Medium beimpft wurden.Züchten Sie die Subklonierungs-Kulturen sieben bis zehn Tage lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, ohne die Platten zu stören. Prüfen Sie nach sieben bis zehn Tagen die 96-Well-Platten unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop. Suchen Sie nach Wells, die nur eine Plaque enthalten, und markieren Sie solche Wells.Überführen Sie die Zellen aus jeder Vertiefung in 24-Loch-Platten, die mit HFF-Zellen besiedelt wurden. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Wenn die Parasiten beginnen, die Monoschicht zu lysieren, übertragen Sie 50 Mikroliter der Parasitenlösung in eine neue Vertiefung, um den Stamm zu erhalten, und gewinnen Sie den Rest zur Isolierung genomscher DNA.Zentrifugieren Sie den restlichen Parasitenansatz bei 1000 × g für 10 Minuten. Waschen Sie die zentrifugierten Parasiten mit PBS und zentrifugieren Sie sie erneut. Isolieren Sie genomische DNA aus den zentrifugierten Zellen mithilfe eines kommerziellen Kits oder durch Kochen und resuspendieren Sie die Parasiten in 50 bis 100 Mikrolitern PBS.Schließlich PCR wie im Textprotokoll beschrieben durchführen, um ein Fragment des SNR1-Gens zur Sequenzierung zu erhalten. Nachkommen des Kreuzungsexperiments, die aus den elterlichen FUDR-resistenten ME49- und Sinefungin-resistenten van-Stämmen hervorgingen, wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber dem Wirkstoff Sinefungin untersucht, wie durch Wachstum und Lyse des HFF-Mono­schichts angezeigt. Eine QTL-Analyse ergab eine signifikante Spitze auf Chromosom neun, die sich über etwa ein Mbp erstreckt.Die ursächliche Mutation befindet sich in diesem Bereich. Die Ganzgenomsequenzierung führte zur Identifizierung der Mutation. Nachkommen-SNPs innerhalb des QTL-Lokus wurden in eine Tabellenkalkulation importiert und auf ein Muster hin überprüft, bei dem die in Gelb dargestellten sinefunginresistenten Nachkommen über einen SNP verfügen, während die in Grün dargestellten sinefunginsensitiven Nachkommen keinen aufweisen.Nur eine SNP, die in Rot hervorgehoben ist, entspricht diesem Muster, das zu einem vorzeitigen Stoppcodon in einem mutmaßlichen Aminosäuretransporter-Gen namens SNR1 führt. Als der CRISPR-Cas9-Plasmid, der auf SNR1 abzielt, in einen Sinefungin-empfindlichen Wildtyp-Parasitenstamm elektroporiert wurde, konnten resistente Mutanten erhalten werden, nachdem sie in Gegenwart von Sinefungin kultiviert worden waren. Im Gegensatz dazu wurden keine Sinefungin-resistenten Parasiten mit einem CRISPR-Plasmid erhalten, das eine andere Zielregion ansteuerte.Mehrere sinefunginresistente CRISPR-Mutanten wurden kloniert, und der Bereich um das SNR1-Leit-RNA-Ziel wurde sequenziert. Vertreterische Ergebnisse der RH-Wildtyp-Stammes sowie der sinefunginresistenten Mutanten C5 und C6 zeigen, dass jede Mutante eine Insertion/Deletion (Indel) aufwies, die die kodierende Sequenz des SNR1-Gens unterbrach. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Toxoplasma gondii gefährlich sein kann, da es für den Menschen infektiös ist.Bei diesem Verfahren sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie beispielsweise die sachgemäße Handhabung von Spitzen, die mit dem Parasiten in Kontakt kommen könnten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die CRISPR/Cas9-vermittelte, standortspezifische Insertion eines exogenen Gens durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die genetische Komplementation oder die Konstruktion transgener Parasiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der molekularen Parasitologie den Weg, um die komplexen biologischen Vorgänge und die Mechanismen der Pathogenese von Toxoplasma gondii zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine QTL-Analyse unter Verwendung von Genomsequenzierungsdaten durchführt, sowie wie man die genetische Metabulation von Toxoplasma gondii mittels CRISPR/Cas9-Genomeditierung vornimmt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie...

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ...

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Vorwärtsgenetik ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung von Genen in intrazellulären Krankheitserregern, die für die Resistenz gegen zellautonome Immunität wichtig sind. Der derzeitige Ansatz verwendet angeborene Immunzellen, insbesondere Makrophagen, um neue Toxoplasma gondii-Gene zu identifizieren, die für die Immunevasion wichtig sind.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Einführung eines Genknockouts in den extrazellulären Amastigot von Trypanosoma cruzi, mit dem CRISPR/Cas9-System. Dem Wachstumsphänotyp kann entweder durch Zellzählung der axtischen Amastigotenkultur oder durch Proliferation intrazellulärer Amastigoten nach der Invasion der Wirtszelle gefolgt werden.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Hier wird eine Methode zur gezielten, markerlosen Genlöschung bei Chlamydia trachomatis mit Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenese, FLAEM beschrieben.

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Bewertung der Hemmungswirksamkeit chemischer Verbindungen gegen in vitro intrazelluläres Wachstum von Toxoplasma gondii mit einem luziferase-basierten Wachstumstest. Die Technik wird verwendet, um die Hemmungsssspezifität durch genetische Deletion des entsprechenden Zielgens zu bestätigen. Die Hemmung von LHVS gegen TgCPL-Protease wird als Beispiel bewertet.

Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Erfahren Sie QTL-Mapping und CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Identifizierung von Resistenzgenen bei Toxoplasma gondii. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Analysen für Parasitologie-Forschung.

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in

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