Name: Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Lernen Sie das Makroschaum-basierte Abstrichverfahren zum Nachweis von Norovirus auf Oberflächen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Umweltkontamination und Remediationsstrategien während Ausbrüchen.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

1. Swab Probenahme im Feld <ol><li> Tragen Sie ein sauberes Paar Handschuhe. </li><li> Messen Sie die Größe des Beprobungsfläche ohne Berührung der Oberfläche mit einem Maßband oder Lineal. Versuchen Sie, den Bereich so genau wie möglich zu ermitteln und füllen Sie ein Berichtsformular (Supplementary Tabelle 1). </li><li> Überprüfen Sie den Tupfer-Kit für mögliche Leckagen und Etikettenprobentransporttaschen und Tupfer-Kits. </li><li> Bewegen des Tupfers über die Flächenabtastung folgendermaßen: einen Hub in horizontaler Richtung, einen Hub in vertikaler Richtung und einem Hub in einer diagonalen Richtung. Seien Sie nicht eine Fläche größer als 700 cm 2 Tupfer. </li><li> Legen Sie jedes Tupfer in ein Röhrchen und ziehen Sie die Kappe. </li></ol> 2. Lagerung und Transport von Putzlappen zum Labor <ol><li> Halten Tupfer bei 4 ° C für bis zu 48 h. Falls eine Lagerung für einen längeren Zeitraum erforderlich ist, lagern die Abstriche bei -20 ° C (oder -70 ° C). </li><li> Halten Sie die Röhrchen bei 0-4 ° C (dh. verwenden, Kältepackungen) in einem isolierten Behälter während des Transports zum Labor und werden innerhalb von 24 bis 48 h der Sammlung. </li></ol> 3. Viruskonzentration, Viral RNA Extraktion und Reinigung HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte verwenden, um eine Tischzentrifuge bei 5.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie mit der universellen Nukleinsäure-Extraktion (UNEX) Puffer arbeiten. Schutzbrille oder Gesichtsschutz. <ol><li> Beschriften Sie ein 15 ml-Röhrchen und einer RNA-Midi-Säule für jede Probe. Fügen Sie eine negative Extraktionskontrolle in jedem Experiment. </li><li> Die Lyse-Lösung für 10 Tupfer vorzubereiten, mit 25 ml PBST (PBS, pH 7,2, enthaltend 0,02% Tween-80) 25 ml UNEX Puffer mischen. </li><li> Je 50 ul der Coliphage MS2 - Suspension (10 &amp; sup6 ; PFU / &amp; mgr; l) zu 50 ml Lysis - Lösung. </li><li> Legen Sie einen Tupfer in einem 15 ml-Röhrchen und mit 5 ml Lyselösung. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li>5 ml 100% Ethanol zu jedem Röhrchen und Vortex für 10 s. </li><li> Vorsichtig den Tupfer aus dem 15 ml-Röhrchen zu entfernen (es enthält UNEX Puffer) es leicht gegen die Seite des Schlauchpress überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann den Tupfer verwerfen. Die restlichen Mengen sollten zwischen 9-10 ml sein. </li></ol> 4. Midi Säule viralen Nukleinsäureextraktion <ol><li> Transfer vorsichtig 4,5 ml UNEX / Ethanol-Mischung aus Schritt 3.6 auf einem Midi-Säule, Zentrifuge und Filtrat verwerfen. </li><li> Legen Sie eine andere 4,5 ml aus der gleichen Mischung auf die gleiche Säule, Zentrifuge und verwerfen Sie das Filtrat. </li><li> Für die erste Wäsche, fügen Sie 3,5 ml 70% Ethanol auf die Midi-Säule, Zentrifuge und das Filtrat verwerfen. </li><li> Für die zweite Wäsche, weitere 3,5 ml 70% Ethanol auf die Midi-Spalte hinzufügen. Zentrifuge und Filtrat verwerfen. </li><li> Für die Trockenschleuder Zentrifugation der Midi Spalten alle Spuren von Ethanol zu entfernen (was sich negativ auf Ihre virale RNA-Gewinnung beeinflussen können). </li><li>Legen Sie die Midi-Spalte in einer neuen 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 250 ul Elutionspuffer auf die Midi-Säule; 1 min warten, bevor das Zentrifugieren der höchsten viralen RNA-Gewinnung zu erhalten. </li><li> Die extrahierten Nukleinsäure bei -70 ° C oder sofort zu Schritt 5. </li></ol> 5. Die Konzentration der viralen Nukleinsäure Verwendung von RNA-Clean and Concentrator Kits <ol><li> In 500 &amp; mgr; l RNA Binding Buffer zu 250 &amp; mgr; l in Schritt eluierte RNA 4.7 oben und Vortex für 10 s. </li><li> In 750 &amp; mgr; l 100% Ethanol und Vortex für 10 s. </li><li> Beschriften Sie eine Spin-Säule für jede Probe. Laden Sie die 750 &amp; mgr; l Probe auf eine Spin-Säule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spin-Säulen bei 12.000 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Legen Sie die restlichen 750 &amp; mgr; l auf eine Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min. </li><li> Für die Vorwäsche, werden 400 &amp; mgr; l RNA Prep Puffer zu jeder Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Für die erste Wäsche, fügen 800 &amp; mgr; l RNA Waschpuffer in jede Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Für das zweite Waschen werden 400 &amp; mgr; l RNA Waschpuffer Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min zu spinnen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Für die Trockenschleuder Zentrifugation der Spin-Säule alle Spuren von Waschpuffer für 2 min bei 12.000 xg zu entfernen. </li><li> Transfer vorsichtig Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zugeben von 25 &amp; mgr; l Elutionspuffer auf die spin-Säule und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. Dadurch wird die Rückgewinnung von viraler RNA aus der Säule zu erhöhen. </li><li> Sammeln RNA durch die Spin-Säule bei 10.000 × g für 1 min zentrifugiert. </li><li> Entweder gehen Sie direkt auf RT-qPCR (Schritt 6) oder Speicher-RNA bei -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR Nachweis von Genogruppe I und II Noroviren und Coliphage MS 2 (Supplementary Tabelle 2) <ol><li> Saubere Arbeitsflächen, pipettes und Zentrifugen mit RNase Dekontaminationslösung auf eine mögliche Kontamination zu reduzieren. </li><li> Auftauen RT-qPCR-Reagenzien auf Eis. Thaw RNA auf Eis (in einem separaten Bereich / Zimmer). </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Reaktionen und fügen Sie mindestens 10% mehr von ihnen (zB wenn 10 Reaktionen benötigt werden, machen Master - Mix für 11). </li><li> Vortex einzelnen Master-Mix-Komponenten, mit Ausnahme von 25x RT-qPCR Enzym, für 5 s. durch Ausklopfen der Röhre mit einem Finger vorsichtig das Enzym mischen. </li><li> Kurz Zentrifuge Master-Mix-Komponenten für 5 s. </li><li> Bereiten Sie den Master - Mix für die Echtzeit - RT-PCR - Nachweis von Noroviren GI und GII gemäß dem Kit - Anweisungen und Norovirus-spezifischen Oligonukleotid - Primer und Sonden in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Supplementary Tabelle 3) hinzuzufügen. </li><li> Mischen Sie den Master-Mix durch Pipettieren von 5-10 mal nach oben und unten (Verwirbelung wird nicht empfohlen). Aliquot 22 ul des Master-Mix in jeder Vertiefung der Echtzeit-PCR-96-Well-Platte. </li><li> Vortex Probe RNA5 Sekunden, und sammeln Sie durch kurzes (5 s) Zentrifugation. </li><li> In 3 ul der Probe RNA und GI und GII positive Kontrollen an den RT-qPCR Platte (folgen Vorlage aus Tabelle 2). In 3 ul Nuklease-Freewater in den No-Template-Steuerung (NTC) Brunnen. </li><li> Verschließen Sie die Echtzeit-Platte mit optischen Klebefilm. </li><li> Zentrifuge vorsichtig die Echtzeit-Platte bei 1300 × g für 1 min alle Luftblasen oder Flüssigkeitstropfen zu entfernen, die in den Vertiefungen vorhanden sein können. </li><li> Stellen Sie eine Echtzeit-PCR-Instrument und Set-up folgende Thermozyklisierung Bedingungen: 1) RT-Schritt 10 min. bei 45 ° C (2) Aktivierung der Taq-Polymerase, 10 min. bei 95 ° C und (3) 45 Zyklen von 15 s bei 95 ° C und 60 s bei 60 ° C. </li></ol> 7. Quantifizierung von Norovirus in Tupferproben <ol><li> Überprüfen Sie die Ergebnisse der positiven und negativen Kontrollen RT-qPCR Ergebnisse (Ergänzende Tabelle 3) zu validieren. </li><li> Bestimmen Sie, ob jede Standardkurve erfüllt dieakzeptable Werte in Ergänzungs Tabelle 2 und berechnen die Gesamtstandardabweichung für die Standardkurve unter Verwendung von Gleichung 1 gegeben. (Gleichung 1)% Wirkungsgrad = 100 x 10 (Durchschnitt CT - Werte-Intercept) / Slope. </li><li> Wenn die PCR - Thermocycler - Software wird die Steigung nicht für jede Standardkurve zu berechnen, bestimmen Steigung und R 2 Werte , die durch Regression Statistik - Software (zB Excel, SPSS oder SAS). Darüber hinaus berechnen für Standardkurven folgende Gleichung I die% Wirkungsgrad </li><li> Notieren Sie sich die RNA - Kopienzahl von Thermocycler - Software berechnet für alle Testproben auf der Basis von Standardkurven, die den Kriterien in Ergänzende Tabelle 4 erfüllen. Rerun alle Proben mit Standard - t Hut Kurven erfüllen nicht die Kriterien oder haben falsch-positive Kontrollen. Überprüfen Ct-Werte von Coliphage MS2, die als interne Kontrolle zur Überwachung PCR Hemmung aufgenommen. </li><li> Bestimmen Sie die Gesamtzahl der RNA-Kopien per Probe durch die in Schritt 7.2 berechnet, um die RNA-Kopienzahl multipliziert mit dem Verhältnis des Volumens (25 bis 50 &amp; mgr; l) der gesamten RNA Eluent derjenigen der RNA (3 bis 5 &amp; mgr; l), die für die RT-qPCR-Reaktion. Alternativ berechnen die RNA - Dichte durch die Gesamt - RNA - Kopienzahl durch die Objektfläche (cm 2) analysiert geteilt wird . </li></ol> 8. Genotypisierung von Echtzeit-RT-PCR-positiven Proben von Hemi Nested Herkömmliche PCR-Amplifikation <ol><li> Bereiten Sie die erste Runde des Master - Mix für jeden Primersatz der RT-PCR - Assays (Supplementary Tabellen 2 und 5). </li><li> In 5 ul Norovirus positive RNA zu 20 &amp; mgr; l Master-Mix. </li><li> Führen Sie die RT-PCR unter den folgenden Bedingungen: (1) RT-Schritt 30 min bei 42 ° C (2) Aktivierung der Taq-Polymerase, 15 min bei 95 ° C, und (3) 40 Zyklen von 30 s bei 95 ° C , 30 s bei 50 ° C und 60 sec bei 72 ° C. Nach 40 Zyklen bei 72 ° C für weitere 10 min inkubiert. </li><li>Bereiten Sie die zweite Runde der mater - Mix für jeden Primersatz der RT-PCR - Assays (Supplementary Tabellen 2 und 5). </li><li> In 23 &amp; mgr; l Master-Mix und mit 2 &amp; mgr; l der ersten Runde RT-PCR-Produkte (von der ersten Runde) zu jedem Röhrchen (idealerweise der ersten Runde Produkt 1/10 in RNase-freiem Wasser verdünnt werden sollte). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 8.3. </li><li> Vorbereiten eines 2% igen Agarose-Gel in 100 ml 1x Tris-Acetat-EDTA (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA bei pH 8,3). Nach dem Auflösen von Agarose, indem die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzt wird, 10 ul Nukleinsäurefarbstoff pro 100 ml der vorbereiteten Gel hinzu, nachdem die Mischung auf 60-70 ° C abgekühlt, um das Gel gießen und die Kämme einzufügen. Lassen Sie das Gel für mindestens 30 min absetzen. </li><li> Mischen Sie 15 ul jeder RT-PCR-Produkt mit 3 &amp; mgr; l 6-fachem Beladungs ​​Farbstoff. Last 15 ul jeder Probe und dem Agarosegel elektrophoretisch bei 100 V für 1 h. </li><li> Excise Ziel RT-PCR-Fragmente von geeigneter Größe (330 bp für GI und 341 bp für GII) aus dem Gel eind RNA unter Verwendung eines kommerziellen Gel-Extraktions-Kits reinigen. Das gereinigte PCR-Produkt kann jetzt Sanger-Sequenzierung verwendet werden. </li></ol>

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Autorinnen und Autoren haben keine widersprüchlichen Interessen. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Centers for Disease Control and Prevention dar.

Noroviren haben eine 50% human infektiöse Dosis zwischen 18 und 10 drei Viruspartikel 20. Deshalb, auch Low-Level-Kontamination von Oberflächen kann eine Gefahr für die Gesundheit darstellen. Verschiedene Aspekte der Tupfer Probenahmeprotokoll wurden einschließlich ausgewertet: 1) verschiedene Tupfer Materialien, 2) Lagerbedingungen Tupfer während des Transports, 3) Virus-RNA-Konzentration und 4) Coliphage MS2 als interne Extraktionskontrolle. Bis vor kurze...

<html> Menschliche Noroviren sind eine führende Ursache für Epidemie und sporadischen akuten Gastroenteritis weltweit 1, 2, 3. Das Virus ist sehr ansteckend und Übertragung erfolgt durch direkten Mensch zu Mensch Interaktion oder indirekt durch Kontakt mit kontaminierten Lebensmitteln, Wasser oder Umwelt-Oberflächen. Noroviren können für längere Zeit vergossen werden und verlängert das Überleben des Virus auf Umwelt Oberflächen hat 1 dokumentiert, 2, 3. Während der Spitzenabwurf, Milliarden von Viruspartikeln pro Gramm Faeces freigesetzt werden, und Erbrochenem enthält auch eine ausreichende Anzahl von Viruspartikeln 4 Infektion zu verursachen, 5, 6, 7, 8,ef &quot;&gt; 9, 10. Darüber hinaus wird die Übertragung des Virus zwischen leblosen Oberflächen und die menschliche Haut kann leicht 2, 11, 12. Daher Überwachung der Umweltverschmutzung in Ausbruchsuntersuchungen auftreten unterstützen können und in der Wirksamkeit der Clean-up - Bewertung und Desinfektionsverfahren. Mehrere Umweltprobenahme Protokolle zum Nachweis von Rotavirus, Coliphage MS2, feline Calicivirus (FCV) und Bakteriophagen P22 13, 14, 15, 16 beschrieben worden. Jedoch sind die Validierungsbedingungen in diesen Studien beschrieben, einschließlich der schnellen Austrocknung (&lt;1 h) und kleine Oberflächenbereiche (25 x 100 cm 2), möglicherweise nicht ausreichend Feldeinstellungen repräsentieren. Darüber hinaus ist die geringe Belastung von Enviro erwartetnmental Oberflächen erfordern Protokolle, die der Lage sind, sehr wenige Viruspartikel zu detektieren. Wir entwickelten eine Makroschaum-basierte Oberfläche Probenahmeverfahren zum Nachweis und zur Typisierung von Norovirus. Dieses Verfahren wurde bei mehreren Norovirusausbrüchen validiert. Das Protokoll enthält 1), wie Tupferproben von Umwelt Oberflächen (2), wie die Integrität der Proben während der Entnahme und Versand an das Labor, und 3) Labortests und Typisierung von Norovirus am besten halten zu sammeln.

<table><tbody><tr><td>Gattungsname für Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makroschaumtupfer</td><td>Vorbefeuchtetes EnviroMax-Tupfer-Kit&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><<tr><td>strong>RNA Lysepuffer&nbsp; </td><td>CDC UNEX Puffer</td><td>Mikrobiologika</td><td>Kat Nr MR0501</td></tr><tr><td>RNA Extraktion Spin Säule</td><td>Midi Säule</td><td>Omega Biotek</td><td>Kat Nr R6664-02</td></tr><tr><td>RNA Aufreinigung Spin Säule</td><td>Zymol RNA Reinigungs- und Konzentratorkit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Kat.-Nr. R1016</td></tr><tr><td>Real time RT-PCR Kit</td><td>AgPath Kit Einstufiges RT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Kat Nr 4387391</td></tr><tr><td>Herkömmliches RT-PCR Kit</td><td>Qiagen One Step RT-PCR Kit</td><td>Qiagen Kit</td><td>Katze Nr 210212</td></tr><tr><td> Extraktionskit</td><td>Qiagen QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen Kit</td><td>Katze Nr. 28704 oder 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Kat.-Nr. 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA-Run-off-Transkripte</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Echtzeit-PCR-Plattform</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modell ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optische 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Thermo Scientific</td><td>Kat.-Nr. 4316813</td></tr><tr><td></td><td><ein href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& productID=4306311&; _bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Klare Klebefolie&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Kat Nr. 4306311</td></tr></tbody></table>

swab sampling verfahren zum nachweis von humanem norovirus auf oberflächen

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Menschliche Noroviren sind eine führende Ursache für Epidemie und sporadische Gastroenteritis weltweit. Da die meisten Infektionen entweder direkt über die Person-to-Person Route oder indirekt durch Umwelt Oberflächen oder Lebensmittel übertragen werden, kontaminierte fomites und leblose Oberflächen sind wichtige Vehikel für die Verbreitung des Virus während Norovirusausbrüchen. Wir entwickelt und evaluiert ein Protokoll Makroschaums Tupfer zum Nachweis und zur Typisierung von humanen Noroviren von harten Oberflächen verwendet wird. Im Vergleich zu faser bestückte Tupfer oder antistatische Wischtücher ermöglichen Makroschaum Tupfer Virus Recovery (Bereich 1,2 bis 33,6%) von Toilettensitzflächen von bis zu 700 cm 2. Das Protokoll enthält die Schritte zur Extraktion des Virus aus den Tupfer und eine weitere Konzentration der viralen RNA unter Verwendung von Spin-Säulen. Insgesamt 127 (58,5%) von 217 Tupferproben, die von den Oberflächen auf Kreuzfahrtschiffen und Langzeitpflegeeinrichtungen, wo Norovirus-Gastroenteritis war gesammelt worden warenpositiv getestet GII Norovirus durch RT-qPCR berichtet. Von diesen 29 (22,8%) erfolgreich genotypisiert werden konnte. Abschließend Nachweis von Noroviren auf Umgebungsoberflächen unter Verwendung des Protokolls wir bei der Bestimmung des Grades der Umweltverschmutzung während der Ausbrüche sowie Nachweis von Virus kann helfen entwickelt, wenn klinische Proben nicht zur Verfügung stehen; es kann auch die Überwachung der Wirksamkeit von Sanierungsstrategien erleichtern.

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm des Tupferprobenahmeprotokoll. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten; 1) Probenentnahme, 2) Probenlagerung und Transport, 3) die virale RNA-Reinigung und Konzentration und 4) RT-qPCR-Assay und die Genotypisierung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Abbildung 1: Ablaufdiagramm des endgültigen Protokolls für Umweltober...

Es wurde eine auf Makroschaum basierende Probenahmemethode für den Nachweis und die Quantifizierung von Noroviren auf harten Umweltoberflächen entwickelt und evaluiert.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Das übergeordnete Ziel unserer auf Makroschaum basierenden Oberflächenprobennahmemethode besteht darin, die Auslöser von Ausbrüchen, die allgemeine Bewertung der Dynamik der Umweltkontamination durch das Virus sowie die Wirksamkeit von Sanierungsstrategien für Noroviren zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie Abstriche von Umweltflächen entnommen werden, wie diese Abstriche gelagert und transportiert werden sollten und welches Laborprotokoll zur Detektion und Typisierung von Noroviren aus diesen Abstrichen empfohlen wird. Wichtige Verbesserungen dieses Umweltabstrichprotokolls für Noroviren bestehen darin, dass wir den besten Typ des Abstrichmaterials bestimmt, ermittelt haben, wie viel Norovirus von harten Oberflächen zurückgewonnen werden kann, und nachgewiesen haben, dass das Protokoll effektiv zur Probenahme größerer Oberflächenbereiche eingesetzt werden kann.In diesem Video werden zwei meiner wissenschaftlichen Mitarbeiter, Geun Woo Park und Preeti Chhabra, das Abstrichprotokoll zur Detektion und Typisierung von Noroviren demonstrieren. Um mit dem Abstrichen zu beginnen, begeben Sie sich zum Probenahmebereich und führen Sie den Abstrich in einer Bewegung horizontal, in einer Bewegung vertikal und in einer Bewegung diagonal über die Probenfläche durch. Geben Sie jeden Abstrich in ein separates Röhrchen und verschließen Sie den Deckel fest.Probenflächen aus Edelstahl entnehmen, eine Toilettensitzoberfläche abwischen und einen Türgriff abnehmen. Danach ein 15-Milliliter-Gefäß und eine RNA-Midi-Säule für jede Probe beschriften. In jedem Experiment eine negative Extraktionskontrolle einbeziehen.Bereiten Sie eine leere Flasche zur Sammlung von Abfall des universellen Nukleinsäure-Extraktions- oder UNEX-Puffers vor. Um die Lyselösung für 10 Abstriche vorzubereiten, mischen Sie 25 Milliliter UNEX-Puffer mit 25 Milliliter PBST. Geben Sie 50 Mikroliter Suspension des Coliphagen MS2 zu 50 Milliliter Lyselösung hinzu.Legen Sie einen Abstrichtupfer in ein 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter Lysepuffer hinzu. Mischen Sie den Tupfer in der Lösung und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur. Geben Sie fünf Milliliter 100 %igen Ethanol zu jedem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang im Vortex. Entfernen Sie den Tupfer vorsichtig aus dem 15-Milliliter-Röhrchen, drücken Sie ihn leicht gegen die Röhrchenwand, um überschüssige Flüssigkeit ablaufen zu lassen, und entsorgen Sie den Tupfer. Überführen Sie vorsichtig 4,5 Milliliter der UNEX-Ethanol-Mischung auf eine Midi-Säule und zentrifugieren Sie die Säule. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie das Filtrat.Geben Sie weitere 4,5 Milliliter der gleichen Mischung auf die gleiche Säule und zentrifugieren Sie die Säule. Entsorgen Sie den Durchlauf. Für die erste Waschung geben Sie 3,5 Milliliter 70 % Ethanol auf die Midi-Säule und zentrifugieren Sie die Säule.Nach dem Zentrifugieren entsorgen Sie das Filtrat. Für die zweite Waschung geben Sie weitere 3,5 Milliliter 70 % Ethanol auf die Midi-Säule. Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie das Filtrat.Bei der Trockenspinne die Midi-Säulen zentrifugieren, um alle Spuren von Ethanol zu entfernen. Die Midi-Säule in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. 250 Mikroliter Elutionspuffer auf die Midi-Säule geben und eine Minute warten, bevor zentrifugiert wird, um die höchstmögliche Gewinnung an viraler RNA zu erzielen.Geben Sie 500 Mikroliter RNA-Bindungspuffer zu 250 Mikrolitern RNA hinzu und wirbeln Sie die Mischung 10 Sekunden lang im Vortex. Fügen Sie 750 Mikroliter 100 %igen Ethanol hinzu und wirbeln Sie erneut 10 Sekunden lang im Vortex. Beschriften Sie anschließend eine Säule für jede Probe.Geben Sie die 750-Mikroliter-Probe auf eine Säule für die Zentrifugation und zentrifugieren Sie die Säulen. Entsorgen Sie den Durchlauf. Geben Sie die verbleibenden 750 Mikroliter auf eine Säule für die Zentrifugation und zentrifugieren Sie die Säulen.Führen Sie für die Vorwäsche 400 Mikroliter RNA-Aufreinigungspuffer in jede Säule ein und zentrifugieren Sie die Säule. Entsorgen Sie den Durchlauf. Führen Sie für die erste Wäsche 800 Mikroliter RNA-Waschpuffer in jede Säule ein und zentrifugieren Sie die Säulen.Entfernen Sie den Durchlauf. Für die zweite Waschung geben Sie 400 Mikroliter RNA-Waschpuffer zu jeder Säule hinzu und zentrifugieren Sie diese. Entfernen Sie den Durchlauf.Bei der Trockenspinne die Säule zentrifugieren, um alle Spuren des Waschpuffers zu entfernen. Überführen Sie die Säule vorsichtig in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 25 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säule und inkubieren Sie die Säule für eine Minute bei Raumtemperatur, um die Rückgewinnung viraler RNA aus der Säule zu erhöhen.Sammeln Sie die RNA durch Zentrifugation der Säule bei 10.000 × g für eine Minute. Fahren Sie anschließend direkt mit der Echtzeit-PCR fort. Vor dem Fortfahren mit der multiplex Echtzeit-RTPCR reinigen Sie die Arbeitsflächen, Pipetten und Zentrifugen mit einer RNase-Entkontaminierungslösung.Tauen Sie die Reagenzien für die Echtzeit-PCR auf Eis auf. Tauen Sie die RNA-Probe in einem separaten Bereich ebenfalls auf Eis auf. Bestimmen Sie die Anzahl der Reaktionen und bereiten Sie mindestens 10 % mehr Reagenz für die Master-Mix-Lösung vor, um Verluste während des Pipettierens ausgleichen zu können.Vortexen Sie anschließend die einzelnen Komponenten der Master-Mix-Lösung fünf Sekunden lang. Mischen Sie das Enzym vorsichtig, indem Sie das Röhrchen anstoßen. Zentrifugieren Sie die Komponenten der Master-Mix-Lösung kurz für fünf Sekunden.Dann bereiten Sie die Master-Mix-Lösung zur RTPCR-Detektion von Norovirus G1 und G2 gemäß den Anweisungen des Kits vor und geben norovirusspezifische Oligonukleotidprimer und -sonden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend mischen Sie die Master-Mix-Lösung durch siebenmaliges Auf- und Abpipettieren. Portionieren Sie 22 Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jedes Loch der Echtzeit-PCR-Platte.Vortexen Sie die Proben-RNA fünf Sekunden lang und sammeln Sie den Inhalt durch fünfssekündige Zentrifugation. Geben Sie drei Mikroliter Proben-RNA-Positivkontrollen und 10-fache serielle Verdünnungen der G1- und G2-RNA-Transkripte in die Echtzeit-PCR-Platte. Fügen Sie drei Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Negativkontrollen („no template control“ oder NTC) hinzu.Das Plate mit optischer Haftfolie versiegeln. Das Plate vorsichtig bei 1.300 × g eine Minute lang zentrifugieren, um eventuelle Luftblasen oder Flüssigkeitstropfen in den Vertiefungen zu entfernen. Anschließend die Echtzeit-PCR einrichten und die Thermocycling-Bedingungen eingeben.Bestimmen Sie die Standardkurven für die Transkripte G1 und G2. Wandeln Sie die Ct-Werte mithilfe der jeweiligen Standardkurve in RNA-Kopien um. Berechnen Sie die Gesamtanzahl an RNA-Kopien pro Probe, indem Sie das Verhältnis des Volumens des gesamten RNA-Eluats zu der Gesamtmenge an RNA verwenden, die für den Echtzeit-Assay eingesetzt wurde.Um die noroviruspositiven Proben mittels hemi-nested konventioneller RTPCR zu genotypisieren, bereiten Sie zunächst einen Master-Mix für die erste RTPCR-Runde vor und geben 20-Mikroliter-Aliquote in vorbeschriftete PCR-Röhrchen ab. Geben Sie fünf Mikroliter RNA zu jedem Röhrchen hinzu. Nach Abschluss der ersten RTPCR-Runde bereiten Sie einen Master-Mix für die hemi-nested zweite PCR-Runde vor, indem Sie 23-Mikroliter-Aliquote in neue Röhrchen abgeben. Fügen Sie abschließend zwei Mikroliter des PCR-Produkts der ersten Runde zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Die Abstrichmethode mit makrofoambasierten Tupfern wurde im Feld an Proben getestet, die von einem Kreuzfahrtschiff gesammelt worden waren, auf dem Fälle einer vermuteten Norovirus-Gastroenteritis gemeldet worden waren. Vier der 17 Norovirus-positiven Abstrichproben konnten typisiert werden, und alle Proben wiesen identische G2-Sequenzen auf.Die Bestimmung der Viruslast ermöglichte die Bewertung von stark kontaminierten Oberflächen, wie zum Beispiel Toilettensitzen. Der Zusammenhang zwischen den Cycle-Threshold- oder Ct-Werten wurde mittels Echtzeit-RTPCR hinsichtlich der Fähigkeit, diese Proben zu sequenzieren, untersucht. Insgesamt waren 127 von 217 Abstrichproben positiv auf G2-Norovirus getestet. Abstrichproben mit Ct-Werten zwischen 24 und 27 sowie zwischen 28 und 31 wurden zu 100 % bzw. 72,2 % genotypisiert. Im Gegensatz dazu konnten nur 22 % und 1,6 % der Abstrichproben mit Ct-Werten zwischen 32 und 36 bzw. 37 und 40 erfolgreich sequenziert werden. Wie wir gezeigt haben, ermöglicht dieses Protokoll die Bestimmung des Ausmaßes der Umweltkontamination während Norovirus-Ausbrüchen, den Nachweis der möglichen Ursache eines Ausbruchs, wenn klinische Proben nicht verfügbar sind, sowie die Beurteilung der Wirksamkeit von Reinigungsmaßnahmen.Für das genaueste Ergebnis ist es sehr wichtig, dieses Protokoll genau befolgen, um die Variabilität der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Proben zu minimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein Ein-Schritt-RT-PCR-Assay zum Nachweis und zur Genogruppe Identifizierung von Norovirus Isolate von Kindern der Stuhl, die Primer und TaqMan-Sonden spezifisch für die offenen Leserahmen 1 (ORF1)-ORF2 Übergangsregion, die am stärksten konservierte Region des Norovirus Genom verwendet beschrieben. Eine nicht-kommerzielle, kostengünstige RNA-Extraktion-Methode wird ausführlich beschrieben.

Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirusvirus-ähnlichen Partikeln (VLPs) an menschliche Darmbakterien. Die bakteriellen Suspensionen werden mit den VLPs vermischt und inkubiert, um die Bildung von VLP-Bakterienkomplexen zu ermöglichen. Die Komplexe werden dann mit Fluorophor-markierten VLP-spezifischen Antikörpern markiert, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Visualisierung und Quantifizierung, um den Prozentsatz der VLP-gebundenen Bakterien zu...

Ein Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirus-VLPs an Darmbakterien

EPA-Methode 1615 verwendet einen elektropositiven Filter, um Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwasser zu konzentrieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zur Entnahme von Proben für Analysen nach Methode 1615.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

Hier stellen wir ein Verfahren zur Messung der gesamten kultivierbaren Viren anhand der Buffalo Green Monkey Nierenzelllinie vor. Das Verfahren stellt ein standardisiertes Instrument zur Messung des Vorkommens infektiöser Viren in Umwelt- und Trinkwassern zur Verfügung.

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Ein Citizen-Science-Projekt wurde entwickelt, um Einwohner von San Diego zu rekrutieren, um Umweltproben für SARS-CoV-2 zu sammeln. Für die Datenübermittlung über eine benutzerfreundliche Oberfläche für mobile Geräte wurde eine mehrsprachige webbasierte Plattform geschaffen. Ein Laborinformationsmanagementsystem erleichterte die Entnahme von Tausenden von geografisch unterschiedlichen Proben mit Echtzeit-Ergebnisverfolgung.

Swabbing the Urban Environment - Eine Pipeline zur Probenahme und zum Nachweis von SARS-CoV-2 aus Umweltreservoirs

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Übung ist in der Lage die Apoptose in Immunzellen. Es gibt verschiedene Mess-Beschränkungen, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung. Nachgewiesene ist eine schnelle und minimal-invasives Verfahren für die Analyse von belastungsinduzierten Lymphozyten Apoptose.

Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose

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Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

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