Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation

Das übergeordnete Ziel dieses Zellisolationsverfahrens und Migrationsprotokolls ist es, einen zuverlässigen Weg zur Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen und ihres Migrationspotenzials in Serumproben von herzchirurgischen Patienten aufzuzeigen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Regeneration der Endothelschleimhaut und der Blutgefäße zu beantworten, die nach einer Herzoperation aufgrund von Ischämie und Reperfusionsverletzungen erforderlich ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die relativ einfache Art der Isolierung von Vorläuferzellen, einschließlich der Vorisolierung von CD-34-positiven Zellen.

Neben Todesfällen sind nach wie vor zu häufige schwerwiegende Komplikationen der Herzoperation. Unterstreicht die Notwendigkeit, das Krawattenrisiko und die Schutzmechanismen bei Herzoperationen zu identifizieren. Endotheliale Vorläuferzellen sind entscheidend an der Neovaskularisation von ischämischen Geweben beteiligt und für ihre kardioprotektiven Eigenschaften bekannt.

Um das Experiment zu beginnen, mischen Sie Blut eins zu eins mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS. Geben Sie 15 Milliliter Dichtegradientenlösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Und schichten Sie das verdünnte Blut langsam auf die Dichtegradientenlösung.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben. Sammeln Sie mit einer sterilen Plastikpipette vorsichtig die Buffy-Coat-Schicht jedes Röhrchens und legen Sie es in ein anderes Röhrchen, wobei Sie die Dichtegradientenlösung vermeiden. Verdünnen Sie die mononukleäre Zelle des peripheren Blutes oder die PBMC-Fraktion mit mindestens drei Volumina PBS und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren.

Zentrifugieren Sie das Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 mal G. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Endothelzellwachstumsmedium MV-2. Nach der Resuspendierung der Zellen werden 100 Mikroliter humaner CD-34-Antikörper pro verwendetem Buffy Coat hinzugefügt und die Zellen rotiert. Fügen Sie 50 Mikroliter mit Dextran beschichtete Magnetkügelchen pro verwendetem Buffy Coat hinzu und drehen Sie die Zellen.

Nach der Inkubation wird die Suspension mit maximal drei Millilitern auf jedes Röhrchen in Faxröhrchen überführt. Stecken Sie dann die Faxschläuche in die Magnete und warten Sie fünf Minuten. Entsorgen Sie das Übersättigungsgetränk, ohne die Faxschläuche aus dem Magneten zu ziehen.

Suspendieren Sie dann außerhalb der Magnete die Zellen in jedem Faxrohr mit drei Millilitern MV-2-Medium. Die Zellsuspension wird in vorbeschichtete T-75-Kolben überführt. 17 Milliliter MV-2 Medium werden in jeden Kolben gegeben.

Zur Vorbereitung des Migrationsassays wird das Medium mit einer Pipette aus den endothelialen Vorläuferzellen oder den EPCs im T-75-Kolben entfernt. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS und schütteln Sie den Kolben vorsichtig. Entfernen Sie als Nächstes das PBS und fügen Sie fünf Milliliter handelsübliche Zellablösungslösung hinzu.

Warten Sie dann, bis sich die Zellen unter einem Lichtmikroskop gelöst haben. Beschleunigen Sie das Ablösen, indem Sie vorsichtig auf den Boden des Kolbens klopfen. Wenn die Zellen abgelöst sind, fügen Sie schnell fünf Milliliter MV-2 Complete Medium hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein anderes Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 2.000 x G. Nachdem Sie die Zellen pelletiert haben, resuspendieren Sie sie in fünf bis zehn Millilitern PBS. Und zentrifugieren Sie sie erneut.

Resuspendieren Sie die Zellen erneut in fünf bis zehn Millilitern PBS und zentrifugieren Sie anschließend. Resuspendieren Sie das Zellenpellet in MV-2 armem Medium. Als nächstes verdünnen Sie die Serumprobe eins bis fünf in MV-2-ausgehungertem Medium.

Bereiten Sie die Migrationsplatte vor, indem Sie 235 Mikroliter der Serumprobe in die untere Kammer geben. Fügen Sie den Einsatz kurz vor der Zugabe der Zelllösung hinzu. Geben Sie dann 75 Mikroliter der Zelllösung in die obere Kammer.

Erlauben Sie die Migration der EPCs. Entfernen Sie die obere Kammer, in der sich alle nicht migrierten Zellen befinden. Fügen Sie 75 Mikroliter 3,6-prozentige Paraformaldehydlösung hinzu, einschließlich Hoechst-Farbstoff, verdünnt auf eins bis 1.000.

Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um alle Zellen ein bis zwei Minuten lang in die gleiche Fokusebene bei 2.000 x G zu bringen. Um Autofluoreszenzartefakte im Serum zu vermeiden, quantifizieren Sie die migrierten Zellen, indem Sie fünf Bilder pro Vertiefung mit 100-facher Vergrößerung unter einem Mikroskop aufnehmen. Zählen Sie abschließend die migrierten Zellen mit der halbautomatischen Software.

Die Faxanalyse der EPCs verifiziert die Aufnahme von acLDL sowie die Expression von CD-31 auf der Oberfläche der isolierten Zellpopulation. Die Isolierung der Analyse von acLDL und CD-31 zeigt eine homogene Verteilung der einzelnen Marker. Elyso zur Identifizierung des Einflusses der Herzchirurgie nach myokardialer Reperfusionsverletzung auf die Konzentrationen der zirkulierenden Serumspiegel von MIF, CXCL12, CXCL8 und VEGF.

Die Serumproben wurden prä- und intraoperativ entnommen. Die Serumspiegel von MIF, CXCL12 und CXCL8 zeigten einen signifikanten intraoperativen Anstieg im Vergleich zu den Ausgangswerten. Im Gegensatz dazu zeigten die VEGF-Konzentrationen keine signifikanten Veränderungen.

Ein ex vivo Migrationsassay mit Serumproben, die vor und während der Operation entnommen wurden, wurde mit EPCs durchgeführt, die von gesunden Probanden isoliert wurden, und zeigte eine signifikant erhöhte Migrationsrate zu den intraoperativ entnommenen Proben. Mit dieser Technik können mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut leicht isoliert werden, um zusätzliche entzündungsbezogene Fragen zu beantworten.