Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Richtung des primitiven oder definitiven hämatopoetischen Programms mithilfe eines stadienspezifischen Ansatzes zur Signalmanipulation zu steuern. Diese Methode kann zahlreiche zentrale Fragen auf diesem Forschungsgebiet beantworten, beispielsweise das Verständnis der Signal- und transkriptionellen Regulatoren der menschlichen definitiven Hämatopoese. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine sofortige stadienspezifische Manipulation ermöglicht.

Carissa Dege, eine Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Um mit dem Protokoll zu beginnen, beschaffen Sie zuvor hergestellte humane pluripotente Stammzelllinien oder HPSCs, die auf embryonalen Mausfibroblasten oder MEFs in einem Inkubator bei 37 °C mit fünf Prozent CO2 bis zu einer Konfluenz von 70 % bis 80 % kultiviert wurden. Aspirieren Sie das HPSC-Medium und geben Sie je nach Vertiefung ein Milliliter 37 °C warmes 0,25 %iges Trypsin-EDTA für eine Minute hinzu.

Nach einer Minute das Trypsin abpipettieren und je ein Milliliter Stammmedium in jede Vertiefung geben. Mit einem Zellabstreifer die Zellen von der Platte abkratzen. Anschließend je ein Milliliter Waschpuffer in jede Vertiefung hinzufügen.

Mit einer zwei Milliliter fassenden serologischen Pipette die Zellen drei bis fünfmal auf- und abpipettieren, um große Klumpen aufzubrechen. Anschließend die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die HPSCs bei 330 × g fünf Minuten lang zentrifugieren.

Nach dem Zentrifugieren fügen Sie das HPSC-Medium hinzu und resuspendieren die Zellen. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter der resuspendierten HPSCs in jede Vertiefung des MAT-kodierten Kunststoffmaterials hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Nach 24 Stunden saugen Sie das Medium ab und ersetzen es für eine Minute durch 37-Grad-Celsius-0,05-%-Trypsin-EDTA.

Den Trypsin-EDTA vorsichtig abpipettieren. Ein Milliliter Stammmedium zugeben und die Zellen kräftig mit einem Zellabstreifer abkratzen. Anschließend ein Milliliter Waschmedium zugeben.

Mit einer zwei Milliliter umfassenden serologischen Pipette die Zellen dreimal triturieren und in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Zellen bei 220 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Anschließend das Medium abpipettieren, 20 Milliliter Waschmedium hinzufügen und die Zellen vorsichtig mit einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette erneut suspendieren.

Nach der Zentrifugation und dem Absaugen vorsichtig die Embryoidkörper oder EBs in dem Medium vom Tag Null erneut suspendieren. Mit einer 10-mL-Serologiepipette je zwei Milliliter Differenzierungsmedium, das die EBs enthält, in jede Vertiefung einer 6-Loch-Zellkulturschale mit niedriger Haftung geben. Die EBs in einen Multigasinkubator mit 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 stellen.

Vierundzwanzig Stunden später zwei Milliliter Day-One-Medien hinzufügen. Die Zellen über Nacht in einem Multigasinkubator inkubieren. Nach 18 Stunden die EBs vorsichtig mit einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette gewinnen und fünf Minuten lang bei 100 × g zentrifugieren.

Waschen und kombinieren Sie die gesamte Kultur mit zehn Milliliter Iscove’s modifiziertem Dulbecco-Medium oder IMDM. Nachdem die Kultur erneut fünf Minuten bei 100 × g zentrifugiert wurde, um Ablagerungen zu entfernen, aspirations das Medium. Resuspendieren Sie die EBs vorsichtig mit dem Medium vom Tag Zwei unter Verwendung einer P1000-Pipette.

Anschießend zwei Milliliter der EBs pro Vertiefung in sechswellige Zellkulturplatten mit niedriger Adhärenz abfüllen. Drei Mikromolar CHIR99021 oder IWP2 hinzufügen, um definitive bzw. primitive hämatopoetische Vorläuferzellen zu spezifizieren. Die Platte 30 Stunden lang in einem Multigas-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach 30 Stunden die EBs mit einer zwei-Milliliter-Serologischen Pipette isolieren, indem sie in ein 50-Milliliter-Konisch gefälsches Rohr überführt und fünf Minuten lang bei 330 × g zentrifugiert werden. Die EBs vorsichtig resuspendieren und mit 10 Milliliter IMDM waschen. Die EBs in Tag-3-Medium resuspendieren und je zwei Milliliter in jede Vertiefung von Low-Adherence-Sechswell-Platten geben.

Die Zellen 72 Stunden lang in einem Multigas-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach 72 Stunden Inkubation zwei Milliliter Day-Six-Medium in jede Vertiefung geben. Anschließend die Embryoidkörper (EBs) weitere 48 Stunden in einem Multigas-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Isolieren Sie die mit CHIR99021 behandelten EBs am achten Tag der Differenzierung und fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort. Zentrifugieren Sie die EBs bei 330 x G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA zu den EBs hinzu. Vortexen Sie die EBs fünf Sekunden lang und inkubieren Sie sie für acht Minuten in einem Wasserbad bei 37 °C. Danach geben Sie fünf Milliliter Stopplösung hinzu und zentrifugieren die EBs.

Anschließend den Überstand abpipettieren. Die Embryoidkörperchen in fünf Milliliter Kollagenase II resuspendieren. Das Röhrchen fünf Sekunden lang verwirbeln und anschließend die Embryoidkörperchen in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Nach 60 Minuten die Embryoidkörperchen fünf Sekunden lang verwirbeln und fünf Milliliter Stopplösung hinzufügen.

Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer resuspendieren. Die Zellen durch einen 40-Mikron-Zellfilter geben, um nicht dissoziierte Zellklumpen zu entfernen. Danach mit der Antikörperfärbung und der FACS-Isolierung von CD34-positiven hämogenen endothelialen Vorläuferzellen fortfahren.

Nach der FACS-Isolierung die Zellen in HE-Medien resuspendieren. Die Zellen in 50-Mikroliter-Aliquoten in einer 96-Well-Kulturplatte mit geringer Haftung verteilen und die Zellen anschließend über Nacht inkubieren. Am nächsten Morgen sollten sich die hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Zellhaufen aus sechs bis zehn Zellen aggregiert haben.

Übertragen Sie vorsichtig die 50-µL-Volumina der reaggregierten Zellen in die Mitte einer 24-Loch-MAT-kodierten Platte. Stellen Sie die Platte vorsichtig in den Multigas-Inkubator und inkubieren Sie vier bis sechs Stunden lang, bis sich die Zellen angeheftet haben. Nach vier bis sechs Stunden, um die Anheftung der Zellen zu ermöglichen, geben Sie langsam je ein Milliliter frisch zubereitetes HE-Medium in jedes Loch.

Inkubieren Sie die Zellen im Multigas-Inkubator, bis die hämatopoetischen Zellen sichtbar sind. Danach gewinnen Sie die definitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen, indem Sie das HE-Medium vorsichtig von den Zellen entfernen und es durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb laufen lassen, um den Durchlauf zu sammeln. Für die verbleibenden anhaftenden Zellen geben Sie 0,5 Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA zu den Zellen hinzu und inkubieren sie fünf Minuten lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator.

Nach der Trypsinierung 0,5 Milliliter Stop-Lösung zu jedem Well hinzufügen. Die Zellen durch denselben 40-Mikrometer-Zellfilter pipettieren, um alle adhärenten und nicht-adhärenten Zellen zu sammeln, und die Zellen zentrifugieren. 2.000 bis 10.000 mittels FACS isolierte Zellen in ein Well der OP9 DL4-Zellen in OP9-Medium geben.

Inkubieren Sie im Brutschrank bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Um die Zellen alle vier bis fünf Tage zu passagieren, resuspendieren Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Filtern Sie durch einen 40-Mikrometer-Filter, um Zellklumpen zu entfernen.

Nach der Zentrifugation das Medium abpipettieren. Die Zellen in zwei Milliliter frischem T-Zell-Medium resuspendieren und auf frische OP9 DL4-Zellen übertragen. Nach mindestens 21 Tagen Kultur bei niedriger Temperatur die Zellen kräftig pipettieren und durch einen 40-Mikrometer-Filter geben, um Zelltrümmer zu entfernen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 330 × g und aspirieren Sie den Überstand. Fahren Sie dann mit der Standard-Durchflusszytometrie fort. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass die Differenzierungskulturen, die mit IWP2 behandelt wurden, eine deutliche Population von CD34-positiven, CD43-negativen sowie CD34-schwach-positiven und CD43-positiven Zellen aufweisen. Im Gegensatz dazu enthalten die mit CHIR behandelten Differenzierungskulturen am achten Tag der Differenzierung weniger als 1 % CD43-positiver Zellen.

Ursprüngliche hämatopoetische Vorläuferzellen, die unter IWP2-Bedingungen gewonnen und am neunten Tag isoliert wurden, bilden in Methylcellulose-Assays vorwiegend primitive erythroide und myeloide Vorläuferzellen. Die aus der CHIR99021-Behandlung stammende CD34-positive, CD43-negative Population ist eine heterogene Population, die endotheliale Vorläuferzellen sowie CD34-positive, CD43-negative, CD73-negative, CD184-negative hämogene Endothelzellen enthält. Wird diese Population mittels FACS isoliert, bildet sie zunächst eine monolayerartige Schicht endothelähnlicher Zellen, die anschließend einen endothelialen-zu-hämatopoetischen Übergang durchlaufen und zu runden, lichtbrechenden, nicht-anklebenden hämatopoetischen Zellen führen. Diese hämatopoetischen Zellen können mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von CD34 und CD45 untersucht werden.

Aus den EHT-Assays isolierte hämatopoetische Vorläuferzellen können in Methylcellulose-Assays verwendet werden und bilden große, explosionsartige erythroide Kolonie-bildende Einheiten, kleine erythroide Kolonie-bildende Einheiten sowie myeloische Vorläuferzellen. Diese repräsentativen durchflusszytometrischen Analysen des T-Lymphozyten-Differenzierungspotenzials von CHIR99021-abgeleiteten CD34-positiven, CD43-negativen, CD73-negativen, CD184-negativen hämatopoetischen Vorläufern und von IWP2-abgeleiteten CD34-positiven, CD43-negativen hämatopoetischen Vorläufern zeigen das Vorhandensein einer CD45-positiven, CD56-negativen, CD4-positiven, CD8-positiven Population in den aus CHIR abgeleiteten Vorläufern, was auf das hämatopoetische Potenzial innerhalb der eingesetzten CD34-positiven Population hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane pluripotente Stammzellen in primitive oder definitive Mengen hämatopoetischer Vorläuferzellen differenziert werden können.