Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Richtung des primitiven oder endgültigen hämatopoetischen Programms zu lenken, wobei ein stufenspezifischer Signalmanipulationsansatz verwendet wird. Diese Methode kann viele Schlüsselfragen auf diesem Gebiet beantworten, wie z. B. das Verständnis der Signal- und Transkriptionsregulatoren der endgültigen Hämatopoese beim Menschen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sofort eine phasenspezifische Manipulation verwendet.

Carissa Dege, Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Um das Protokoll zu beginnen, erhalten Sie zuvor vorbereitete humane pluripotente Stammzelllinien oder HPSCs, die auf embryonalen Faserblasten oder MEFs der Maus gezüchtet wurden, in einem 37-Grad-Inkubator mit fünf Prozent CO2 auf 70 % bis 80 % Konfluenz. Aspirieren Sie das HPSC-Medium und fügen Sie einen Milliliter 37 Grad Celsius 0,25 % Trypsin-EDTA für eine Minute in jede Vertiefung hinzu.

Nach einer Minute aspirieren Sie das Trypsin und geben Sie einen Milliliter Stammmedium in jede Vertiefung. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber von der Platte. Geben Sie dann einen Milliliter Waschpuffer in jede Vertiefung

Zerreiben Sie die Zellen mit einer serologischen Zwei-Milliliter-Pipette drei- bis fünfmal, um große Klumpen aufzubrechen. Und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Die HPSC werden fünf Minuten lang bei 330 x G zentrifugiert.

Fügen Sie nach dem Schleudern HPSC-Medien hinzu und suspendieren Sie die Zellen erneut. Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter resuspendierte HPSCs in jede Vertiefung der MAT-codierten Kunststoffe und inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Aspirieren Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen Sie es eine Minute lang durch 37 Grad Celsius 0,05 % Trypsin EDTA.

Aspirieren Sie das Trypsin EDTA. Geben Sie einen Milliliter Stammmedium hinzu und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber kräftig ab. Füge dann einen Milliliter Waschmedium hinzu.

Mit einer serologischen Zwei-Milliliter-Pipette werden die Zellen dreimal verdreifacht und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 220 x G. Aspirieren Sie dann das Medium, fügen Sie 20 Milliliter Waschmedium hinzu und verwenden Sie eine serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren.

Nach der Zentrifugation und Aspiration werden die Embryoidkörper oder EBs in Day Zero-Medien vorsichtig wieder suspendiert. Geben Sie zwei Milliliter Differenzierungsmedien, die EBs enthalten, mit einer serologischen Zehn-Milliliter-Pipette in jede Vertiefung einer Zellkulturschale mit sechs Vertiefungen und geringer Adhärenz. Platzieren Sie die EBs in einem 37 Grad Celsius heißen Multigas-Inkubator mit fünf Prozent CO2 und fünf Prozent O2.

Vierundzwanzig Stunden später fügen Sie zwei Milliliter Day One-Medien hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Multigas-Inkubator. Ernten Sie die EBs nach 18 Stunden vorsichtig mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 100 x G.

Waschen und kombinieren Sie die gesamte Kultur mit zehn Millilitern Iscove's Modified Dulbecco Medium oder IMDM. Nachdem Sie die Kultur erneut fünf Minuten lang bei 100 x G gedreht haben, um Rückstände zu entfernen, saugen Sie das Medium an. Suspendieren Sie die EBs vorsichtig wieder mit Day Two Medium und verwenden Sie eine P1000-Pipette.

Geben Sie dann zwei Milliliter der EBs pro Vertiefung in sechs Vertiefungen mit geringer Adhärenz in Zellkulturplatten ab. Fügen Sie drei mikromolare CHIR99021 oder IWP2 hinzu, um definitive bzw. primitive hämatopoetische Vorläuferzellen zu spezifizieren. Inkubieren Sie die Platte 30 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Multigas-Inkubator.

Isolieren Sie die EBs nach 30 Stunden mit einer serologischen Zwei-Milliliter-Pipette, indem Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 330 x G zentrifugieren. Suspendieren Sie die EBs vorsichtig wieder und waschen Sie sie mit 10 Millilitern IMDM. Suspendieren Sie die EBs in Day Three Media erneut und geben Sie zwei Milliliter in jede Vertiefung von Sechs-Well-Platten mit geringer Adhärenz.

Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Multigas-Inkubator. Geben Sie nach 72 Stunden Inkubation zwei Milliliter Day Six Media in jede Vertiefung. Dann inkubieren Sie die EBs für weitere 48 Stunden in einem 37 Grad Celsius heißen Multigas-Inkubator.

Isolieren Sie die CHIR99021 behandelten EBs am achten Tag der Differenzierung und fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort. Zentrifugieren Sie die EBs fünf Minuten lang bei 330 x G. Aspirieren Sie den Überstand.

Fügen Sie als nächstes zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA zu den EBs hinzu. Wirbeln Sie die EBs fünf Sekunden lang vor und inkubieren Sie die EBs acht Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Geben Sie dann fünf Milliliter Stopplösung hinzu und zentrifugieren Sie die EBs.

Aspirieren Sie dann den Überstand. Suspendieren Sie die EBs wieder in fünf Millilitern Kollagenase II. Wirbeln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang vor und inkubieren Sie die EBs dann in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Nach 60 Minuten die EBs fünf Sekunden lang vortexen und fünf Milliliter Stopplösung hinzufügen.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer wieder suspendiert. Führen Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um undissoziierte Zellklumpen zu entfernen. Fahren Sie mit der Antikörpermarkierung und der FACS-Isolierung von CD34-positiven hämogenen endothelialen Vorläuferzellen fort.

Nach der FACS-Isolierung resuspendieren Sie die Zellen in HE-Medien. Verteilen Sie die Zellen in 50-Mikroliter-Aliquoten in einer 96-Well-Kulturplatte mit geringer Adhärenz und inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht. Am nächsten Morgen sollten sich die hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Klumpen von sechs bis zehn Zellen zusammenballen.

Übertragen Sie die 50-Miroliter-Volumina der reaggregierten Zellen vorsichtig in die Mitte einer 24-Well-MAT-codierten Platte. Legen Sie die Platte vorsichtig für vier bis sechs Stunden in den Multigas-Inkubator, bis die Zellen befestigt sind. Nach vier bis sechs Stunden geben Sie langsam einen Milliliter frisch zubereitetes HE-Medium in jede Vertiefung, damit sich die Zellen anheften können.

Inkubieren Sie die Zellen im Multigas-Inkubator, bis die hämatopoetischen Zellen sichtbar sind. Als nächstes ernten Sie die endgültigen hämatopoetischen Vorläuferzellen, indem Sie das HE-Medium vorsichtig aus den Zellen entfernen und durch ein 40-Mikron-Zellsieb leiten, um den Durchfluss zu sammeln. Für die restlichen adhärenten Zellen geben Sie 0,5 Milliliter 0,25%Trypsin EDTA zu den Zellen und inkubieren sie fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Geben Sie nach der Trypsinisierung 0,5 Milliliter Stopplösung in jede Vertiefung. Führen Sie die Zellen durch dasselbe 40-Mikron-Zellsieb, um alle adhärenten und nicht adhärenten Zellen zu poolen und die Zellen zu drehen. Geben Sie 2.000 bis 10.000 isolierte FACS-Zellen in eine Vertiefung der OP9 DL4-Zellen in OP9-Medien.

Inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2. Um die Zellen alle vier bis fünf Tage zu passieren, zerreiben Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Passieren Sie einen 40-Mikron-Filter, um Klumpen zu entfernen.

Nach dem Zentrifugieren das Medium ansaugen. Suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern frischem T-Zell-Medium und legen Sie sie auf frische OP9 DL4-Zellen. Nach mindestens 21 Tagen Kaltkultur zerreiben Sie die Zellen kräftig und passieren einen 40-Mikron-Filter, um Zelltrümmer zu entfernen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 330 x G, aspirieren Sie den Überstand und fahren Sie dann mit der Standard-Durchflusszytometrie fort. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass IWP2-behandelte Differenzierungskulturen eine ausgeprägte CD34-positive, CD43-negative und CD34-niedrige CD43-positive Population ergeben. Während CHIR-behandelte Differenzierungskulturen am achten Tag der Differenzierung weniger als 1%CD43-positive Zellen aufweisen.

Primitive hämatopoetische Vorläuferzellen, die unter IWP2-Bedingungen gewonnen und am neunten Tag isoliert wurden, führen in den Methylcellulose-Assays zu überwiegend primitiven erythroiden und myeloischen Vorläuferzellen. Die CD34-positive CD43-negative Population, die aus der CHIR99021 Behandlung abgeleitet wurde, ist eine heterogene Population, die sowohl endotheliale Vorläuferzellen als auch CD34-positive, CD43-negative, CD73-negative, CD184-negative hämogene Endothel enthält, die, wenn sie durch FACS isoliert werden, zunächst eine Monoschicht aus endothelähnlichen Zellen bilden, die dann einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang durchlaufen, der zu runden, refraktilen, nicht adhärente hämatopoetische Zellen. Diese hämatopoetischen Zellen können mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von CD34 und CD45 untersucht werden.

Hämatopoetische Vorläuferzellen, die aus den EHT-Assays isoliert wurden, können in Methylcellulose-Assays verwendet werden und führen zu großen, burstartigen, erythroiden koloniebildenden Einheiten, kleinen erythroiden koloniebildenden Einheiten und myeloischen Vorläuferzellen. Diese repräsentativen durchflusszytometrischen Analysen des T-Lymphozyten-Assay-Potentials von CHIR99021-abgeleiteten CD34-positiven, CD43-negativen, CD73-negativen, CD184-negativen hämatopoetischen Vorläuferzellen und IWP2-abgeleiteten CD34-positiven, CD43-negativen hämatopoetischen Vorläuferzellen zeigen das Vorhandensein einer CD45-positiven, CD56-negativen, CD4-positiven, CD8-positiven Population in CHIR-abgeleiteten Vorläuferzellen, was auf das hämatopoetische Potenzial innerhalb der CD34-positiven Eingangspopulation hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche pluripotente Stammzellen in Bezug auf primitive oder definitive Mengen an hämatopoetischen Vorläuferzellen unterscheidet.