Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

Das übergeordnete Ziel dieser Lokalfeld-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebungstechnik besteht darin, mit molekularen Sonden den intrazellulären Kalziumspiegel oder Membranpotentiale aus Herzregionen zu messen, die auf gesamter Herzebene schwer zugänglich sind. Diese Methode kann uns helfen, wichtige kardiovaskuläre Fragen im Zusammenhang mit Herzstillstand und Ischämie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die kardialen Eigenschaften anhand zellulärer Ereignisse im intakten Organ gemessen werden, wo die Zellen weiterhin elektrisch, mechanisch und metabolisch gekoppelt sind.

Bereiten Sie zunächst das horizontale Langendorff-Gerät vor. Laden Sie die frisch zubereitete Tyrode-Lösung in die 60-Milliliter-Spritzen und fügen Sie alle zugehörigen Schläuche des Setups hinzu. Beseitigen Sie nach dem Befüllen alle Luftblasen.

Äquilibrieren Sie dann die geladene Lösung mit reinem Sauerstoffgas, das von einem untergetauchten Kunststoff-Ausströmerstein geliefert wird. Legen Sie anschließend eine nicht resorbierbare chirurgische Naht um eine Nadel. Dies dient als Kanüle für die Retroperfusion des Herzens, wenn es an das Gerät angeschlossen wird.

Als nächstes entnehmen Sie das Herz, nachdem Sie Heparin injiziert und das Tier eingeschläfert haben. Reinigen Sie zuerst die Brust mit Ethanol. Die Demonstration ist mit einer Maus, aber das gleiche Verfahren funktioniert für die Entnahme von Sittichherzen.

Machen Sie dann mit einer Präparierschere einen Schnitt in den Unterbauch und schneiden Sie dann die Seiten zum Hals hin auf. Schneiden Sie dann vorsichtig das Zwerchfell auf und vermeiden Sie dabei das Herz. Ziehen Sie nun das abgeschnittene Taschentuch zurück und stecken Sie es fest.

Entfernen Sie als Nächstes die Lunge und das umgebende Gewebe, um das Herz freizulegen. Sobald es freigelegt ist, verwende eine Pinzette, um das Herz herauszuschöpfen, ohne es zusammenzudrücken. Löse sie vom Tier, indem du die Aorta durchtrennst, und lasse so viel Aorta wie möglich am Herzen befestigt.

Laden Sie dann das Herz mit einem Milliliter Tyrode-Lösung in ein kleines Waagscherchen. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop mit Pinzette und Schere schnell das Blut und das Fettgewebe, das das Herz umgibt. Befestigen Sie die Aorta mit einer nicht resorbierbaren chirurgischen Naht und einer Nadel an der horizontalen Verbindung des Langendorff-Geräts.

Fixiere den Knoten mit zwei feinen Pinzetten. Beginne dann die Retroperfusion, indem du das Ventil öffnest, um die Tyrode-Lösung freizusetzen. Reinigen Sie das umgebende Gewebe und saugen Sie Schmutz ab, um die horizontale Kammer sauber zu halten, während sich das Herz 10 Minuten lang stabilisiert.

Mach die Farbe frisch. Für Rhod-2 AM fügen Sie 20 Mikroliter 20 % Pluronic und DMSO zur 50-Mikrogramm-Farbstoffpackung des Herstellers hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren, dabei Blasen vermeiden.

Übertragen Sie dann den verflüssigten Farbstoff in ein durchsichtiges Glasfläschchen und fügen Sie einen Milliliter Tyrode-Lösung hinzu. Lösen Sie den Farbstoff in dieser Mischung gründlich mit 15 bis 20 Minuten Ultraschall auf. Anschließend perfundieren Sie den vorbereiteten Farbstoff mit einer Schlauchpumpe bei Raumtemperatur.

Laden Sie zuerst den Farbstoff in die Färbekammer und klemmen Sie dann alle mit dem Verteiler verbundenen Schlauchleitungen fest und halten Sie die Klemmen über dem Verteiler, um einen Rückfluss zu verhindern. Schalten Sie anschließend die Pumpe ein und schließen Sie sofort das Dreiwegeventil unter der 60-Milliliter-Spritze. Positioniere das kleine Röhrchen, das am Saugende der Pumpe befestigt ist, neben dem Herzen, um den Farbstoff nach der Perfusion wieder zirkulieren zu lassen.

Nimm eine kleine Nadel und klemme sie durch den Apex, um den Druck zu verringern. Lassen Sie dann das Herz 30 Minuten lang mit Farbstoff durchbluten. Während dieser Zeit ist es sehr wichtig, den Gehalt des Farbstoffs zu bewerten, damit keine Blasen in das Gewebe gelangen, die zu Ischämie und Gewebeschäden führen würden.

Nach der Perfusion des Farbstoffs das Herz mit Tyrode-Lösung retroperfundieren. Entfernen Sie die Klemme über dem Verteiler. Öffnen Sie die Klappe und lassen Sie das Herz 10 Minuten lang stabilisieren.

Füllen Sie während der Retroperfusion die horizontale Kammer mit Tyrode-Lösung und schalten Sie die Peltier-Einheit ein, um die Badtemperatur auf 37 Grad Celsius zu bringen. Um das faseroptische Licht für das Experiment vorzubereiten, legen Sie zunächst die faseroptische Leuchte in eine zwei Milliliter-Pipette. Befestigen Sie dann die Pipette an einem Mikromanipulator.

Drücken Sie mit dem Mikromanipulator die Faseroptik leicht gegen die Oberfläche des Seitenventrikels. Programmieren Sie als Nächstes einen Wellengenerator, der einen Rechteckimpuls mit einer Breite von einer Millisekunde liefert. Und stellen Sie einen Herzstimulator ein, der extern synchronisiert und mit dem Wellengenerator verbunden ist.

Befestigen Sie an jedem der beiden Stimulatorausgänge einen Draht mit einer Akupunkturnadel, die am Ende gelötet ist. Befestigen Sie zwei Akupunkturnadeln im Abstand von etwa drei Millimetern an der Herzscheibe. Erst wenn die Nadeln platziert sind, starten Sie den Stimulator, um versehentliche Stöße zu vermeiden.

Um nun das Epikardsignal aufzuzeichnen, stellen Sie die Erfassungsfrequenz in der Software auf 10 Kilohertz ein. Um das endokardiale Signal zu erfassen, gehen Sie auf die gleiche Weise vor, aber stechen Sie mit einer 23-Gauge-Nadel ein Loch in den Seitenventrikel in der Nähe des Septums. Und dann positionieren Sie mit einem Mikromanipulator die zweite Faseroptik in das Endokard.

Um eine transmurale Funktion zu erhalten, wurde die Morphologie der Aktionspotentiale verglichen, die aus dem Endokard und dem Epikard aufgezeichnet wurden. Fluoreszenzaufnahmen wurden nach Behandlung des Herzens mit di-8-ANEPPS unter Verwendung der CLFFM-Technik gemacht. Das Aktionspotenzial war im Endokard langsamer, insbesondere in Phase eins.

Die Dauer des Aktionspotentials wurde als die Zeit beschrieben, die es benötigt, bis das Aktionspotential bis zu einem gewissen Grad repolarisiert ist. Wenn die Dauern normalisiert und so verschoben wurden, dass sie sich in der Nullphase überlappen, konnten sie verglichen werden. In der ersten Phase gab es tatsächlich einen signifikanten Unterschied.

Als nächstes wurde Rhod-2 AM zur Überwachung des intrazellulären Kalziums verwendet. Um regionale Unterschiede im intrazellulären Calcium vergleichen zu können, wurde die Kinetik der Calciumtransienz untersucht. Zum Vergleich: Die Zeit bis zum Höhepunkt der Vergänglichkeit war im Endokard etwa zwei Millisekunden länger.

Insgesamt wies die Calciumtransienz aus dem Endokard eine signifikant langsamere Kinetik auf als die des Epikards. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um die intrazelluläre Kalziumtransienz und Aktionspotentiale in schwer zugänglichen Regionen des Herzens aufzuzeichnen. Der Langendorff-Teil des Aufbaus macht es sehr praktisch, verschiedene Chemikalien in das Herz zu perfundierten und die Auswirkungen auf die kardialen Eigenschaften zu beurteilen.