Herstellung und Auswertung der ^99m Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Technetium-99m-markierten Tetrazinen für die zielgerichtete Bildgebung unter Verwendung der bioorthogonalen Chemie mit trans-Cycloocten-modifizierten Biomolekülen als Zielvektoren. Diese Methode bietet eine wichtige neue Plattform für die Entwicklung neuartiger Radiopharmazeutika. Durch Pre-Targeting können die hier beschriebenen Technetium-Komplexe verwendet werden, um eine Vielzahl von Organen, Geweben und Biomarkern abzubilden.

Diese Technik ist vorteilhaft, da sie eine robuste Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Tetrazinen bietet, die mit Technetium-99m, dem in der diagnostischen Medizin am weitesten verbreiteten medizinischen Isotop, radioaktiv markiert sind. Diese Technik kann mit verschiedenen Zielvektoren verwendet werden, einschließlich kleiner Moleküle und Antikörper. Es kann auch für die Strahlentherapie verwendet werden, indem Technetium gegen Beta-emittierende Isotope von Rhenium ausgetauscht wird.

Einen Teil der tierexperimentellen Verfahren wird Nancy Janzen, Biologietechnikerin in unserem Labor, vorführen. Um das Radiomarkierungsverfahren zu beginnen, kombinieren Sie in einem Mikrowellenfläschchen acht Milligramm Kaliumboranocabonat, 15 Milligramm Natriumcarbonat, 20 Milligramm Natriumtetraborat-Decahydrat und 25 Milligramm Kalium-Natriumtartrat-Tetrahydrat. Spülen Sie das Fläschchen 10 Minuten lang mit Argongas.

Geben Sie dann vier Milliliter Technetium-99m-Pertechnetat in 0,9% Kochsalzlösung mit einer Aktivität von 1.110 Megabecquerel in die Durchstechflasche. Laden Sie das Reaktionsgemisch in einen Mikrowellenreaktor und rühren Sie 10 Sekunden lang. Erhitzen Sie dann die Mischung 3,5 Minuten lang bei 110 Grad Celsius, um das Triaqua-Tricarbonyl-Technetium-99m-Kation zu erhalten.

Fügen Sie etwa 400 Mikroliter eines molaren Salzsäures hinzu, um den pH-Wert der Lösung auf 3,5 bis vier einzustellen. Als nächstes lösen Sie für jeden Tetrazin-Liganden zwei Milligramm Ligand in 250 Mikrolitern Methanol. Fügen Sie jeder Ligandenlösung 250 Mikroliter des Technetium-99m-Komplexes mit einer Aktivität von 74 Megabecquereln hinzu.

Das Gemisch in einem Mikrowellenreaktor bei 60 Grad Celsius 20 Minuten erhitzen. Bei Tetrazin-Liganden mit t-Butyl-Schutzgruppen überführen Sie die Lösung aus einem Mikrowellenfläschchen in ein 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen, verdampfen Sie dann das Lösungsmittel und lösen Sie jeden Komplex in einem Milliliter einer Eins-zu-Eins-Volumen-Lösung aus Dichlormethan und Trifluoressigsäure wieder auf. Übertragen Sie dann die Lösung in ein Mikrowellenfläschchen und erhitzen Sie diese Komplexe in einem Mikrowellenreaktor sechs bis 10 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um die Liganden zu schützen.

Kühlen Sie die Komplexe auf Raumtemperatur ab und verdampfen Sie dann das Lösungsmittel. Löse die Rückstände in 500 Mikrolitern einer wässrigen Eins-zu-Eins-Lösung aus Acetonitril oder Methanol und Wasser wieder auf, bevor du mit der HPLC-Reinigung fortfährst. Verwenden Sie eine C18-Umkehrphasen-HPLC, um jeden radioaktiv markierten Tetrazinkomplex mit einem Elutionsgradienten von 30 bis 70 bis 40 bis 60 % Acetonitril zu Wasser über einen Zeitraum von 20 Minuten zu reinigen, wobei durchgehend 0,1 % Trifluoressigsäure im Eluenten vorhanden ist.

Sammeln Sie das gereinigte Produkt, wenn es in der Gammaspur entweicht. Dann injizieren Sie jeden markierten Komplex mit einer Lösung von 0,125 Milligramm des entsprechenden Radium-Tetrazin-Komplexes in 20 % Methanol in Wasser. Vergleichen Sie die Retentionszeiten des Rheniumkomplex-Peaks in der UV-Spur und des Technetium-Komplex-Peaks in der Gamma-Spur, um die Identität des Gamma-Peaks zu überprüfen.

Entfernen Sie das Lösungsmittel aus jedem gereinigten Technetium-Tetrazin-Komplex. Formulieren Sie jeden Komplex in einer Konzentration von 7,4 Kilobecquerel pro Mikroliter in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,01 % Polysorbat 80. Für jede Maus werden 100 Mikroliter einer Lösung von fünf Mikrogramm pro Mikroliter des TCOPB-Derivats in Kochsalzlösung in eine Spritze aufgezogen, um eine Dosis von 20 Milligramm pro Kilogramm herzustellen.

Verbinden Sie eine 30-Gauge-Nadel mit der Dosierspritze. Platzieren Sie das Motiv der Maus in einer physischen Rückhaltevorrichtung. Identifiziere die Venen an der Seitenfläche des Schwanzes etwa zwei Zentimeter vom Ende des Schwanzes entfernt und wische den Bereich mit einem Alkoholtupfer ab.

Führen Sie die Spritzennadel in einem flachen Winkel parallel zur Vene ein. Injizieren Sie langsam das TCOBP-Derivat. Entfernen Sie die Nadel und tragen Sie einen sauberen Mullschwamm mit leichtem Druck auf die Injektionsstelle auf, bis die Blutung aufhört.

Eine Stunde nach der Injektion des TCOBP-Derivats wird eine Dosis von 100 Mikrolitern des gewünschten Technetium-99m-Tetrazin-Komplexes mit einer Aktivität von etwa 0,74 Megabecquerel durch Schwanzveneninjektion verabreicht. Verwenden Sie einen Dosiskalibrator, um die Aktivität einer 100-Mikroliter-Testprobe des Technetium-Komplexes zum Zeitpunkt der Injektion zu messen. Bewahren Sie das Prüfmuster für spätere Messungen auf.

Betäuben Sie die Maus sechs Stunden nach der Injektion mit einem 3%Isofluran und 2%Sauerstoff-Gasgemisch. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase im Nasenkonus, um die Anästhesie fortzusetzen, und lokalisieren Sie den Xiphoid-Prozess. Verbinden Sie eine 25-Gauge-Nadel mit einer mit Heparin vorbehandelten Spritze.

Führen Sie die Nadel in einem 20-Grad-Winkel unter dem Xiphoid-Prozess etwas links von der Mittellinie ein. Sobald die Nadel vollständig eingeführt ist, ziehen Sie den Kolben langsam zurück, um zu überprüfen, ob sich Blut in der Nadelnabe befindet, was eine erfolgreiche Herzpunktion bestätigt. Stellen Sie die Nadel nach Bedarf neu ein.

Sobald das Herz punktiert wurde, ziehen Sie langsam einen Milliliter Blut in die Spritze. Übertragen Sie die Blutprobe in ein vorgewogenes Zählröhrchen. Euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation unter Narkose.

Legen Sie das eingeschläferte Tier in eine Plastiktüte und messen Sie die Ganzkörperaktivität mit einem Dosiskalibrator. Sammeln Sie dann die Knie- und Schulterknochen, die Gallenblase, die Nieren, die Leber, die Schilddrüse und die Luftröhre sowie den Schwanz. Zusammen mit dem Inhalt sammeln Sie den Magen, den Dünndarm, den Dickdarm und den Blinddarm sowie die Harnblase.

Spülen Sie das Blut aus allen entnommenen Geweben mit Ausnahme der Gallen- und Harnblase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Tupfen Sie das Gewebe trocken und legen Sie jedes Gewebe in ein vorgewogenes Zählröhrchen. Die Restaktivität des Schlachtkörpers wird gemessen.

Wiegen Sie jede Gewebeprobe und berechnen Sie allein die Masse des Gewebes. Verwenden Sie einen Gamma-Zähler mit mehreren Detektoren, um die Aktivität eines Fünf-Mikroliter-Aliquots der Testprobe des Technetium-Komplexes zu messen. Berechnen Sie unter Verwendung des erhaltenen Wertes in Zählungen pro Minute und der zum Zeitpunkt der Injektion gemessenen Aktivität einen Umrechnungsfaktor.

Messen Sie die Aktivität jeder Gewebe- und Flüssigkeitsprobe mit dem Gamma-Detektor. Rechnen Sie die Werte in Mikrocurie um und normalisieren Sie jeden Wert nach Organgewicht, um den Prozentsatz zu bestimmen, den die Injektion pro Gramm Gewebe erfordert. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit weiteren Mäusen ohne Injektion des TCOPB-Derivats als Negativkontrollreihe.

Mit dieser Methode wurden fünf Tetrazin-Komplexe, die sich in ihren Linker- und Schlüssel-Leader-Kombinationen unterscheiden, mit Technetium-99m markiert. Ein TCOPB-Derivat, das in Regionen mit hohem Kalziumumsatz im Knochen lokalisiert ist, wurde verwendet, um die Schulter- und Kniegelenke von Mäusen vorab zu adressieren. Die Verhältnisse der prozentualen injizierten Dosis pro Gramm Gewebe für Knochen zu Blut wurden für jede Tetrazinverbindung berechnet.

Alle fünf Verbindungen klärten das Blut schnell ab und zielten auf den Knochen ab, was darauf hindeutet, dass die selektive bioorthogonale Kopplungsreaktion zwischen den Tetrazinverbindungen und dem TCOBP-Derivat in vivo stattgefunden hatte. Verbindung drei zeigte die beste Kombination aus Targeting und Clearance aus dem Blut. Negativkontrollexperimente zeigten, dass die radioaktiv markierten Tetrazinkomplexe in Abwesenheit des TCOBP-Derivats nicht signifikant am Knochen lokalisiert waren.

Wenn beispielsweise das TCOBP-Derivat nicht verabreicht wurde, hatte Verbindung zwei hohe Konzentrationen in der Gallenblase und im Darm, aber sehr wenig in den Knochen. Unter den fünf getesteten Verbindungen wurde eine große Variation in der Gewebelokalisation bei Mäusen beobachtet, die das TCOBP-Derivat erhielten. Zum Beispiel wurde im Vergleich zu anderen Komplexen sehr wenig von Verbindung drei im Dickdarm, in der Leber oder im Urin und in der Blase gesehen, während viel mehr von Verbindung drei im Knochen zu sehen war.

Einmal gemeistert, kann die hier beschriebene Beschriftungstechnik bei korrekter Ausführung von Anfang bis Ende in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Reagenzien genau abgewogen werden und dass die Salze mit Argon gereinigt werden, bevor sie der Technetium-Lösung zugesetzt werden. Es ist auch wichtig, dass der pH-Wert der Technetiumlösung vor der Zugabe des Tetrazin-Liganden auf 3,5 bis vier eingestellt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Technetium-markierte Tetrazine hergestellt und gereinigt werden können und wie sie zur Herstellung neuer Radiopharmazeutika unter Verwendung von Pre-Targeting und bioorthogonaler Chemie verwendet werden können. Vergessen Sie nicht, bei der Arbeit mit Radioaktivität geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, z. B. die Art der emittierten Strahlung zu verstehen und zu verstehen, wie die Proben am besten abgeschirmt und gehandhabt werden können.