Name: Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie lokale Feldfluoreszenzmikroskopie intrazelluläres Calcium und Membranpotenziale in intakten Herzen misst. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardiovaskulärer Ereignisse wie Herzstillstand und Ischämie.

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Wir danken Dr. Alicia Mattiazzi für kritische Diskussion der vorliegenden Arbeit. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIH (R01 HL-084487) zu ALE unterstützt.

Dieses Protokoll und alle Mäuse Behandlung wurde von der UC Merced Institutional Animal Care und Use Committee (Nr 2008-201) zugelassen. Experimente mit Sittiche wurden im Jahr 1999 nach den allgemeinen Richtlinien für die Nutzung von Tieren festgelegt von der wissenschaftlichen Kommission des venezolanischen Institut für wissenschaftliche Forschung (IVIC) durchgeführt. 1. Langendorff-Set Up Vorbereitung <ol><li> Bereiten Tyrode - Lösung die folgenden Konzentrationen an gelöstem Stoff in mM enthält: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 Glucose, 10 HEPES. Der pH-Wert der Tyrode-Lösung auf 7,4 mit NaOH und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter. </li><li> Laden Sie die Tyrode - Lösung in die 60 ml Spritzen und alle Schläuche des horizontalen Langendorff - Set-up 11, 12 in 4 dargestellt ist . Stellen Sie sicher, alle Luftblasen zu entfernen. </li><li><strong&gt; Äquilibrieren Tyrode - Lösung mit 100% O 2 ein unter Wasser Kunststoff &quot;Luft Stein&quot; , wie in Abbildung 4 dargestellt. <ol><li> Verbinden Kunststoffschlauch mit einem O 2 -Tank. </li><li> Fügen Sie einen Kunststoff-T-Adapter mit einem 5 &quot;Rohr in die Tyrode-Lösung in der 60-ml-Spritze zu senken. </li><li> Bringen Sie einen Kunststoff - Ausströmer bis zum Ende des 5 &quot;Röhre so O 2 perlt in die Tyrode - Lösung. </li></ol></li><li> Legen Sie ein nicht resorbierbares chirurgisches Naht um eine Nadel als eine Kanüle eingesetzt. Die Nadel wird mit dem Verteiler gekoppelt ist (siehe 4) , die retro-Perfusion mit verschiedenen Lösungen ermöglicht. Schließlich wird das Herz der Aorta in die Nadel eine Kanüle eingeführt werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere und Herz Dissection <ol><li> Wiegen und injizieren Sie die Maus mit Heparin (ex. Maus Gewicht 20 g, injizieren mit 20 Einheiten oder 200 ul) 15 Minuten vor dem durch Genickbruch euthanizing. Anesthetize Sittiche nach to die Nutzung von Tieren Büchern Ihres IACUC Protokoll und dann mit Genickbruch gehen. HINWEIS: Verwenden Sie 8 Wochen alten Mäusen oder 20 g Sittiche. </li><li> Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle nach Euthanasie. Extrahieren parakeet Herzen in genau der gleichen Weise wie für Mäuse beschrieben. <ol><li> Reinigen Sie die Maus Brust mit Ethanol. </li><li> Mit Dissektion Schere, machen einen Einschnitt in den Unterleib und dann zerschnitten, die Seiten in Richtung Hals. </li><li> Ziehen Sie den geschnittenen Gewebes zurück und stecken Sie es nach unten. </li><li> Schneiden Sie die Membran. Seien Sie vorsichtig, wenn die Membran Schneiden zu vermeiden, das Herz schädigen. </li><li> Entfernen der Lungen und des umgebenden Gewebes. </li><li> Verwenden einer Pinzette das Herz ohne zu quetschen zu schöpfen. Schneiden Sie die Aorta so lange wie möglich. </li></ol></li><li> Transportieren Sie das Herz auf einem kleinen wiegen Boot mit etwa 1 ml Tyrode-Lösung. </li><li> Verwendung eines nicht absorbierbaren chirurgischen Naht, binden die Aorta auf die horizontale Langendorff-Vorrichtung über einNadel. Binden Sie das Herz Aorta mit Hilfe von zwei feinen Pinzette. Beginnen retro-Perfusion durch das Ventil in Reihe mit den 60 ml Spritzen enthaltenden Tyrode-Lösung angeordnete Öffnung. </li><li> Lassen Sie das Herz für 10 min zu stabilisieren. Nutzen Sie diese Zeit Blut zu reinigen und das Fettgewebe rund um das Herz vor den Farbstoff zu laden. Ziehen Sie das Fettgewebe in der Nähe der Basis des Herzens mit einer Pinzette und schneiden kleine Dissektion Schere. Seien Sie sicher, dass dies unter der Sicht eines Binokular zu tun. </li></ol> 3. Cytosolic Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Rhod-02.00 <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l der 20% igen Pluronic (ein nichtionisches Tensid) in DMSO auf eine spezielle verpackte Kunststoffröhrchen durch den Farbstoff Herstellers 50 &amp; mgr; g des Farbstoffs enthält. </li><li> Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen. </li><li> Übertragen Sie die gemischte DMSO mit dem nicht-ionischen Tensids und der Farbstoff aus der speziellen Kunststoffröhrchen verpackt, in eine klare Glasampulle. 1 ml Tyrode solution der klaren Glasfläschchen. </li><li> Beschallen für 15-20 min in einem Ultraschallbad. </li><li> Perfundieren den Farbstoff Peristaltikpumpen für 30 min bei Raumtemperatur verwendet wird . <ol><li> Platzieren Sie den Farbstoff in der Farbstoffkammer. </li><li> Verwenden, um eine mechanische Klammer alle anderen Rohrleitungen mit dem Verteiler verbunden zu komprimieren. Die Klemme wird über dem Verteiler platziert. Dies wird jegliche Rückströmung in den zu den 60 ml Spritzen verbunden Schläuche verhindern. </li><li> Schalten Sie die Perfusion peristaltische Pumpe zu beginnen, um den Farbstoff zirkuliert. Unmittelbar in der Nähe des 3-Wege-Ventil unter der 60-ml-Spritze. </li><li> Positionieren ein kleines Rohr, das an der Saug- peristaltische Pumpe neben dem Herzen verbunden ist, um den Farbstoff zu rezirkulieren, die in das Herz perfundiert wurde. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Vorbereitung Mag-Fluo4AM in der gleichen Weise wie Rhod-02.00. Siehe Abschnitt 3 für schrittweise Anweisungen. </li><li> after den Farbstoff Laden, öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit den 60 ml Spritzen enthält Tyrode-Lösung Retro-Perfusion zu beginnen. Achten Sie darauf, die Klammer über dem Verteiler zu entfernen. </li><li> In Tyrode-Lösung in die horizontale Kammer und erwärmen bis zu 37 ° C. </li><li> Retro-perfuse mit Tyrode-Lösung für 45 min die cytosolische Farbstoff zu entfernen. </li></ol> 5. Membranpotentialmessungen: Vorbereitung Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> 5 ml 99% Ethanol zu dem Farbstoff Fläschchen, die 5 mg des Farbstoffes enthält. </li><li> Aliquot 10 ul in 500 Einzel 1 ml Plastikfläschchen, einen Repeater-Pipette. </li><li> Desiccate in einer Geschwindigkeit Vakuum und bei -20 ° C. </li><li> In 20 &amp; mgr; l von 20% Pluronic in DMSO auf eine Plastikflasche mit 10 ug des desiccated Farbstoff. </li><li> Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen. </li><li> Übertragen Sie die Mischung enthaltende DMSO mit Pluronic und Farbstoff aus der Kunststoffröhrchen mit einem Meßzylinder (10 mL). Hinzufügen Tyrode-Lösung auf einen endgültigen volumen von 5 mL. </li><li> Beschallen für 20-25 min in einem Ultraschallbad. </li><li> Perfundieren in das Herz für 30 min unter Verwendung von peristaltischen Pumpen. Siehe schrittweise Anweisungen in Abschnitt 3.5. </li></ol> 6. Aufnahme Epikardiale Signale <ol><li> das Herz mit Tyrode-Lösung Nachdem der Farbstoffbeladung, retro-perfuse durch die Klammer über dem Verteiler entfernen. Öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit der 60 ml Spritze mit Tyrode-Lösung. Retro-perfuse Tyrode-Lösung für 10 Minuten das Herz zu stabilisieren. </li><li> Füllen Sie die horizontale Kammer mit Tyrode-Lösung und schalten Sie das Gerät peltier die Badtemperatur auf 37 ° C zu bringen. </li><li> Positionieren Sie die Lichtwellenleiter auf der Oberfläche des Herzens. <ol><li> Legen Sie die Faseroptik in einem 2-ml-Pipette und befestigen Sie dann die Pipette in einem Mikromanipulator. </li><li> Verwenden der Mikromanipulator leicht die LWL gegen die Oberfläche des LV zu drücken. </li></ol></li><li> Tempo Äußerlich unterscheidet sich der heart mit einem durch einen Wellengenerator gesteuert Stimulator. <ol><li> Programmieren der Wellengenerator ein Rechteckimpuls mit einer Breite von 1 ms bereitzustellen. </li><li> Stellen Sie den Stimulator werden extern synchronisiert und verbinden Sie den externen Eingang zu dem Wellengenerator. </li><li> Zu jedem Ausgang des Stimulators, schließen Sie einen Draht mit einer Akupunktur-Nadel am Ende verlötet. </li><li> Zeigen beide Akupunkturnadeln in der Spitze des Herzens etwa 3 mm voneinander entfernt. </li><li> Erst nachdem die Nadeln in das Gewebe platziert sind, schalten Sie den Ausgang des Stimulators einen elektrischen Schlag zu verhindern. </li></ol></li><li> In der Erfassungssoftware Erfassungsfrequenz bis 10 kHz eingestellt werden. </li></ol> 7. Aufnahme Endocardial Signale <ol><li> Siehe 6.1 und 6.2 zu Schritt das Herz nach dem Laden der Farbstoff zu stabilisieren. </li><li> Mit einem scharfen 23Ga Punkt über die Größe der Faseroptik, machen ein kleines Loch in der Oberfläche des Herzens in der LV in der Nähe des Septum. </li> &lt;li&gt; Legen Sie eine intravitreale Chirurgie Sclerotomie Adapter bei der Positionierung des ersten faseroptischen in das Endokard mit einem Mikromanipulator zu unterstützen. </li><li> Tempo Äußerlich das Herz. Siehe 6.4 zu treten. </li><li> In Erfassungs-Software, Erfassung Frequenz auf 10 kHz einzustellen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier wird bei der Beschreibung der lokalen Feldfluoreszenztechniken zentriert die Funktion von Herzmuskelzellen zu bewerten ex vivo. Die Untersuchung dieser Zellen in einer gekoppelten Umgebung ist nicht nur physiologisch, sondern ist auch sehr geeignet für die Beurteilung der Organebene Pathologien. Die zelluläre Ereignisse elektromechanischen Kopplung (ECC) zugrunde liegen kann mit dem Einsatz von molekularen Sonden auf der ganzen Organebene ausgewertet werden , die 2+ Dynamik intrazellulä...

Das Herz ist das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems. Die Kontraktion des Herzens wird durch eine Erhöhung der intrazellulären initiiert [Ca 2+]. Die Beziehung zwischen der elektrischen Erregbarkeit und Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Freisetzung wurde 1 in enzymatisch dissoziierten Zellen historisch untersucht, 2. Jedoch sind Herzzellen elektrisch, metabolisch und mechanisch gekoppelt 3, 4. Wenn isoliert, sind die Myozyten nicht nur physisch entkoppelt, sondern Myozyten aus verschiedenen Schichten werden während der Dissoziation 5 gemischt. Darüber hinaus , trotz der enormen Vorteile , die aus der Untersuchung von isolierten Zellen unter voltage clamp Bedingungen entstanden sind, 6, 7, 8 die intrinsische Natur des Herzens als elektrischer Syncytium always stellt sich die Frage, wie funktionell verschieden von denen , die in dem Gewebe 3 dissoziierten Zellen. In diesem Manuskript beschreiben wir die in der Erkenntnis der Herzphysiologie erhalten Fortschritte durch die Verwendung von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM) Techniken im intakten Herzens. LFFM nutzt fluoreszierende Indikatoren mehrere physiologische Variablen wie zytosolischen Ca 2+, intra Retikulum (SR) Ca 2+ und Membranpotential zu messen. Diese Messungen können gleichzeitig und in Verbindung mit ventrikulären Druck 9, 10, Elektrokardiogramme 9, elektrische Aktionspotentiale (APs), Ionenstrom - Aufnahmen und Blitzphotolyse von caged Verbindungen 4, 11 erhalten. Darüber hinaus können diese Messungen in der Nähe von Stimulation des intakten Herzens bei höheren Frequenzen erhalten werdenr physiologischen Raten. Obwohl mehrere Artikel 9, 11, 12, 13, haben 14 von unserer Gruppe veröffentlicht LFFM Techniken, die Vermutung der technischen Komplexität mit dieser Technik verbunden hat ihren massiven Einsatz bei der Untersuchung ex vivo physiologischen Erscheinungen in das Herz und andere Organe verhindert. Die LFFM Technik (Figur 1) basiert auf Epifluoreszenz - Messungen unter Verwendung eines Mehrmoden - Lichtwellenleiter in Kontakt mit dem Gewebe erhalten wird . Wie bei jedem Kontakt Fluoreszenz-Imaging-Technik hängt die optische Auflösung von dem Durchmesser und der numerischen Apertur (NA) der Faser. Eine höhere NA und kleinere Durchmesser der Faser wird die räumliche Auflösung der Messungen zu erhöhen. NAs und Faserdurchmessern von 0,22 bis 0,66 und von 50 um bis 1 mm bzw. liegen. Imdie NA Rillen wird das Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) durch die Annahme Photonen verbessern aus einem größeren Raumwinkel ankommt. Um als Epifluoreszenz Vorrichtung zu wirken, wird der Lichtstrahl fokussiert in die optische Faser mit einer asphärischen Linse oder einer Epifluoreszenz Ziel wo die NA der Linse und der Faser übereinstimmen. Diese Anpassung maximiert die Energieübertragung zur Anregung und zum Sammeln der Photonen, die von dem Fluorophor emittiert zurück. Um die exogenen Fluoreszenzindikatoren im Gewebe, verschiedene Lichtquellen und Beleuchtungsarten geladen zu erregen können genutzt werden. Unsere wegweisenden Arbeiten des gepulsten lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie 3, 12 (PLFFM) eingesetzt , um eine Low-Cost - Pikosekunden - Laser (Abbildung 1a, PLFFM) verwendet wird . Diese Art der Lichtquelle hat den großen Vorteil, spannenden einem großen Anteil an Fluorophormoleküle unter dem Bereich Beleuchtung ohne den Farbstoff im wesentlichen Bleichen durchder kurzen Impulsdauern 12. Zusätzlich erlaubt die Verwendung von ultrakurzen Pulsen , die Beurteilung der Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes 12. Die Fluoreszenzlebensdauer ist eine Eigenschaft , die verwendet werden kann , den Anteil von Farbstoffmolekülen an Ca 2+ gebunden zu quantifizieren. Leider ist das zeitliche Zittern der Impulse und Variationen in der Amplitude von Impuls zu Impuls begrenzen die Anwendung dieser experimentellen Strategie zu Fällen, in denen die Veränderung der Fluoreszenz durch den Liganden produziert an den Farbstoff-Bindungs ​​groß. Continuous Wave (CW) Laser sind in der Regel als Hauptbeleuchtungsquelle in LFFM (1b, CLFFM) verwendet. Der Laserstrahl kann kontinuierlich das Gewebe beleuchten, oder ferroelektrisch moduliert werden kann. Die ferroelektrische Modulation des Strahls ermöglicht, die Erzeugung von Mikrolichtimpulse. Diese Modulation kann durch externe Hardware gesteuert werden. Dieser Vorgang ist nicht nur dramatisch reduziert ter zeitliche jittering von Lichtpulsen sondern ermöglicht auch Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen zu mischen. Das Mischen von Strahlen wird durch Multiplexen von Strahlen von verschiedenen Lasern durchgeführt. Als Folge können mehrere Farbstoffe unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen angeregt werden Messungen einer Vielzahl von physiologischen Variablen durchzuführen, beispielsweise Rhod-2 für cytosolische Ca 2+, MagFluo4 für intra-SR Ca 2+ und Di-8-ANEPPS für Membranpotential. Obwohl Laser vorhanden verschiedene Vorteile, wie die Lichtquelle in LFFM, andere Arten von Lichtquellen, einschließlich Leuchtdioden (LEDs) verwendet werden. In diesem Fall bestand die Anregungslichtquelle eines InGaN - LED (1c, PLEDFM). In LEDs werden Photonen spontan emittierten wenn Elektronen aus dem Leitungsband mit Löchern in dem Valenzband rekombinieren. Der Unterschied mit Festkörperlaser ist, dass die Emission nicht von anderen Photonen angeregt wird. Dies resultiert in einer nicht-kohärenten Strahl undeine breitere spektrale Emission für LEDs. Verschiedene Arten von High-Power-LEDs verwendet werden. Für AP - Aufnahmen Di-8-ANEPPS verwenden und für Ca 2+ Transienten aufgezeichnet unter Verwendung von Fluo-4 oder Mag-fluo-4, wir eine LED verwendet , die eine typische Peakemission bei 485 nm (blau) und einer Halbwertsbreite von 20 nm hat (Abbildung 1d). Für Ca 2+ Transienten mit Rhod-2 aufgezeichnet hatte die LED eine typische Spitzenemission bei 540 nm (grün) und eine Halbwertsbreite von 35 nm (Figur 1d). LEDs emittieren in einer Band Wellenlänge und daher Filter benötigen, um ihre spektrale Emission zu verringern. Zusätzlich kann gepulst Licht mit einer Rate von 1,6 kHz mit einer Dauer von 20 us erzeugt. Die LEDs wurden mit einem schnellen Leistungs-MOSFET-Feldeffekttransistor gepulst. Die gleichzeitige Aufnahmen mit verschiedenen Indikatoren können die LEDs von Zeitmultiplex durchgeführt werden. Leider von LEDs emittiert wird, Licht ist schwieriger auf eine Faseroptik zu fokussieren im Vergleich zu einem Laserstrahl. Somit wird der Hauptnachteil usLEDs ing ist, dass ihre Emissionsprofile Winkelverschiebungen haben (± 15 °) von der Hauptachse, und eine Hilfsoptik muss verwendet werden, um es zu korrigieren. In allen optischen Konfigurationen zuvor beschrieben, wird das Anregungslicht mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels reflektiert wird. Der Strahl wird anschließend von einer asphärischen Linse und ein Mikroskopobjektiv auf ein Multimode-Glasfaser fokussiert, die auf dem Gewebe positioniert ist. Wie in jeder Epifluoreszenz Anordnung dient der dichroitische Spiegel auch die Anregung von dem emittierten Licht zu trennen. Das emittierte Lichtspektrum reist zurück durch einen Sperrfilter jede reflektierte Anregung zu entfernen. Schließlich wird das emittierte Licht mit einem Objektiv auf einen Photodetektor (1) fokussiert. Die Transduktion von Licht in elektrischen Strom wird durch Silizium-Avalanche-Photodioden ausgeführt. Diese Dioden haben eine schnelle Reaktion und eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht niedrige Lichtdetektion. DasPhotostrom durch die Avalanche - Photodioden erzeugt wird, kann auf zwei Arten amplifiziert werden: a Transimpedanzverstärker einen resistiven Rückkopplungselement (1e) oder durch einen Integrator aufweist , um den Strom in eine Spannung (1f) zu konvertieren. Unter Verwendung des ersten Ansatzes ist die Ausgangsspannung proportional zum Photostrom und den Rückkopplungswiderstand. Ein typisches Beispiel für die resistive Erfassung von Pikosekunden - Laserimpulse in den Figuren 2a, 2b und 2c gezeigt. Panel 2a veranschaulicht den Ausgang des Transimpedanzverstärkers und Platte 2b eine Zeitexpansion des Intervalls mit einem Stern (*) gekennzeichnet . Ein Spitzenverfolgungsalgorithmus wurde implementiert , um die Spitze (rot) und der Basis (grün) für den Fluoreszenzantworten 12 zu ermitteln. Die Messung der Fluoreszenzbasis liefert Informationen sowohl der Dunkelstrom der Lawinenphotodiode und die von Umgebungs lig eingeführt Interferenzenht und elektromagnetische Kopplung. Eine Darstellung von Peaks und Basen ist in Abbildung 2c dargestellt ist . Diese Figur veranschaulicht die Fluoreszenz von dem Farbstoff emittiert (Rhod-2) , gebunden an Ca 2+ während des Herzzyklus eines schlagenden Herzens parakeet. In dem zweiten Verfahren wird die Ausgangsspannung des Integrators eine Funktion des Stroms und kapazitiver Rückkopplung (Figuren 2d, 2e und 2f). Abbildung 2f zeigt zwei aufeinanderfolgende Integrationszyklen: die erste ohne externe Beleuchtung und die zweite mit der angelegten Lichtimpulse von einem gepulsten LED. Eine detaillierte Beschreibung ist in den Figuren 2g und 2h dargestellt. Dieser Ansatz, wenn auch aufwendiger, bietet eine größere S / N aufgrund der Abwesenheit von thermischem Rauschen im Rückkopplungskondensator. Das Instrument umfasst eine Zeitstufe, die alle Steuer- und Multiplexen des Anregungslichts erzeugt und Befehle, um die Integration und heads reset Perioden. Dies wird üblicherweise mit einer digitalen Signalverarbeitungsschaltung durchgeführt , die auch eine digitale Differentiation des integrierten Ausgangssignals ausführt durch Berechnen eines on-line - Regression der Daten. Im Falle einer Widerstandsrückkopplung unter Verwendung jeder A / D-Erfassungskarte verwendet werden. Schließlich ist unsere LFFM Technik sehr vielseitig und kann angepasst werden, von mehr als einer Region aufzuzeichnen. Hinzufügen ermöglicht einen Strahlteiler in dem Lichtweg uns das Licht in zwei optische Fasern zu splitten. Jede optische Faser kann dann auf verschiedene Bereiche eines Gewebes angeordnet werden, um unabhängig zu erregen und Aufzeichnungsemission von den exogenen Fluoreszenzsonden. Diese Änderung ermöglicht es uns, wie anatomische regionale Unterschiede physiologischen Variablen beeinflussen zu beurteilen. Wobei eingesetzte 3 zeigt einen Strahlteiler aufgeteilt wit das CW Anregungslicht , so dass zwei optische Fasern verwendet werden , um zu messen transmurale elektrische oder intrazellulärem [Ca 2+] Ebenenh-Moll-Invasivität. Transmuraler Signale kann durch Platzieren einer Faser auf dem Endokard und der andere auf dem Epikard Schicht der Ventrikelwand aufgezeichnet werden. Daher hat die LFFM Technik die Fähigkeit, den zeitlichen Verlauf der zellulären Signale in unterschiedlichen Bereichen zu messen, und kann verwendet werden, um zu testen, ob regionale Veränderungen unter pathologischen Situationen auftreten.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloridlösung</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Lösung</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhyrdoxid</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Nylon-Membranfilter</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Verteiler MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Präzisions-Gleitnadel</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Schwarz Geflochtene Seidenschnur (nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20%ige Lösung</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L Schlauchpumpe</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Isostim Stimulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Waveform-Generator</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch ID: 1/32" OD: 3/32" Wand 1/32"</td><td></td> <td>Komponentenversorgung TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygonschlauch ID: 3/32" OD: 5/32" Wand 1/32"</td> <td>Komponentenversorgung</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Luer-Lock auf 3-Wege-Ventil</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>T-Adapter und Kunststoffverschraubungen</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffklemme</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Akupunkturnadeln</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BD-Spritze mit Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments Speed vacuum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Signalverarbeitungsschaltung DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duchoitischer Langpassspiegel 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv 10X NA 0,25 DIN AchromatischEndliches Intl Standardobjektiv</td><td>Edmund Optics</td><td>Lager# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv 20X NA 0,40 DIN Achromatisch Endliches Intl Standardobjektiv</td><td>Edmund Optics</td><td>Lager# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Langpass Farbglasfilter 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Green Nd-YAG Laser 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator für Laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Faseroptik 200 & Mikro; m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LEDs blau</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LEDs grün</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Würfelstrahlteiler, unpolarisierend</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" Länge, Schwalbenschwanz Optische Schiene</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2,5" Breite, Schwalbenschwanzträger</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0,75" Verfahrweg, Mikrometertisch</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Schwalbenschwanz optische Schiene 3"</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Schwalbenschwanzschienenträger 1"</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche Fotodiode Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Objektivhalter XY Translator& nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Steckbrett 6" x 6"</td> <td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus otpischer Tisch 4' x 6'ThorLabs</td><td></td> <td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Zylinderschrauben aus Edelstahl</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Acryl&nbsp; Blech</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Epoxid-Gel</td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2-teilig 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Präzisions-Gleitnadel</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Präzisions-Gleitnadel</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Montagesockel, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Drahtregale 36"</td> <td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Drahtregale</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Pfosten- und Winkelklemme</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Glasspritze für Färbekammer</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Gummistopfen</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

lokale feldfluoreszenzmikroskopie: imaging zellulären signalen in intact herzen

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Im Herzen sind molekulare Signalstudien in der Regel in isolierten Myozyten durchgeführt. Jedoch können viele pathologische Situationen wie Ischämie und Arrhythmien nur vollständig an der gesamten Organebene verstanden werden. Hier stellen wir die spektroskopische Technik der lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM), die die Messung von zellulärer Signale im intakten Herzen ermöglicht. Die Technik basiert auf einer Kombination aus einer Langendorff perfundierten Herzen und Lichtleitfasern Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen. LFFM hat verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf Physiologie des Herzens unter normalen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Mehrere können Herz-Variablen mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren überwacht werden. Dazu gehören cytosolischen [Ca 2+], intra-Retikulum [Ca 2+] und Membranpotentialen. Die exogenen Fluoreszenzsonden werden angeregt und die emittierte Fluoreszenz mit drei verschiedenen Anordnungen von LFFM Epifluoreszenz-Technik nachgewiesens in diesem Papier. Die zentralen Unterschiede zwischen diesen Techniken sind die Art der Lichtquelle für die Anregung verwendet, und auf dem Weg das Anregungslicht moduliert wird. Der gepulste LFFM (PLFFM) verwendet Laserlichtimpulse, während eine kontinuierliche Welle LFFM (CLFFM) kontinuierliches Laserlicht zur Anregung verwendet. Schließlich Leuchtdioden (LEDs) als eine dritte Lichtquelle verwendet. Diese nicht-kohärente Anordnung gepulst LED-Fluoreszenzmikroskopie (PLEDFM) genannt.

AP und Ca 2+ Transienten in Endokard und Epikard Um Signale über die Ventrikelwand zu vergleichen, eine Faseroptik in das Endokard und das andere in das Epikard angeordnet. Vergleichen der Morphologie eines AP vom Endokard mit einer aus dem Epikard aufgezeichnet ist der beste Weg, um die transmurale Funktion zu beurteilen. Die ventrikuläre Wand ist sehr heterogen, und ...

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Das übergeordnete Ziel dieser ortsaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebungstechnik besteht darin, mit Hilfe molekularer Sonden intrazelluläre Kalziumkonzentrationen oder Membranpotentiale aus Herzbereichen zu messen, die auf der Ebene des gesamten Herzens schwer zugänglich sind. Diese Methode kann uns helfen, zentrale kardiovaskuläre Fragen im Zusammenhang mit Herzstillstand und Ischämie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass kardiale Eigenschaften anhand zellulärer Ereignisse im intakten Organ gemessen werden, wobei die Zellen weiterhin elektrisch, mechanisch und metabolisch gekoppelt bleiben.Bereiten Sie zunächst die horizontale Langendorff-Apparatur vor. Füllen Sie frisch zubereitete Tyrode-Lösung in die 60-Milliliter-Spritzen und fügen Sie alle dazugehörigen Schläuche der Apparatur hinzu. Entfernen Sie nach dem Befüllen alle Luftblasen.Anschließend wird die beladene Lösung mit reinem Sauerstoffgas, das von einem untergetauchten Kunststoffluftstein geliefert wird, equilibriert. Danach wird ein nicht resorbierbarer chirurgischer Faden um eine Nadel gelegt. Dieser dient als Kanüle, um das Herz retrograd zu perfundieren, wenn er mit der Apparatur ver

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Hier führen wir eine Methode zur Verwendung eines optischen Intraventrikelkatheters in durchlässigen Herzen ein, um eine Absorptionsspektroskopie über die Herzwand durchzuführen. Die gewonnenen Daten liefern robuste Informationen über die Gewebesauerstoffspannung sowie substratiennutzung und Membranpotenzial gleichzeitig mit kardialen Leistungsmessungen in dieser allgegenwärtigen Zubereitung.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Wir stellen die Methodik zur Isolierung von murinen Myozyten vor und wie Spannungs- oder Kalziumspuren gleichzeitig mit Sarcomere-Verkürzungsspuren mittels Fluoreszenzphotometrie mit gleichzeitigen Messungen der digitalen Zellgeometrie erhalten werden können.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie, wie lokale Feldfluoreszenzmikroskopie intrazelluläres Calcium und Membranpotenziale in intakten Herzen misst. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardiovaskulärer Ereignisse wie Herzstillstand und Ischämie.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

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