Name: Herstellung und Auswertung der 99m Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Lernen Sie die Radiomarkierung von Tetrazinen mit Technetium-99m für präzises Pre-Targeting in der bioorthogonalen Chemie. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung neuartiger Radiopharmazeutika für diagnostische Bildgebung.

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Diese Arbeit wurde durch Forschungszuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada, des Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8) und der Canadian Cancer Society (CCS, #703857) unterstützt. Die Autoren würdigen die Beiträge von Dr. Denis Snider, der bei der Erstellung des Manuskripts geholfen hat.

In Tierstudien wurden von der Tierforschung Ethikrat an der McMaster University in Übereinstimmung mit Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien zugelassen. 1. Die radioaktive Markierung von Tz-dreizähnigen Liganden mit 99m Tc ACHTUNG: Die folgenden Verfahren erfordern die Verwendung von radioaktiven Verbindungen. Die Arbeiten sollten nur in einem zugelassenen Labor mit der Einhaltung von Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften erfolgen. Mikrowellen-Reaktionen sollten in einer Mikrowelle durchgeführt werden, die speziell für die chemische Synthese konstruiert. <ol><li> Synthese von [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> In einem Mikrowellenfläschchen kombinieren 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg Na 2 CO 3, 20 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O und 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O Purge das Fläschchen für 10 Minuten mit Argongas. </li><li> 4 ml 99m TcO 4 - (~ 1,100 MBq, ~ 30 mCi) in 0,9% Kochsalzlösung in das Fläschchen. </li><li> Die Reaktion wird in einer Mikrowelle für 3,5 min bei 110 ° C nach 10 s Rühren eine gute Durchmischung der Reagenzien zu gewährleisten. </li><li> Der pH-Wert der Lösung auf 3,5-4 mittels ~ 400 &amp; mgr; l von 1 M HCl. Stellen Sie sicher, pH-Papier verwenden. </li></ol></li><li> Die radioaktive Markierung von Tetrazin - Liganden 1-5 <ol><li> Man löst 2 mg jedes Liganden (Verbindungen 1-5) in 250 &amp; mgr; l MeOH 21. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) zu jeder Lösung. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird eine Mikrowelle für 20 min bei 60 ° C verwendet wird. Hinweis: dieser Schritt für alle 5 Tetrazinen identisch war. </li><li> Für Verbindungen 2- 5, verdampfe das Lösungsmittel und Wieder DISSOLve die resultierenden Produkte in 1 ml 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Wärme , die gelösten Reaktionsprodukte (2-5) bei 60 ° C in einer Mikrowelle für 6 min (2-4) oder 10 min (5). </li><li> Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur, dampfe das Lösungsmittel unter Verwendung eines Verdampfers (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) und lösen die getrocknete Verbindung in 1: 1 ACN: H 2 O oder 1: 1 MeOH: H 2 O, vor der HPLC-Reinigung. </li><li> Reinige den 99m Tc-markierten Verbindungen (1-5), einschließlich des markierten Produkts von unmarkiertem Liganden Tetrazin Trennung unter Verwendung von HPLC (C18 Umkehrphase). Typischerweise verwenden eines Elutionsgradienten von 30:70 ACN: H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 40:60 ACN: H 2 O über 20 min (18 min) und ein C 18 analytisches 4,6 x 100 mm Säule. Verwenden sowohl UV (254 nm) und gamma-Detektion. <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Probe jedes Produkts und vergleichen ihre HPLC-Retentionszeit, die der Co-injektiert, nicht-radioaktive, Re-markierten Standards (0,125 mg in 20% Methanol-H 2 O). Die Re-markiertem Standard wird in der UV - HPLC - Spur identifiziert, und zur gleichen Zeit wie die 99m Tc-markierte Verbindung , in der γ-HPLC - Spur eluieren. Diese Co-Injektion zeigt Peaks bei vergleichbaren Retentionszeiten, die Identität der 99m Tc-Verbindung bestätigt gekennzeichnet. </li></ol></li><li> Dampfe das Lösungsmittel von HPLC-Fraktionen unter Verwendung eines Verdampfers (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6.000 rpm). </li><li> Formulieren der gereinigten Verbindung in einer Konzentration von 7,4 kBq / &amp; mgr; l in PBS, enthaltend 0,5% BSA und 0,01% Tween-80. </li><li> Um die markierten Verbindungen sind stabil zu gewährleisten, führen Sie eine in - vitro - Stabilitätsstudie. Inkubieren der formulierten Verbindung bei 37 ° C für 1, 4 und 6 h, eine kleine Menge (3,7 MBq) der Mischung auf dem HPLC an jedem Zeitpunkt Injizieren Stabilität zu bewerten. </li></ol></li></ol> 2. Pre-gezielte Bio-Verteilung Studies <ol><li&gt; Vorbereitung der Tiere <ol><li> Mit 7-9 Wochen alt, weiblich Balb / c-Mäuse (n = 3), zu verwalten TCO-BP in Kochsalzlösung (20 mg / kg) (5 ug / ul) formuliert, über Schwanzveneninjektion. </li><li> Bewegen Sie die Maus in der physischen Rückhaltevorrichtung, und identifizieren die sich Venen an den Seitenflächen des Schwanzes und wischen Sie mit einem Alkoholtupfer. Bei etwa 2 cm vom Ende des Schwanzes, legen Sie eine 30-Gauge-Nadel in einem flachen Winkel parallel zur Ader. Langsam drücken Sie den Kolben Nadel zu injizieren, entfernen und reinigen Gazeschwamm an der Injektionsstelle mit leichtem Druck, bis die Blutung aufhört gelten. </li><li> Bei 1 h nach der Injektion von TCO-BP, verabreichen ~ 0,74 MBq (20 uCi) von 99m Tc-Tetrazin in 100 ul 0,5% BSA formuliert, 0,01% Tween-80 in PBS, via Schwanzveneninjektion. </li></ol></li><li> Bio-Verteilungsstudien <ol><li> Bei dem gewünschten Zeitpunkt (t = 6 h), anästhesieren die Mäuse unter Verwendung von 3% Isofluran und 2% Sauerstoff-Gasgemisch. Demonstrieren Sie ein zue Prise Rückzug auf der narkotisierten Maus, um sicherzustellen, dass sie unter chirurgische Ebene der Anästhesie sind. </li><li> Sammeln Blut (1 ml) über eine Spritze Herzpunktur vorbehandelt mit Heparin verwendet wird. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase in die Nase Kegel für die weitere Anästhesie und suchen Sie den Xiphoidbasis auf das Tier. <ol><li> Legen Sie eine 25 G-Nadel, leicht nach links von der Mittellinie des Tieres unter dem Xiphoidbasis, bei einem Winkel von 20 °. Voll führen Sie die Nadel, und langsam auf den Kolben zurückziehen Blut in der Nadel-Ansatz, um zu sehen, ob das Herz durchbohrt wurde. Etwas die Nadel nachstellen, während der Kolben bei Bedarf halten, um das Herz zu durchbohren. ziehen langsam Blut in die Spritze. </li></ol></li><li> Euthanize das Tier durch Genickbruch, während der Narkose. </li><li> Legen Sie jedes Tier in einen Plastikbeutel und verwenden Sie einen Dosiskalibrators (99m Tc - Einstellung) , um den ganzen Körper Aktivitätsniveau zu messen. </li><li> Sammeln Sie die folgenden Gewebe und Flüssigkeiten in vorge wiegened Zählrohre: Blut, Knochen (Knie und Schulter), Gallenblase, Nieren, Leber, Magen (mit Inhalt), Dünndarm (mit Inhalt), Dickdarm und Blinddarm (mit Inhalt), der Schilddrüse und der Trachea, der Harnblase mit Urin und Schwanz. </li><li> Spülen Sie geeignete Gewebe (ohne Blut, Gallenblase und Harnblase) in PBS Blut zu entfernen und trocken tupfen, bevor das Gewebe in geeigneten Zählrohre platzieren. </li><li> Platzieren Sie Tierkadaver in eine Plastiktüte und messen Rest ganzen Körper Aktivität eine Dosis-Kalibrator verwenden. </li><li> Wiegen Sie jedes Röhrchen eine Gewebeprobe enthält. Subtract Anfangsgewicht des Rohrs Masse des Gewebes zu erhalten. </li><li> Verwenden , um eine Dosis - Kalibrator (99m Tc - Einstellung) die Menge an Aktivität in einer Testprobe (100 ul) zu der Zeit der Einspritzung für jede Maus gemessen. ANMERKUNG: Diese Testprobe ist gleich dem Injektionsvolumen, wodurch die Aktivitätszählung zum Zeitpunkt der Injektion geben. </li><li> Zum Zeitpunkt der Gewebemessung eineliquot 5 ul des zuvor verwendeten Testprobe. Verwenden , um einen Multidetektor - Gammazähler (99m Tc - Einstellung) und zähle die Zählung pro Minute (CPM) für die 5 &amp; mgr; l Testprobe zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie die beiden erhaltenen Werte in 2.2.9 und 2.2.10 die Aktivität und CPM - Beziehung 1 unter Verwendung der Gleichung zu berechnen einen Umrechnungsfaktor zu erhalten (CPM uCi -1). (1) <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Verwenden, um die Gamma-Zähler die Menge an Radioaktivität in jedem Gewebe oder Flüssigkeitsprobe zu messen. </li><li> Verwenden der Gleichung 1 die Aktivitätsmenge in jedem Gewebe oder Flüssigkeit, die zum Zeitpunkt der Messung in Bezug auf die gesamten injizierten Dosis berechnet. Dieser Wert wird dann durch Organgewicht normalisiert und als Prozent injizierte Dosis pro Gramm (dh% ID / g) Gewebe berichtet. </li><li> Führen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.2.13 ein negatives Kontrollexperiment durchzuführen unter Verwendung der 99m Tc-markierten Tetrazin - Liganden in der Absence von TCO-BP. Opfer-Mäuse (n = 3) bei 0,5, 1, 4 und 6 h nach der Injektion und zu erhalten Gewebe oder Flüssigkeit, wie oben beschrieben. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Eine Sammlung von Tetrazin-linked dreizähnigen Chelate verschiedener Polaritäten wurde hergestellt, und die Nützlichkeit der 99m Tc - Komplexe in der IEDDA Reaktion mit einer TCO - Derivat in vivo bewertet. Eine effektive und reproduzierbare 99m Tc wurde Markierungsverfahren für fünf Tetrazin-Chelate entwickelt, wobei der Ligand - Konzentration 10 -3 M. war der Markierungsschritt durch Entfernung der Schutzgruppe von t- Butyl - Gruppen (für die Verbindungen 2-5)...

99m Tc bleibt die dominierende Radioisotop in der diagnostischen Nuklearmedizin verwendet wird , mit mehr als 50 Millionen Bildgebungsverfahren pro Jahr weltweit durchgeführt 1, 2, 3. Die Mehrheit der 99m Tc Mittel werden klinisch Perfusion Radiopharmaka. Es gibt eine begrenzte Anzahl von aktiv gezielte Verbindungen , in denen 99m Tc gerichtet ist eine spezifische Biomarker durch Ligation an ein Targeting - Konstrukt zu binden. Die Erzeugung gezielter 99m Tc - Radiopharmaka wird häufig durch den Einfluß von 99m Tc-Ligand - Komplexe auf die Fähigkeit des dirigierenden Moleküls zu binden , um die Biomarker von Interesse gehinderte oder die Isotopen - Halbwertszeit nicht lang genug ist für die Verwendung mit höherem Molekulargewicht Biomoleküle wie Antikörper. Letzteres erfordert üblicherweise mehrere Tage vor Bildern, um für das Biomolekül erworben werden von Nicht-Ziel zu löschen tiss<html> ues. Pre-Targeting bietet einen alternativen Ansatz, diese Herausforderungen zu überwinden. Pre-Targeting mit bioorthogonale Chemie kombiniert wurde ein effektiver Weg gezeigt werden , für die Entwicklung neuer molekularer Bildgebungssonden sowohl für Fluoreszenz und Radio-Imaging - 4, 5, 6, 7, 8. Die inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) und trans -Cycloocten (TCO) -Derivate, wie in Figur 1 gezeigt ist , hat sich als besonders wirksam 6 erwiesen. Die IEDDA Reaktion mit diesen Komponenten können schnell Kinetik in PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) und eine hohe Selektivität aufweisen, wodurch es ideal für in - vivo - Pre-Targeting - Anwendungen macht 9, 10. e_content &quot;&gt; Die am häufigsten verwendete Ansatz umfasst ein TCO-derived Targeting - Vektor Verwaltung und eine ausreichende Verzögerung Folgezeit ein radioaktiv markiertes Tetrazin verabreicht. Radiolabeled Tetrazinen basierend auf 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr und 111 In gewesen 11 berichtete, 12, 13, 14, 15. im Gegensatz dazu gibt es nur einen Bericht eines 99m ist Tz-Tc markiert, die eine HYNIC - Typ - Liganden wurde unter Verwendung von der Verwendung von Co-Liganden erfordern Protein zu verhindern Bindung und den Abbau in vivo 16. Alternativ berichten wir hier die Synthese von 99m Tc (I) markiertem Tetrazinen eine Familie von Liganden , die mit einem [99m Tc (CO) 3] + Kern stabil dreizähnige Komplexe bilden. Abbildung 1: Die bioorthogonale IEDDA Reaktion zwischen Tetrazin und trans -Cycloocten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Familie von Liganden hergestellt enthalten dreizähnigen Chelate , die in der Polarität und der Natur der Linkergruppe zwischen der Metallbindungsbereich und dem Tz (Abbildung 2) variieren. Das Ziel war es, ein 99m zu identifizieren Tc-Tetrazin , dass effektiv lokalisieren und reagieren mit TCO-markierten Stellen in vivo konstruieren konnte und schnell klar , wenn sie nicht gebunden, um eine hohe Ziel-zu-Nichtziel - Verhältnisse zu erhalten. Um die Liganden zu testen, ein TCO-Derivat einer Bisphosphonat (TCO-BP) wurde 17 verwendet. Wir haben bereits gezeigt, dass TCO-BP zu den Bereichen der aktiven Knochenmetabolismus lokalisiert und reagieren mitradiomarkierten Tetrazinen in vivo 18. Es ist eine bequeme Reagenz neue Tetrazinen zu testen, da es in einem einzigen Schritt hergestellt werden können, und Experimente können in normalen Mäusen durchgeführt werden, in denen die Lokalisierung in erster Linie in den Gelenken (Knie und Schultern) auftritt.

<table><tbody><tr><td>Argongas</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td></td></tr><tr><td>---Na2B4O7&#183; 10H2O</td><td>Anachämie</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183; 4H2O</td><td>Anachämie</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc Generator</td><td>Lantheus medizinische Bildgebung</td><td>---</td><td>Quelle von 99mTcO4-0,9</td></tr><tr><td>% Kochsalzlösung</td><td>Lantheus medizinische Bildgebung</td><td>---</td><td>Zur Eluierung des Generators</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Labor Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Grade Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td></td><td>------</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Lieferant: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT Detektor (Artikel # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>HPLC-Säule zur Analyse und Aufreinigung von Verbindungen 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&reg; 5 & Mikro; m C18 110&nbsp; &Aring;, LC-Säule 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>HPLC-Säule zur Analyse und Reinigung der Verbindungen 1 und 5</td><td>Wasser&nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Säule, 130 &Aring;, 5 &micro; m, 4,6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Mikrowellenreaktor&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Initiator 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Verdampfer</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Serial # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Dosiskalibrator</td><td>Capintec, Inc.&nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Gamma-Zähler</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Automatischer Gamma-Zähler</td><td>---</td></tr><tr><td>Raumwaage für Tiere&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>Mikrowellen-Fläschchen&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>355629</td><td>0,5-2 ml&nbsp;</td></tr></tbody></table>

herstellung und auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; tc-markierte dreizähnige chelate für pre-targeting bioorthogonale chemie

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-Targeting in Kombination mit bioorthogonaler Chemie entwickelt sich zu einem effektiven Weg, um neue Radiopharmazeutika zu entwickeln. Von den verfügbaren Methoden hat sich die inverse Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Cycloaddition (IEDDA) zwischen einem radioaktiv markierten Tetrazin und trans-Cycloocten (TCO), das an ein Biomolekül gebunden ist, als äußerst effektiver bioorthogonaler Ansatz zur Abbildung spezifischer biologischer Ziele erwiesen. Trotz der Tatsache, dass Technetium-99m nach wie vor das am weitesten verbreitete Isotop in der diagnostischen Nuklearmedizin ist, gibt es einen Mangel an Methoden zur Herstellung von 99mTc-markierten Tetrazinen. In dieser Arbeit berichten wir über die Herstellung einer Familie von Tridentat-Chelat-Tetrazin-Derivaten und deren Tc(I)-Komplexen. Diese bisher unbekannten Verbindungen wurden mit 99mTc unter Verwendung eines mikrowellengestützten Verfahrens in einer radiochemischen Ausbeute von 31% bis 83% radioaktiv markiert. Die Produkte sind in Kochsalzlösung und PBS stabil und reagieren in vitro schnell mit TCO-Derivaten. Ihre in vivo Pre-Targeting-Fähigkeiten wurden anhand eines TCO-Bisphosphonats (TCO-BP)-Derivats demonstriert, das in Regionen mit aktivem Knochenstoffwechsel oder -verletzung lokalisiert ist. In murinen Studien zeigten die 99mTc-Tetrazine hohe Aktivitätskonzentrationen in Knien und Schultergelenken, was bei Experimenten in Abwesenheit von TCO-BP nicht beobachtet wurde. Die Gesamtaufnahme in Nichtzielorganen und die Pharmakokinetik variierten stark je nach Art des Linkers und Polarität des Chelats.

Die Liganden wurden unter Verwendung von verschiedenen Linkern synthetisiert und Chelatoren über eine einfache reduktive Aminierung Strategie (Abbildung 2), gefolgt von Kupplung des Produktes mit einem handelsüblichen Tetrazin 22, 23. Die radioaktive Markierung wurde mit der gleichen Methode für alle Verbindungen durchgeführt und war in hohem Maße reproduzierbar. Das Verfahren wurde durch Variieren des pH, der Me...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Radiomarkierung und in vivo Testung von dreizackigen 99mTc(I)-Chelat-Tetrazin-Derivaten für Pre-Targeting und bioorthogonale Chemie.

Herstellung und Auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Technetium-99m markierte Tetrazine für die prätargetierte Bildgebung mittels bioorthogonaler Chemie unter Verwendung von mit trans-Cycloocten modifizierten Biomolekülen als Targeting-Vektoren herzustellen. Diese Methode bietet eine wichtige neue Plattform für die Entwicklung neuartiger Radiopharmazeutika. Durch Prätargeting können die hier beschriebenen Technetium-Komplexe zur Bildgebung einer breiten Palette von Organen, Geweben und Biomarkern eingesetzt werden.Diese Technik ist vorteilhaft, da sie eine zuverlässige Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Herstellung von Tetrazinen bietet, die mit Technetium-99m radioaktiv markiert sind, dem am häufigsten verwendeten medizinischen Isotop in der Diagnostik. Diese Technik kann mit verschiedenen Zielvektoren verwendet werden, einschließlich kleiner Moleküle und Antikörper. Sie eignet sich zudem für die Radiotherapie, indem Technetium durch betastrahlende Isotope von Rhenium ersetzt wird.Die Durchführung eines Teils der Tierversuche erfolgt durch Nancy Janzen, Biologietechnikerin in unserem Labor. Um mit der Radio-Markierung zu beginnen, geben Sie in ein Mikrowellenfläschchen acht Milligramm Kaliumboranocarbonat, 15 Milligramm Natriumcarbonat, 20 Milligramm Natriumtetraborat-Decahydrat und 25 Milligramm Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat. Spülen Sie das Fläschchen 10 Minuten lang mit Argongas aus. Fügen Sie anschließend vier Milliliter Technetium-99m-Pertechnetat in 0,9 %iger Kochsalzlösung mit einer Aktivität von 1.110 Megabecquerel in das Fläschchen hinzu. Geben Sie das Reaktionsgemisch in einen Mikrowellenreaktor und rühren Sie 10 Sekunden lang um. Erhitzen Sie dann das Gemisch bei 110 Grad Celsius für 3,5 Minuten, um das Triaquatricarbonyl-Technetium-99m-Kation zu erhalten.Geben Sie etwa 400 Mikroliter einer einmolarigen Salzsäure hinzu, um den pH-Wert der Lösung auf 3,5 bis 4 einzustellen. Lösen Sie anschließend für jeden Tetrazin-Liganden zwei Milligramm Ligand in 250 Mikrolitern Methanol. Fügen Sie zu jeder Ligandlösung 250 Mikroliter des Technetium-99m-Komplexes mit einer Aktivität von 74 Megabecquerel hinzu.Erhitzen Sie das Gemisch in einem Mikrowellenreaktor bei 60 Grad Celsius für 20 Minuten. Bei Tetrazinliganden mit t-Butyl-Schutzgruppen überführen Sie die Lösung aus einer Mikrowellenkappe in eine 20-Milliliter-Scintillationskappe und verdampfen anschließend das Lösungsmittel. Lösen Sie jeden Komplex erneut in einem Milliliter einer volumengleichen Mischung aus Dichlormethan und Trifluoressigsäure auf. Danach überführen Sie die Lösung in eine Mikrowellenkappe und erhitzen diese Komplexe in einem Mikrowellenreaktor bei 60 Grad Celsius für sechs bis zehn Minuten, um die Liganden zu deschützen.Kühlen Sie die Komplexe auf Raumtemperatur ab und verdampfen Sie anschließend das Lösungsmittel. Lösen Sie die Rückstände erneut in 500 Mikrolitern einer wässrigen Lösung aus Acetonitril oder Methanol und Wasser im Verhältnis 1:1 auf, bevor Sie mit der HPLC-Reinigung fortfahren. Verwenden Sie eine C18-Rückstauf-HPLC, um jeden radioaktiv markierten Tetrazin-Komplex mit einem Elutionsgradienten von 30 bis 70 auf 40 bis 60 Acetonitril zu Wasser über 20 Minuten zu reinigen, wobei während des gesamten Vorgangs 0,1 % Trifluoressigsäure im Elutionsmittel enthalten ist.Sammeln Sie das gereinigte Produkt, wenn es in der Gammakurve eluiert wird. Danach geben Sie jeden markierten Komplex gemeinsam mit einer Lösung von 0,125 Milligramm des entsprechenden Radium-Tetrazin-Komplexes in 20 % Methanol in Wasser injizieren. Vergleichen Sie die Retentionszeiten des Rhenium-Komplex-Peaks in der UV-Kurve und des Technetium-Komplex-Peaks in der Gammakurve, um die Identität des Gamma-Peaks zu bestätigen.Entfernen Sie das Lösungsmittel von jedem gereinigten Technetium-Tetrazin-Komplex. Formulieren Sie jeden Komplex auf eine Konzentration von 7,4 Kilobecquerel pro Mikroliter in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,01 % Polysorbat 80. Ziehen Sie für jedes Mäuseexemplar 100 Mikroliter einer Lösung mit fünf Mikrogramm pro Mikroliter des TCOPB-Derivats in Kochsalzlösung in eine Spritze, um eine Dosis von 20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht vorzubereiten.Verbinden Sie eine 30-Gauge-Nadel mit der Dosierspritze. Platzieren Sie das Mäuseexemplar in einer physikalischen Fixiervorrichtung. Identifizieren Sie die Venen an der Seitenfläche des Schwanzes etwa zwei Zentimeter von der Schwanzspitze entfernt und wischen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer ab.Führen Sie die Spritzennadel in einem flachen Winkel parallel zur Vene ein. Injizieren Sie langsam das TCOBP-Derivat. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie einen sauberen Gazeverband mit leichtem Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung gestoppt ist.Eine Stunde nach der Injektion des TCOBP-Derivats verabreichen Sie eine 100-Mikroliter-Dosis des gewünschten Technetium-99m-Tetrazin-Komplexes mit einer Aktivität von etwa 0,74 Megabecquerel über eine Schwanzveneninjektion. Messen Sie die Aktivität einer 100-Mikroliter-Testprobe des Technetiumkomplexes zum Zeitpunkt der Injektion mit einem Dosisleiter. Bewahren Sie die Testprobe für spätere Messungen auf.Betäuben Sie die Maus sechs Stunden nach der Injektion mit einem Gasgemisch aus 3 % Isofluran und 2 % Sauerstoff. Legen Sie die Maus auf den Rücken, sodass ihre Nase im Nasenkegel verbleibt, um die Anästhesie fortzusetzen, und lokalisieren Sie den Schwertfortsatz. Verbinden Sie eine 25-Gauge-Nadel mit einer vorbehandelten Spritze, die mit Heparin präpariert wurde.Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 20 Grad unterhalb des Xiphoidfortsatzes leicht links der Mittellinie ein. Sobald die Nadel vollständig eingeführt ist, ziehen Sie langsam den Kolben zurück, um auf Blut in der Nadelaufnahme zu prüfen, was einen erfolgreichen Herzdurchstich bestätigt. Stellen Sie die Nadel nach Bedarf erneut ein.Nachdem das Herz punktiert wurde, langsam einen Milliliter Blut in die Spritze ziehen. Die Blutprobe in ein vorher gewogenes Zählrohr überführen. Das Mäuschen unter Narkose durch Halsbruch euthanisieren.Legen Sie das euthanasierte Tier in eine Plastiktüte und messen Sie die gesamte Körpertätigkeit mit einem Dosis-Kalibrator. Sammeln Sie dann das Knie- und Schulterbein, die Gallenblase, die Nieren, die Leber, die Schilddrüse und die Luftröhre sowie den Schwanz. Sammeln Sie zusammen mit ihrem Inhalt den Magen, den Dünndarm, den Dickdarm und das Caecum sowie die Harnblase.Spülen Sie das Blut von allen gesammelten Geweben mit Ausnahme der Gallen- und Harnblase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ab. Tupfen Sie die Gewebe trocken und geben Sie jedes Gewebe in ein vorher gewogenes Zählrohr. Messen Sie die Restaktivität des Körpers. Wiegen Sie jede Gewebeprobe und berechnen Sie die Masse des reinen Gewebes. Verwenden Sie einen Multi-Detektor-Gammazähler, um die Aktivität eines fünf Mikroliter großen Aliquots der Testprobe mit dem Technetiumkomplex zu messen. Berechnen Sie anhand des erhaltenen Werts in Zählraten pro Minute und der zum Zeitpunkt der Injektion gemessenen Aktivität einen Umrechnungsfaktor.Messen Sie die Aktivität jeder Gewebe- und Flüssigkeitsprobe mit dem Gammadetektor. Wandeln Sie die Werte in Mikrocurie um, und normieren Sie jeden Wert anhand des Organgewichts, um den prozentualen injizierten Dosisanteil pro Gramm Gewebe zu bestimmen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit zusätzlichen Mäusen, denen keine TCOPB-Derivat-Injektion verabreicht wurde, als negative Kontrollreihe.Mithilfe dieser Methode wurden fünf Tetrazin-Komplexe, die sich in ihren Linker- und Key-Leader-Kombinationen unterscheiden, mit Technetium-99m markiert. Ein TCOPB-Derivat, das sich in Bereichen mit hohem Kalziumumsatz im Knochen anreichert, wurde verwendet, um die Schulter- und Kniegelenke von Mäusen vorzurichten. Die Verhältnisse der prozentualen injizierten Dosis pro Gramm Gewebe für Knochen zu Blut wurden für jeden Tetrazin-Wirkstoff berechnet.Alle fünf Verbindungen wurden rasch aus dem Blut eliminiert und zielten auf den Knochen, was darauf hindeutet, dass die selektive bioorthogonale Kopplungsreaktion zwischen den Tetrazin-Verbindungen und dem TCOBP-Derivat in vivo stattgefunden hatte. Verbindung drei zeigte die beste Kombination aus Zielgerichtetheit und Bluteliminierung. Kontrollexperimente ohne Zusatz des TCOBP-Derivats zeigten, dass die radioaktiv markierten Tetrazin-Komplexe nicht signifikant im Knochen angereichert wurden.Beispielsweise wies Verbindung zwei hohe Konzentrationen in der Gallenblase und im Darm auf, jedoch nur sehr geringe im Knochen, wenn das TCOBP-Derivat nicht verabreicht wurde. Bei Mäusen, die das TCOBP-Derivat erhielten, zeigte sich eine breite Variation in der Gewebelokalisation unter den fünf getesteten Verbindungen. So war beispielsweise von Verbindung drei im Dickdarm, in der Leber sowie im Urin und in der Blase im Vergleich zu anderen Komplexen nur sehr wenig nachweisbar, während im Knochen deutlich mehr von Verbindung drei zu finden war.Wenn die hier beschriebene Markierungstechnik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung von Anfang bis Ende in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Reagenzien genau abgewogen werden und dass die Salze vor der Zugabe zur Technetiumlösung mit Argon gespült werden. Außerdem ist es entscheidend, dass der pH-Wert der Technetiumlösung vor der Zugabe des Tetrazinliganden auf 3,5 bis 4 eingestellt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Technetium-markierte Tetrazine herstellt und reinigt, und wie diese zur Herstellung neuer radioaktiver Arzneimittel mithilfe von Prätargeting- und bioorthogonaler Chemie eingesetzt werden können. Vergessen Sie nicht, angemessene Vorsichtsmaßnahmen beim Arbeiten mit Radioaktivität zu treffen, beispielsweise indem Sie die Art der emittierten Strahlung verstehen und wissen, wie Proben am besten abgeschirmt und gehandhabt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Dieses Video beschreibt die Technik der präzielgerichteten Radioimmuntherapie oder PRIT, bei der Immunkonjugate gefolgt von Radioliganden zur Behandlung von Tumoren verabreicht werden. Diese Radioimmuntherapie reduziert die Strahlendosis für gesundes Gewebe und verwendet Radionuklide mit sehr geringen Halbwertszeiten, die mit antikörperbasierten Vektoren inkompatibel sind.

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Um MR Krebs molekulare Bildgebung mit einem kleinen Peptid gezielte MRT-Kontrastmittel spezifischen geronnen Plasmaproteine ​​in Tumorstroma in einem Mausmodell zeigen, Prostata-Krebs.

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Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture.

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Die bioorthogonale inverse Elektronennachfrage Diels-Alder-Cycloaddition wurde genutzt, um eine effektive und modulare prägezielte PET-Bildgebungsstrategie für Krebs zu entwickeln. In diesem Protokoll werden die Schritte dieser Methodik im Kontext eines Modellsystems beschrieben, das den auf Darmkrebs abzielenden Antikörper huA33 und einen 64-Cu-markierten Radioliganden verwendet.

Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

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Die Biokonjugation und Radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-markiertem Antikörper

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

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Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

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Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

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