Name: A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur Etablierung von B-Lymphoblastoidzelllinien durch Erythrozytenlyse mit nur 0,5 ml Blut. Diese Technik spart Zeit und liefert hohe Immortalisierungsraten für zellbiologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Schlüsselprojekte der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategisches Unterstützungssystem für biologische Ressourcen der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1).

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Genetik und Entwicklungsbiologie genehmigt, und das Protokoll folgt den Richtlinien des Instituts für das Wohlergehen der Menschen. 1. Herstellung von EB-Virus <ol><li> Am Tag 1 auftauen B95-8 Zellen und der Kultur in 6 ml komplettem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 ug / ml Streptomycin, 100 U / ml Penicillin) in einem ergänzten T25 Kulturflasche. Legen Sie die Kulturflasche in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Am Tag 2 werden die Zellmorphologie unter einem Mikroskop zu beobachten. Die Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind. In 10 ml komplettem RPMI-1640-Medium. </li><li> Am Tag 4, 10 ml frisches vollständiges RPMI-1640-Medium, und dann in einen T75-Kulturkolben übertragen. </li><li> Am Tag 8 20 ml komplettem RPMI-1640-Medium. </li><li> Pflegen Sie die Zellen für 8 Tage ohne Zugabe von frischem Medium, das heißt, Hunger. </li><li> Am Tag 16, beobachten Zellenunter dem Mikroskop beobachtet. Sammle die Zellen in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen wurden 12 ml / Röhrchen. </li><li> für 1 h bei -80 ° C Cryo-bewahren, und dann bei 37 ° C schnell aufgetaut. 3-mal wiederholen, bis die Viruspartikel aus den Zellen freigesetzt werden. </li><li> Zentrifuge bei 240 × g für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Filtern Sie die Überstand durch ein 0,22-um-Filter, aliquoten, 12 ml / Röhrchen, und bei -80 ° C. </li></ol> 2. Behandlung von Vollblut mit der roten Blutkörperchen Lysepuffer <ol><li> 0,5 mL Vollblut durch EDTA antikoaguliertem · K 2 in ein 15 ml Röhrchen. </li><li> Geben Sie 1 ml der roten Blutkörperchen Lysepuffer (gefiltert durch 0,22 um Filter und Auftauen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch) mit dem Vollblut und gut mischen. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 4 min. Dann fügen Sie 5-7 ml 1x PBS schnell auf die Stoppreaktion. </li><li> Zentrifuge bei 240 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Weiße Blutkörperchen werden am Boden des Röhrchens auszufällen. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die Fällung durch Zugabe von 7 ml 1640 Basismedium. Zentrifuge für 5 Minuten bei 240 xg bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 300 &amp; mgr; l Transformationsmedium (RPMI 1640 Medium, 20% fötales Rinderserum und 10 ug / ml Phytohämagglutinin (PHA)). </li></ol> 3. EBV-Infektion <ol><li> Hinzuzufügen 60 ul 20 ug / ml Cyclosporin A (CsA) zu der Zellsuspension. </li><li> Schnell ein Aliquot von EBV auftauen bei 37 ° C. Hinzufügen 240 uL EBV zu der Zellsuspension. </li><li> Gut mischen und legen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte, 200 &amp; mgr; l pro Vertiefung. Verdunstung, 200 ul 1x PBS zu jedem gut um der 96-Well-Platte zu vermeiden. Die Platte wird in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 4. Erweiterung und Kryokonservierung von B-LCL <ol><li> Ändern Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche im ersten Monat nach der EBV-Infektion. Nur eine dicke Layer von Zellbruchstücke sichtbar ist unter dem Mikroskop am Tag 7 (Abbildung 2). Nach einem Monat der EBV - Infektion sind lymphoblastoiden Zellcluster sichtbar unter einer dicken Schicht von Zellfragmente unter dem Mikroskop (Figur 2). </li><li> Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 Tage , bis die Zellhaufen deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2) sind. Typischerweise dauert dieser Vorgang 10 bis 20 Tage. </li><li> Nach dem Mischen pipettieren die Zellen und Transfer zum 24-Well-Platte. Die doppelte Volumen des Kulturmediums mit komplettem RPMI 1640, während es gelb wird. Dieses Verfahren hängt von der Rate des Zellwachstums. </li><li> Anschließend übertragen die Zellen zu T25 Kulturflasche. Die doppelte Volumen des Kulturmediums, wie es gelb wird, bis das Volumen des Mediums auf 10 erweitert - 15 ml. </li><li> Ändern Sie Medium 24 h vor dem Einfrieren. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 240 x g. Zählen von Zellen mit einem Zellzähler und gefrier bei einer Dichte von von 5 bis 10 x 10 6 / ml in frozen Stammlösung 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Einfrieren bei einer Rate von 1 ° C pro min auf -80 ° C und übertragen dann direkt in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) Assay 17 <ol><li> Bereiten Sie eine B-LCL Einzelzellsuspension mit dem 1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält. Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well - Platte, 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung. </li><li> Die Platte wird in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 12 - 16 Uhr. </li><li> In MTT (5 mg / ml) zu den Vertiefungen, in denen Zellen wachsen und halten weg von Licht für 4 h bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugenzellenplatte für 10 min bei 168 x g. </li><li> Überstand entfernen und mit 100 &amp; mgr; l DMSO pro Vertiefung. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig. Berühren Sie nicht die nadelförmigen Farbstoffkristalle. </li><li> Schütteln Sie die Platte für 10 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit vollständig um die Kristalle aufzulösen. </li><li> Measure Absorption bei 570 nm durchunter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Spektrophotometer. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir berichten über die Entwicklung eines neuartigen Verfahrens zum Lysieren von roten Blutkörperchen menschlichen B-Zellen aus Vollblut Immortalisierung und seine Lebensfähigkeit der Zellen von etablierten B-LCLs durch den MTT-Test bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs durch die roten Blut Verfahren Zelllyse eingerichtet ist viel höher als die des Dichtegradienten Trennungsverfahren. Der große Vorteil der roten Blutkörperchen Verfahren der Lyse ist, dass es einfach ist, und erf...

Ruhende B-Zellen könnten durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) in vitro in aktiv proliferierende B-lymphoblastoide Zelllinien (B-LCLs) umgewandelt werden. B-LCLs ähneln Keimzellen in Differenzierung und Entwicklung, und die somatische Mutationsrate von B-LCLs betrug nur 0,3%1, mit vernachlässigbaren genetischen und phänotypischen Veränderungen. Daher haben B-LCLs als Surrogate für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) den Fortschritt der Genomik-, Transkriptomik- und Proteomik-Studien zu EBV-assoziierten Erkrankungen erheblich beschleunigt2,3. Darüber hinaus haben B-LCLs auch eine wichtige Anwendung beim Screening monoklonaler Antikörper4,5. 
Es wurden mehrere Methoden zur Immortalisierung von B-Lymphozyten durch EBV entwickelt. Zu den wichtigsten gängigen Verfahren gehören die Isolierung von B-Lymphozyten und die Verwendung von B95-8-Zelllinien zur Herstellung von infektiösem EBV. Von der Isolation bis zur Transformation werden diese Methoden in drei Strategien unterteilt. Lymphozyten werden durch Dichtegradientenzentrifugation undEBV-Transformation direkt 6-8 vom frischen Blut getrennt, in dieser Studie als Dichtegradiententrennungsmethode bezeichnet. Andere Techniken überwinden jedoch die Schwierigkeit, frisches Blut zu transportieren, und verwenden ein Verfahren zum Einfrieren gereinigter Lymphozyten und zum anschließenden Auftauen und zurEBV-Infektion 9-11. Kryokonserviertes Vollblut kann auch für die Isolierung von B-Lymphozyten und die Transformation verwendet werden12,13. Neben der Dichtegradientenzentrifugation zur Trennung von B-Lymphozyten verwenden einige Forscher einen magnetischen Zellsortierer, um B-Lymphozytenauszuwählen 12. Die magnetische Trennung ist jedoch ein teurer, komplexer und zeitaufwändiger Prozess. Obwohl diese Methoden nützlich sind, um B-Lymphozyten mit einer hohen Erfolgsrate zu immortalisieren, erfordern die Notwendigkeit, eine große Anzahl klinischer Proben zu behandeln, und das relativ kleine Blutvolumen eine einfachere Methode zur Etablierung einer permanenten Zelllinie.
Eine weitere, weniger häufig verwendete Methode ist die Verwendung von Vollblut als Quelle für kernhaltige Zellen für EBV-Infektionen und die Etablierung von B-LCLs. Diese Methoden vereinfachen die Technik, indem sie das Trennverfahren weglassen. Nur eine kleine Menge Vollblut, entweder frisch14 oder gefroren15,16, reicht aus, um die Zelllinien zu gewinnen. Leider gibt es große Unterschiede im Erfolg der Dokumente15, 16 und einiger unserer Validierungstests. Darüber hinaus werden transformierte Kolonien unter dem Mikroskop wegen der großen kontaminierenden Verunreinigungen kaum erkannt. Daher ist eine zuverlässigere Methode für die Transformation erforderlich.
Basierend auf den obigen Überlegungen haben wir eine neuartige Methode entwickelt, um B-LCLs ohne vorherige Reinigung der Lymphozyten zu etablieren, die sogenannte Methode zur Lyse roter Blutkörperchen. Diese Methode ist bequem, zeitsparend und auf eine große Anzahl von Proben anwendbar. Bereits 0,5 ml Vollblut reichten aus, um B-LCLs zu erhalten, die von Säuglingen und älteren Menschen leicht zu erhalten sind, ohne deren Gesundheit wesentlich zu beeinträchtigen.

<table><tbody><tr><td>Zentrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Zentrifugation</td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Zählstern</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>Für die Zellzählung&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Zur Messung der Absorption</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturcluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturcluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>25 cm2 Zellkulturflasche</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polystyrol& nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Komponente von B-LCLs mittel</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Für B-LCLs medium</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Bestandteil von B-LCLs medium</td></tr><tr><td>100x Streptomycin Penicillinlösung BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Bestandteil von B-LCLs medium</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp; Gesundheitswesen</td><td>17-1440-03</td><td>Zur in vitroIsolierung von Lymphozyten</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Zur Stimulierung der Lymphozytenproliferation</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Cayman&nbsp; Chemikalie</td><td>12088</td><td>Zur Hemmung der Zytotoxizitätswirkung von T-Zellen</td></tr><tr><td>Erythrozytenlysepuffer</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Zur Lyse roter Blutkörperchen</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Zum Nachweis der Zellviabilität</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Zum Einfrieren von Zellen</td></tr></tbody></table>

a simple red blood cell lysis verfahren zur etablierung von b lymphoblastoidzelllinien

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Es gibt eine Reihe von Methoden zur Umwandlung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus in vitro in immortalisierte Zelllinien. Wir haben eine neue Methode mit einer leistungsstarken und einfachen Strategie für die Etablierung von B-LCLs, der Methode zur Lyse roter Blutkörperchen, entwickelt. Diese Methode vereinfachte das PBMC-Trennungsverfahren mit der Entfernung roter Blutkörperchen und verwendete nur 0,5 ml Vollblut für die Etablierung von EBV-immortalisierten Zelllinien, die sich in relativ kurzer Zeit zu großen Zellzahlen mit einer Erfolgsquote von 100 % vermehren können. Die Methode ist einfach, zuverlässig, zeitsparend und für die Behandlung einer großen Anzahl klinischer Proben anwendbar.

Während des Prozesses der Transformation werden die morphologischen Veränderungen der Zellen durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2) visualisiert. Kleine Gruppen von Zellen waren deutlich sichtbar mit dem Dichtegradienten Trennverfahren nach 7 Tagen nach der Infektion, während nur eine dicke Schicht aus Zellfragmente aus der roten Blutkörperchen Lyseverfahren sichtbar sind. Allerdings sind Lymphoblastoidzelllinien Cluster sichtbar unter der dicken Schicht von Zellfragmente ...

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Das übergeordnete Ziel dieser einfachen Methode besteht darin, B-Lymphoblastoidzelllinien, oder B-LCLs, mit hoher Immortalisierungseffizienz zu etablieren, wobei nur eine geringe Menge Blut benötigt wird und die Zeit zwischen Inokulation und Kryokonservierung verkürzt wird. Dies ist eine neuartige Methode zur Immortalisierung menschlicher B-Zellen aus Vollblut durch Lyse der roten Blutkörperchen. B-LCLs stellen eine wertvolle Quelle an biologischem Material für verschiedene Untersuchungen dar.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass nur 0,5 Milliliter Blut ausreichen, um B-LCLs mit hoher Immortalisierungseffizienz und guter Zellviabilität zu erhalten. Zur Herstellung von B-LCLs durch das Epstein-Barr-Virus, oder EBV, das B-Lymphozyten transformiert, wird üblicherweise die Methode verwendet, periphere mononukleäre Blutzellen, oder PBMC, mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation zu isolieren. Wenn jedoch die Probe weniger als ein Milliliter beträgt, schlägt die Zugabe eines Lysepuffers für rote Blutkörperchen fehl.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir feststellten, dass die Isolierung von PBMCs von kleinen roten Blutkörperchen mittels Dichtegradiententr

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Forschung

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in...

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

In diesem Video beschreiben wir eine Methode, um die Organellendynamik in B-Lymphozyten nach ihrer Aktivierung mit antigenbeschichteten Mikrokügelchen zu untersuchen.

Organellendynamik in B-Lymphozyten nach Aktivierung mit antigenbeschichteten Kügelchen

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Eine In-vitro-Technik zur Stimulation von Lymphozyten über pathogene Bakterien

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Rolle von neutrophilenähnlichen Zellen beim Schutz von Lymphomzellen vor der Zytotoxizität von Chemotherapeutika untersucht. Eine 3D-Co-Kultur, bestehend aus Lymphom- und neutrophilenähnlichen Zellen, wird etabliert und mit Vincristin – einem Chemotherapeutikum – belichtet. Der direkte Kontakt mit den neutrophilenähnlichen Zellen induziert eine Hochregulierung der anti-apoptotischen Proteine in den Lymphomzellen und fördert dadurch deren Überleben in...

Bestimmung der Rolle neutrophilenähnlicher Zellen bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber einem Testmedikament

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

T-Lymphozyten-Mitogenese geht mit einer blastogenen Transformation einher, woraufhin sich das Zellvolumen vor der Zellteilung vergrößert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Blastogenese in T-Lymphozyten unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers, der in der Lage ist, Zelldurchmesser zu messen.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie in der westlichen Welt. NFAT Transkriptionsfaktoren sind wichtige Regulatoren von Entwicklung und Aktivierung in zahlreichen Zelltypen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) in menschlichen CLL-Zellen, neuartige Zielgene des NFAT2 zu identifizieren.

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Lernen Sie eine effiziente Methode zur Etablierung von B-Lymphoblastoidzelllinien durch Erythrozytenlyse mit nur 0,5 ml Blut. Diese Technik spart Zeit und liefert hohe Immortalisierungsraten für zellbiologische Forschung.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

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