A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

Das übergeordnete Ziel dieser einfachen Methode ist es, B-lymphoblastoide Zelllinien oder B-LCLs mit hoher Immortalisierungseffizienz mit nur einer kleinen Menge Blut zu etablieren und Zeit zwischen Initiierung und Kryokonservierung zu sparen. Dabei handelt es sich um eine neuartige Methode zur Immortalisierung menschlicher B-Zellen aus Vollblut durch Lyse roter Blutkörperchen. B-LCLs stellen eine wertvolle Quelle für Biomaterialien dar, um verschiedene Studien durchzuführen.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass nur 0,5 Milliliter Blut ausreichen, um B-LCLs mit Immortalisierungseffizienz und hoher Zellviabilität zu erhalten. Zur Etablierung von B-LCLs durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) durch Umwandlung von B-Lymphozyten, der weit verbreiteten Methode, in separate mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder PBMC durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation. Wenn die Probe jedoch weniger als einen Milliliter der Lyse der roten Blutkörperchen enthält, schlägt die Zugabe fehl.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass es schwierig ist, das PBMC aus kleinen roten Blutkörperchen mit einer Dichtegradienten-Trennmethode zu isolieren. Um EBV vorzubereiten, beginnen Sie am ersten Tag mit dem Auftauen von B95-8-Zellen und kultivieren Sie in einem T25-Kulturkolben in sechs Millilitern vollständigem RPMI 1640 Medium, das mit 10 % FBS, zwei Millimolaren L-Glutamin und Antibiotika ergänzt wird. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Beobachten Sie am zweiten Tag unter dem Mikroskop die Zellmorphologie. Die Zellen sind in gutem Zustand, wenn sie hell und rund sind. Geben Sie 10 Milliliter vollständiges RPMI 1640 Medium in die Kultur.

Am vierten Tag fügen Sie 10 Milliliter frisches Medium hinzu und überführen Sie die Zellen in einen T75-Kulturkolben. Dann, am achten Tag, fügen Sie 20 Milliliter mehr Medium hinzu und halten Sie die Zellen acht Tage lang ohne Zugabe von frischem Medium aufrecht. Überprüfen Sie am 16. Tag die Zellen unter dem Mikroskop.

Sammeln Sie dann 12 Milliliter Zellen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend kryokonservieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius und tauen die Kulturen schnell bei 37 Grad Celsius auf. Wiederholen Sie das Auftauen des Einfrierens noch dreimal, bis die Viruspartikel aus den Zellen freigesetzt werden.

Die Kulturen werden bei 240 mal g bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Filtrieren Sie dann den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter. Aliquotieren Sie 12 Milliliter des Filtrats pro Röhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius.

Geben Sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen 0,5 Milliliter Vollblut, das durch EDTA K2 antikoaguliert wurde. Geben Sie einen Milliliter Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen in das Vollblut und mischen Sie es gut. Inkubieren Sie die Mischung vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann schnell fünf bis sieben Milliliter 1x PBS hinzufügen, um die Lysereaktion zu stoppen.

Blut Lysepuffer für rote Blutkörperchen zugesetzt haben, achten Sie darauf, gut zu mischen. Die Invertierung sorgt dafür, dass die Reaktion rechtzeitig beendet wird. Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 240 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Die weißen Blutkörperchen fallen am Boden des Röhrchens aus. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie den Niederschlag, indem Sie sieben Milliliter 1640 Basic Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie dann die Lösung, bevor Sie den Waschvorgang wiederholen.

Mit 300 Mikrolitern Transformationsmedium resuspendieren Sie das Zellpellet. Um eine EBV-Infektion durchzuführen, fügen Sie der Zellsuspension 60 Mikroliter à 20 Mikrogramm pro Milliliter Cyclosporin A hinzu. Tauen Sie ein Aliquot von EBV bei 37 Grad Celsius schnell auf und geben Sie 240 Mikroliter des Virus in die Zellen.

Mischen Sie die Suspension gründlich und geben Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung auf eine 96-Well-Platte. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie im ersten Monat nach der EBV-Infektion einmal pro Woche die Hälfte des Mediums in der Zellkultur.

Am siebten Tag ist unter dem Mikroskop nur eine dicke Schicht aus Zellfragmenten zu sehen. Nach einem Monat der Infektion sind lymphoblastoide Zellcluster unter einer dicken Schicht von Zellfragmenten sichtbar. Wechseln Sie ab diesem Zeitpunkt alle drei Tage die Hälfte des Mediums, bis die Zellcluster unter dem Mikroskop deutlich sichtbar sind.

Nachdem Sie die Zellen resuspendiert haben, übertragen Sie die Suspension in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Dann, abhängig von der Geschwindigkeit des Zellwachstums, wenn das Kulturmedium gelb wird, verdoppeln Sie das Volumen des vollständigen RPMI 1640 Mediums. Wenn lymphoblastoide Zellcluster mit bloßem Auge sichtbar sind, wird die Kultur in einen T25-Kulturkolben überführt.

Wenn das Kulturmedium gelb wird, verdoppeln Sie das Volumen des Mediums, bis sich das Volumen auf 10 bis 15 Milliliter ausdehnt. Wechseln Sie vor dem Einfrieren das Medium 24 Stunden im Voraus. Um die Zellen dann einzufrieren, zentrifugieren Sie die Zellsuspension und verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellen zu zählen.

Mit der gefrorenen Stammlösung, die 90 % FBS und 10 % DMSO enthält, wird die Suspension auf eine Dichte von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter eingestellt. Frieren Sie dann die Suspension mit einer Geschwindigkeit von einem Grad Celsius pro Minute auf minus 80 Grad Celsius ein, bevor Sie die gefrorenen Zellen direkt in flüssigen Stickstoff überführen. Während des Transformationsprozesses sind die morphologischen Veränderungen der Zellen lichtmikroskopisch sichtbar.

Nach sieben Tagen der Infektion sind kleine Zellcluster mit der Methode der Dichtegradiententrennung deutlich sichtbar, während bei der Methode der Lyse roter Blutkörperchen nur eine dicke Schicht von Zellfragmenten sichtbar ist. 30 Tage nach der Infektion sind lymphoblastoide Zellcluster unter der dicken Schicht von Zellfragmenten sichtbar. Bei häufigeren Mediumwechseln werden die Zelltrümmer reduziert und die Zellverbände sind deutlich sichtbar und sehen ähnlich aus wie die Kultur, die durch Dichtegradiententrennung etabliert wurde.

Schließlich wurde der MTT-Assay verwendet, um die Lebensfähigkeit von B-LCLs zu bewerten. Die hier gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-LCLs-Zellen, die mit der Rotblutlysemethode kultiviert wurden, signifikant lebensfähiger waren als die Kultur, die mit der Dichtegradiententrennmethode etabliert wurde. Einmal gemeistert, kann der EBV-Virustransformationsprozess in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie B-LCLs mit einer einfachen und zeitsparenden Methode zur Lyse roter Blutkörperchen ohne vorherige Reinigung der Lymphozyten etablieren können. Nach ihrer Entwicklung beschleunigte diese Technik den Fortschritt der Genomik-, Transkriptomik- und Proteomik-Studie von EBV-assoziierten Erkrankungen und diese Anwendung bei der Herstellung von mononukleären Antikörpern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Krankheitserregern wie EBV äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.