Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Das übergeordnete Ziel dieses floreszenzbasierten Lymphozyten-Assays ist die Identifizierung neuer niedermolekularer Immunmodulatoren. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie über den Mechanismus der Aktivierung und Hemmung von Lymphozyten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser phänotypischen Funktion und dieses Assays besteht darin, dass es für die Wirkstoffforschung angepasst werden kann.

Verfahren wird von Ahmed Fouda, einem Doktoranden unseres Labors, vorgeführt. Desinfizieren Sie unter einer sterilen Arbeitshaube das Fell einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen Nurr77 GFP-Maus mit 70 % Ethanol und legen Sie das Tier auf die rechte Seite. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt in der Haut und den Muskeln des oberen linken Bauchquadranten, lokalisieren und entfernen Sie die Milz, indem Sie das Gewebe in Splenozytenmedium auf Eis legen.

Wenn alle Milz entnommen wurde, geben Sie das Gewebe in eine 10 Zentimeter große quadratische Zellkulturschale mit fünf Millilitern vorgewärmtem Splenozytenmedium und zerdrücken Sie das Gewebe mit einem sterilen Spritzenkolben, bis die Lösung trüb ist. Nach ausgiebigem Einmaischen in Splenozytenmedium filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um alle Ablagerungen zu entfernen, und zentrifugieren Sie die resultierende Einzelzellsuspension. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei bis drei Millilitern Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen und tränken Sie die Reaktion nach 20 bis 30 Sekunden mit fünf Millilitern RPMI oder einem anderen geeigneten Puffer.

Sammeln Sie dann die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Splenozytenmedium für die Zellzählung. Um die T-Zellen zu isolieren, zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in serumfreiem RPMI-Medium in einer Konzentration von eins mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und legen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot an Splenozyten beiseite, um es später für die Reinheitsbewertung zu verwenden.

Als nächstes fügen Sie den Zellen 50 Mikroliter pro Milliliter normales Rattenserum hinzu, gefolgt von der Zugabe von 50 Mikrolitern pro Milliliter T-Zell-Isolations-Antikörpercocktail unter sanftem Mischen. Nach 10 Minuten inkubieren Sie die Zellen zweieinhalb Minuten lang mit Streptavidin-konjugierten magnetischen Kügelchen. Geben Sie dann freies Serummedium zu den Zellen für ein Endvolumen von zweieinhalb Millilitern und legen Sie das Röhrchen drei Minuten lang in einen Zellisolationsmagneten.

Am Ende der Inkubation halten Sie das Röhrchen im Magneten und gießen Sie den Überstand in einer Bewegung in ein neues Styroporröhrchen. Anschließend können die T-Zellen gezählt werden. T-Zellen werden in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden in einer Konzentration von 2,5 mal 10 bis zur fünften Zelle pro Well gesät, die 200 Mikroliter frisches Splenozytenmedium pro Well enthält.

Geben Sie rekombinante Interleukin-7- und CD3/CD28-Magnetbeads in die entsprechenden Wells und legen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator. 12 Stunden später verreiben Sie die Zellsuspension in jeder Vertiefung vorsichtig, um alle Kügelchenzellaggregate aufzubrechen. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionen aus jeder Vertiefung in einzelne Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen.

Wenn alle Zellen gesammelt wurden, legen Sie jedes Röhrchen mit den Zellen jeweils fünf Minuten lang in den Trennmagneten und dekantieren Sie die Überstände, wenn sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, am Ende jeder Inkubation in neue Polystyrolröhrchen. Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in frischem Splenozytenmedium in zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Für das Hochdurchsatz-Screening kleiner Moleküle werden 40 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in einer 384-Well-Platte plattiert und die entsprechenden Vertiefungen mit dem Medikament oder Vehikel Ihrer Wahl für den gewünschten Behandlungszeitraum im Zellkultur-Inkubator behandelt.

30 Minuten vor der GFP-Analyse die Zellen mit der entsprechenden Konzentration der Hoechst-Lösung färben und den Fleck durch schonendes Pipettieren gründlich verteilen. Wenn alle Vertiefungen gefärbt sind, zentrifugieren Sie die Platten, um die Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln, und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Stellen Sie dann das Ziel auf das 40-fache oder höher ein. Stellen Sie Kamera Nummer vier für die UV-Lampe und dann Kamera Nummer eins für Laser 488 ein. Legen Sie die Platte in das High-Content-Screening-System ein.

Stellen Sie als Nächstes das automatisierte konfokale High-Content-Screening-System so ein, dass es sechs bis 10 Felder pro Vertiefung mit zwei aufeinanderfolgenden Messwerten pro Feld bei 488 Nanometern und UV-Licht ablestet. CD3-positive T-Zellen repräsentieren etwa 30 % der Milz einer Maus und weisen eine basale GFP-Expression von 10 % auf. Nach Stimulation von CD3/CD28-T-Zell-Rezeptor-Kügelchen wird eine fünf- bis sechsfache Erhöhung des Prozentsatzes der GFP-Expression beobachtet.

Ebenso machen CD19-positive B-Zellen 50 bis 55% der gesamten Splenozyten aus, wobei die basale GFP-Expression der von nicht aktivierten T-Zellen ähnelt. Interessanterweise löst die Stimulation von B-Zell-Rezeptoren mit Anti-Maus-IgG, IgM und rekombinantem CD40L nur einen geringfügigen Anstieg der GFP-Expression aus. Nach der Isolierung von magnetischen Kügelchen, wie sie gerade gezeigt wurde, zeigen die isolierten CD3-positiven T-Zellen immer noch eine 10%ige basale GFP-Expression.

Die Stimulation von CD3/CD28-Kügelchen induziert jedoch eine signifikante Hochregulierung der GFP-Antwort. In ähnlicher Weise weisen die gereinigten aktivierten B-Zellen nach der Isolierung von B-Zell-Magnetbeads eine höhere Expression von GFP auf als aktivierte B-Zellen in Splenozyten. In diesem repräsentativen Experiment zeigte das primäre Hochdurchsatz-Screening von 4398 Verbindungen mehrere Aktivatoren und Inhibitoren der T-Zell-Aktivierung.

Die beobachtete GFP-Expression der stimulierten T-Zellen war jedoch 20-mal höher als die für die unstimulierten T-Zellen. Dies ermöglicht die Erzeugung eines Aktionsfensters, in dem die GFP-hemmenden Verbindungen leicht nachgewiesen werden können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 36 bis 48 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen nach jedem Schritt zu zählen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie ELISA oder Western Blotting durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten. Diese Technik wird den Weg für die Wirkstoffforschung zur Immunmodulation bei Nagetieren ebnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man T- oder B-Zellen isoliert und aktiviert, die aus den Nurr77 GFP-Mausplatten gewonnen wurden.