Akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch: Eine Methode zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Neurogenese und die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, den Umbau des Gehirns unter hyperglykämischen Bedingungen zu beurteilen und radioaktiv markierte Moleküle im Zebrafisch zu verfolgen. Hyperglykämie ist durch eine übermäßige Konzentration von Blutzucker gekennzeichnet. Chronische Hyperglykämie kann auf diabetische Erkrankungen zurückzuführen sein und verschiedene vaskuläre Funktionsstörungen verursachen, die wiederum klinische Komplikationen wie Myokardinfarkt, Schlaganfall oder diabetische Fußgeschwüre auslösen können.

Auch akute Hyperglykämie aufgrund von Stress kann hämorrhagische Komplikationen bei ischämischem Schlaganfall begünstigen. Der Zebrafisch ist ein interessantes Modell, um menschliche Krankheiten und ihre Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem zu verstehen. Dies gilt insbesondere, da das Gehirn erwachsener Fische im Vergleich zu Säugetieren eine intensive neurogene Kapazität und eine hervorragende Fähigkeit für Gehirnreparaturmechanismen aufweist, daher stellen Zebrafische ein gutes Modell für die Untersuchung des Gehirnumbaus nach Stress unter akuten und hyperglykämischen Bedingungen dar.

Es ermöglicht auch die Untersuchung der Bioverteilung von radioaktiv markierten Molekülen und potenzieller therapeutischer Wirkstoffe. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der französischen und europäischen Gemeinschaft für die Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche genehmigt. Fangen Sie einen Fisch vorsichtig mit einem Fischnetz.

Legen Sie den Fisch in eine kleine Menge Tricain-Anästhetikum, verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,02 % im Wasser. Warten Sie, bis sich der Fisch nicht mehr bewegt. Nehmen Sie den Fisch mit einer abgeschnittenen Pipette heraus und legen Sie ihn vorsichtig auf saugfähiges Seidenpapier, um so wenig Wasser wie möglich zu entfernen.

Wiegen Sie den Fisch, um eine Spritze mit d-Glukose für die Injektion vorzubereiten, von 50 Mikrolitern à 2,5 Gramm pro Kilo Körpergewicht. Zum Beispiel erhält ein 0,6 Gramm schwerer Fisch 50 Mikroliter einer 3%d-Glukose-PBS-Lösung. Legen Sie den Fisch auf den Rücken und pflegen Sie ihn mit einer Hand.

Führen Sie mit der anderen Hand die Nadel der Spritze in die intraperitoneale Höhle ein und injizieren Sie langsam die d-Glucose PBS-Lösung. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie den Fisch zurück in das Fischwasser. Kontrollieren Sie den Fisch, bis er sich vollständig erholt hat.

Ihr Blutzuckerspiegel wird in der Regel nach 1 1/2 Stunden gemessen. Um chronische Hyperglykämie nachzuahmen, bereiten Sie einen Zwei-Liter-Tank mit D-Glukose in einer Endkonzentration von 111 Millimolar vor. Wiegen Sie dazu 40 Gramm D-Glukose und geben Sie es in einen leeren Tank.

Füllen Sie das Aquarium mit zwei Litern Fischwasser und setzen Sie bis zu sieben Fische hinein. Wechseln Sie die Glukoselösung alle zwei Tage, um das Wachstum von Bakterien oder anderen Mikroorganismen zu vermeiden. Chronische Hyperglykämie wird durch eine 14-tägige Behandlung mit D-Glukose erreicht.

Fangen Sie einen Fisch mit einem Netz und legen Sie ihn auf Eis. Decken Sie den Fisch mit Eis ab, um eine schnelle Euthanasie zu ermöglichen. Nehmen Sie den Fisch und wischen Sie ihn ab, um Wassertropfen zu entfernen, die die Blutproben verdünnen könnten.

Entnehmen Sie ein Auge mit einer Präparierzange und warten Sie, bis die Augenhöhle mit Blut gefüllt ist. Legen Sie einen Teststreifen auf das Blutzuckermessgerät und führen Sie den Streifen in die Augenhöhle ein. Notieren Sie den Wert der Blutzuckerkonzentration.

Bei akuter Hyperglykämie induziert eine intraperitoneale Injektion von d-Glukose einen signifikanten Anstieg des Blutzuckerspiegels, wie gezeigt, 1 1/2 Stunden nach der Injektion. Bei chronischer Hyperglykämie führt das Eintauchen von Fischen in eine D-Glukoselösung zu einem signifikanten Anstieg des Blutzuckerspiegels, wie sich nach 14-tägiger Behandlung zeigt. Trennen Sie am Ende des Eingriffs den Körper mit einer Präparierschere vom Kopf und legen Sie den Kopf in 4% Paraformaldehyd, verdünnt in PBS für immunhistochemische Experimente.

Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Alternativ kann das Gehirn direkt extrahiert und für andere Experimente, wie z. B. die mRNA-Extraktion, eingefroren werden. Am nächsten Tag werden die fixierten Köpfe mit PBS gespült und mit einer Nadel unter einem Präpariermikroskop gehalten.

Das verbleibende Auge wird entfernt und die Schädeldecke wird vorsichtig mit einer Pinzette geöffnet. Das Gehirn wird dann vorsichtig extrahiert und in 1x PBS gelegt. Fixierte Gehirne werden schrittweise in einer Reihe von steigenden Ethanolkonzentrationen dehydriert, gefolgt von zwei 30-minütigen Bädern mit Toluol.

Die Gehirne werden dann in eine Einbettkassette gelegt, und der Deckel wird vorsichtig verschlossen. Legen Sie die Kassette in geschmolzenes Paraffin bei 58 bis 60 Grad Celsius. Schalten Sie während der Paraffineinbettung des Gehirns die wärmende Einschlusszange ein.

Legen Sie die Kassette in ein sauberes Paraffinbad. Nehmen Sie am Ende der Paraffinbäder die Kassette heraus. Gießen Sie etwas flüssiges Paraffin in eine Form.

Öffnen Sie die Kassette und legen Sie das Gehirn in geschmolzenes Paraffin in die Form. Orientieren Sie das Gehirn mit der wärmenden Einschlusszange. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffin und lassen Sie es auf dem Kühlteil der Einbettmaschine aushärten.

Aus technischen Gründen sollte das Gehirn entsprechend einer anterior-posterioren Achse positioniert werden. Nachdem Sie den Paraffinblock aus der Form genommen haben, schneiden Sie ihn ab und befestigen Sie ihn auf einer Kassette mit geschmolzenem Paraffin in der richtigen Ausrichtung, um ein Querschneiden zu ermöglichen. Führen Sie den Paraffinblock in den Arm eines Mikrotoms ein und schneiden Sie 50-Mikrometer-Abschnitte, bis das Niveau der Gehirnprobe erreicht ist.

Schneiden Sie dann den Paraffinblock ab, um ein Trapez zu erhalten, und stellen Sie die Schnittdicke auf sieben Mikrometer ein. Sammeln Sie die Paraffinbänder mit einem feinen Pinsel und legen Sie sie auf ein schwarzes Papier. Schneiden Sie die Paraffinbänder alle drei bis vier Abschnitte ab.

Legen Sie einen Objektträger auf eine Warmhalteplatte und bedecken Sie ihn mit destilliertem Wasser. Positionieren Sie die Abschnitte sanft auf dem Wasser auf der Rutsche und erwärmen Sie sie auf bis zu 40 Grad Celsius. Wenn die Paraffinbänder ausreichend ausgebreitet sind, entfernen Sie das Wasser mit einem saugfähigen Tuch.

Die letzten Tropfen werden mechanisch entfernt, wie abgebildet. Lassen Sie den Objektträger mindestens zwei Stunden trocknen, bevor Sie das im Protokoll beschriebene immunhistochemische Verfahren durchführen. Nach der Immunhistochemie werden die Objektträger unter einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop analysiert, um die Auswirkungen der Hyperglykämie auf die Proliferation von Gehirnzellen zu untersuchen.

Die Quantifizierung der Gehirnzellen erfolgt in mindestens drei aufeinanderfolgenden Abschnitten oder in einer Region von Interesse. Hier erscheinen proliferative Zellen, die PCNA-positiven Zellen entsprechen, in grün. Wie Sie sehen können, führt chronische Hyperglykämie zu einer Abnahme der Anzahl der proliferativen Zellen, die grün mit PCNA-Antikörpern markiert sind, im ventralen Telencephalon, im dorsalen Telencephalon und im kaudalen Hypothalamus um den lateralen und hinteren Recessus.

Alternativ kann zur Untersuchung der Auswirkungen der Hyperglykämie auf die verletzungsinduzierte Neurogenese eine Stichwundverletzung des Telencephalons während einer chronischen hyperglykämischen Behandlung durchgeführt werden. Betäuben Sie dazu einen sieben Tage behandelten Fisch und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop. Schieben Sie eine 30-Gauge-Spritze senkrecht durch den Schädel in die Mitte der rechten telencephalen Hemisphäre.

Nach diesem Vorgang sollte der Fisch für die erforderliche Zeit in sein Aquarium zurückgebracht werden. Hier ließ man den Fisch sieben Tage in d-Glukosewasser überleben, bevor er geopfert wurde. Eine Stichverletzung des Telencephalons führt sieben Tage nach der Läsion zu einer starken Hochregulierung der Proliferation in der verletzten Hemisphäre.

Unsere Daten zeigen, dass chronische Hyperglykämie eine signifikante Abnahme der Heilungsprozesse des Gehirns induziert, indem sie die Zellproliferation nach einer Stichverletzung des Telencephalons verringert. Der Zebrafisch kann auch zur Untersuchung der Bioverteilung von radioaktiv markierten Molekülen verwendet werden. Hier haben wir uns entschieden, den Glukosestoffwechsel im Zebrafisch-Organismus zu untersuchen.

Der Fisch sollte zuerst betäubt und auf ein mit Betäubungsmitteln getränktes Taschentuch gelegt werden. Anschließend wird der Fisch hinter eine Funkschutzscheibe gesetzt. Die Spritze mit 50 Mikrolitern Fluordesoxyglukose wird vorbereitet.

Der Fisch wird auf den Rücken gelegt und intraperitoneal mit 50 Mikrolitern FDG zu 20 Megabecquerel injiziert. Der Fisch wird dann auf ein anderes Taschentuch gelegt, das mit Betäubungsmitteln getränkt ist. Er wird schonend verpackt und auf dem Arm eines PET-Scan-Imagers positioniert.

Der Arm wird in den PET-Scan eingeführt und das bildgebende Verfahren durchgeführt. Hier können Sie feststellen, dass FDG nicht nur an der Injektionsstelle, sondern auch im Kopf des Fisches, insbesondere im Gehirn und entlang des gesamten Rückenmarks, nachgewiesen wird. In dieser Studie stellen wir zwei verschiedene Methoden zur Feststellung einer akuten und chronischen Hyperglykämie beim Zebrafisch zur Verfügung und zeigen, dass Hyperglykämie die Proliferation von Gehirnzellen unter normalen und verletzungsinduzierten Bedingungen beeinträchtigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Zebrafisch als relevantes Modell verwendet werden kann, um die schädlichen Auswirkungen von Hyperglykämie auf das zentrale Nervensystem zu untersuchen. Es ermöglicht auch die Beurteilung der Bioverteilung von radioaktiv markierten Molekülen mittels PET-Scan.