Name: Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Expression von Plasmid-DNA in Mäusehaut mittels Acufection. Dieses Verfahren ermöglicht Forschern die Untersuchung immunologischer Gene bei Hautentzündungen.

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Diese Arbeit wurde von Finanzhilfe aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048) unterstützt. Wir danken Drs. Betty Wu-Hsieh und Chien-Kuo Lee an der NTU, Leigh Zerboni an der Stanford University und Dr. Peter Hoffmann an der Universität von Hawaii für das Manuskript zu lesen, Yun Chien an der NTU für die technische Unterstützung und Dr. Wen-Chi Wei in Landwirtschaft Biotechnologie Research Center an der Academia Sinica für technische Beratung.

Weibliche Mäuse in 8 bis 12 Wochen alt wurden für diese Studie verwendet. C57 / BL6 - Wildtyp (WT) und IL-15 defiziente (IL - 15 - / -) Mäuse wurden von National Laboratory Animal Center (NLAC) erworben, Taiwan und Taconic Farm, respectively. IL-15-defiziente (IL - 15 - / -) und IL-15-dominant (IL - 15 IL - 15 und +/- + / +) zeigten ein Verhältnis 1: 3 in der zweiten Generation aus der Kreuzung von IL - 15 +/- Heterozygoten. Der Genotyp von IL - 15 - / - Mäuse wurden durch PCR - Analyse bestätigt. Die Mäuse wurden in der Spezifische pathogenfreie (SPF) Anlage im Labor Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine gehalten. Alle Tierverfahren einschließlich der Betäubung Materialien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Tier Protokoll, das von der National Taiwan University College of Medicine und der Hochschule für Public Health Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) (Affidavit der Genehmigung des Tier Protokolls 20130225) genehmigt durchgeführt. &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Herstellung von Akupunkturnadeln HINWEIS: Akupunkturnadeln sind Medizinprodukte, bestehend aus einem Handgriff und einem Nadelende (1A). Die Durchmesser der Akupunkturnadel lag im Bereich von 0,2 mm (36 G) bis 0,35 mm (28 G). Wir wählen den besten Punkt der Nadel während Einstechen in die Haut mögliche übermäßige Zellschäden zu vermeiden. Es gibt 4 verschiedene Längen der 0,2-mm-Nadel einschließlich 13 mm (0,5 Zoll), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 Zoll) und 50 mm (2,0 in) in der Länge. Ein Bündel aus 10 Nadeln mit 13 mm Länge bereitgestellt, um den besten bequemen Griff während des Nadel Oszillieren auf C57BL / 6-Mäusehaut. Die Parameter können geändert werden, wenn das Verfahren auf die Haut von größeren Tieren angewandt wird oder von den Forschern mit größeren Händen durchgeführt. <ol><li> Entfernen Sie Akupunkturnadeln aus dem sterilen, pyrogenfreien Paket. Legen Sie die Nadeln auf einem sterilen Tuch. </li><li> Verwenden Klebeetikettenband 10 Nadeln zusammenzubinden ina Bündel (1B). HINWEIS: Die Nadeln 10 sind geometrisch angeordnet, um eine Zylinderform zu bilden. Der Einfachheit halber wird ein Stück Paraffinfilm verwenden, um die Anordnung zu stabilisieren, bevor das Klebeband aufgebracht wird. Stellen Sie sicher, dass alle Nadelspitzen auf der gleichen Ebene liegen. ein Bündel anstelle einer einzelnen Nadel erleichtert maximale DNA Infusion durch den Kontaktbereich zwischen den Nadeln und der Haut zu erhöhen. </li></ol> 2. Herstellung einer großen Menge und Endotoxin-freie Plasmid-DNA <ol><li> Verwandeln chemisch kompetente Bakterienzellen mit dem Plasmid DNA. </li><li> Auswählen und inokulieren eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB - Medium , das Antibiotika und inkubieren bei 37 ° C in einem Schüttler über Nacht. </li><li> Scale - up die Kultur durch die Bakterienkultur in 1 verdünnt: 100 in 250 ml LB - Medium mit Antibiotika und Schütteln über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine große Menge an DNA, die durch eine hohe qualit Verwendungy, Endotoxin frei Plasmidpräparation Kit nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Acufection Protokoll erfordert eine hohe Reinheit und eine große Menge an Plasmid-DNA. Verwendung einer hohen Qualität, frei von Endotoxin und column-gereinigter Plasmid-DNA wird empfohlen. </li><li> Eluieren der DNA in sterilem Wasser. Shop DNA in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu seiner acufection. HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-und-Tau von DNA konsistent Plasmid-DNA-Expression zu gewährleisten. </li><li> Verdünnte Plasmid-DNA zu 1 mg / ml in sterilem PBS für acufection. </li></ol> 3. Verfahren für die Acufection HINWEIS: Die optimale Menge an DNA und der Bereich der Zielhautoberfläche kann für verschiedene Gene variieren und müssen weiter optimiert werden. Die Einstichkraft und die Anzahl der Male, die Hornschicht der Haut zu lösen, auch in Abhängigkeit von der Hautdicke variieren. Diese Bedingungen müssen sorgfältig bestimmt werden, nachdem das Expressionsniveau von acufected Gen transcri Bewertungpts durch qRT-PCR. <ol><li> Wiegen der Mäuse und verabreichen Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) durch peritoneale Injektion. HINWEIS: 2,2,2-Tribromethanol ist ein injizierbares Narkosemittel, das bei Mäusen häufig verwendet wurde. Lösungen werden durch Lösen eines nicht pharmazeutischem Grad 2,2,2-Tribromethanol (2,5 g) in destilliertem Wasser (200 ml), enthaltend 2,5% 2-Methyl-2-butanol hergestellt. </li><li> Verwenden vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. HINWEIS: - 2 min betäubende Wirkung wird in 1 induziert werden. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex vor dem Betrieb eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten. </li><li> Shave die dorsale Flanke und die Haut anwenden Enthaarungscreme Keratinproteinen in der Haarschaft zu lösen. HINWEIS: Die Verwendung von Enthaarungscreme Haare entfernen wird die Infusion von DNA in die Haut erleichtern. </li><li> Verwenden Sie Wasser getränkte Wattebäusche die Enthaarungscreme abzuwischen. HINWEIS: Die Enthaarungscreme in Wasser löslich sind. Die vollständige Entfernung der Creme will eine schmierige Oberfläche verhindern und eine bessere stech Ergebnis zu gewährleisten. </li><li> Verwenden ein steriles Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt, um die Hautoberfläche zu desinfizieren. </li><li> Markierung des Zielbereich (1 cm x 1 cm) auf der enthaarten Haut mit einer vorgemessenen Schablone. HINWEIS: Um die Zielstelle Kennzeichnung wird dazu beitragen, das Nadelbündel nach oben und nach unten innerhalb eines definierten Bereichs anzuwenden. Dies ist wichtig, Lieferung der gleichen Menge an DNA zu einer spezifischen Oberfläche, um sicherzustellen, Experiment zu Experiment Variation zu minimieren. </li><li> Legen Sie eine 10 uL Tropfen von Plasmid-DNA (10 ug) auf die markierte Haut. HINWEIS: Die Menge an DNA für acufection variiert mit verschiedenen Genen und dem Typ des Expressionsvektors. Die Menge an DNA verwendet wird, sollte sorgfältig titriert werden, bevor das Experiment von Interesse durch. Die 10 &amp; mgr; L ist ein kleiner Flüssigkeitstropfen und es sitzt gut auf dem rasiert und enthaart Haut ohne rollten während Einstechen. Umfassen eine Kontrollgruppe von Mäusen, die mit 10 &amp; mgr; l leeren Vektor DNA behandelten Mäusen mit einem zum Vergleichmit der Studie Gen cufected. </li><li> Halten Sie die Akupunkturnadel Bündel (1B) und stechen die markierte Oberfläche mit einer Auf- und Abbewegung zu 100 - mal oder bis die Feuchtigkeit von DNA in PBS auf die Haut verschwindet. HINWEIS: Einige Rötung der Hautoberfläche auftreten kann. Vermeiden Sie tiefe Schnitte zu machen, die bluten. Die Anzahl der Auf- und Abbewegungen auf der Hautoberfläche Einstechen ist funktionsfähig bestimmt, wenn die Feuchtigkeit von DNA in PBS (10 ul) verschwindet auf der Haut. Wir entschieden uns 100 mal in 30 s, weil es die meisten konsistente Ergebnisse aus acufection-gelieferten Gene gegeben hat. Gegebenenfalls können die Nadeln bis zu 6 Zielhaut pricks (1 cm x 1 cm je) wiederverwendet werden. Spülen Sie die Nadeln in 70% Ethanol und PBS zwischen acufection. Wechseln Sie in neue Nadeln, wenn sie stumpf oder für verschiedene Plasmid-DNA sind eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Platzieren acufected Mäuse auf einem Heizkissen, die Körpertemperatur, bis wach zu halten. </li><li> Rück Mäuse in ihren Käfig, wenn siewieder genügend Bewusstsein. Hinweis: Halten Sie acufected Mäuse in separaten Käfig (weniger als 5 Tiere pro Käfig) aus dem Käfig von un-acufected Mäuse. </li><li> Setzen Sie Wasserflasche an Ort und Stelle und gibt den Käfig mit dem IVC (einzeln belüfteten Käfig) Rack. </li></ol> 4. postoperative Pflege <ol><li> Für die ersten 48 Stunden nach dem Eingriff, genau überwachen Mäuse für irgendwelche Beschwerden einschließlich Verhaltensänderungen (Unruhe, Erregung oder Essstörung) oder Auffälligkeiten (grobe Behaarung oder gekrümmte Haltung). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) Behandlung von IL-15ΔE7-acufected Haut HINWEIS: Transkriptions-Expression und Proteinproduktion von acufected Genen nachweisbar ist am 3. Tag Mäusen acufected mit dem Plasmid von Interesse kann mit verschiedenen Arten von Stimulanzien 3 Tage nach der Transfektion behandelt werden. Wir zeigen hier durch die IL-15ΔE7-acufected Mäusehaut mit IMQ Creme behandeln. IMQ ist ein imidazoquinolin Amin zugelassen foder Behandlung von externen Genitalwarzen und perinatale 13. Topische IMQ Behandlung wird gezeigt mit der Manifestation der schuppigen Haut, epidermale Proliferation und dermalen Neutrophileninfiltration 12, 14, 15 Human Psoriasis-ähnlichen Hauterkrankungen bei Mäusen zu induzieren. HINWEIS: Der Plasmidvektor enthalten Volllängen-Maus-IL-15-cDNA unter der Regulation der Elongationsfaktor-1 α (PEF), flankiert mit einer IL-2-Signalpeptid und ein FLAG-Tag am C-Terminus (pEF-IL- 15, 5859 Basenpaare), die von Bamford et al , wie beschrieben konstruiert. 16. Das Plasmid wird als ein IL-15-Vorlage verwendet, um die ersten 16 Aminosäuren an den Resten 33 zu löschen - 48 in Exon 7 des IL-15-Gen für IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 Basenpaare) durch SOE (Synthese durch Overlap - Extension) PCR - Verfahren 17. Bakterienkolonien, die waren erfolgreichtransformiert mit IL-15ΔE7 wurden durch Restriktionsenzymverdau und DNA - Sequenzieren , gefolgt von 12, 18 überprüft. Eine große Menge von Endotoxin-freien Plasmid-DNA wurde in dem Protokoll Schritt 2 beschrieben, hergestellt. <ol><li> Anesthetize acufected Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) und gelten vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex auf eine ausreichende Tiefe der Anästhesie vor dem Beginn der operativen Verfahren zu gewährleisten. Hinweis: Da eine 2 cm x 2 cm der Haut wird für IMQ behandelt werden, 2 Dosen von pIL-15ΔE7 Plasmid-DNA (10 ug in 10 ul PBS pro Dosis) auf 2 Zielstellen acufected (1 cm x 1 cm pro Stück). </li><li> Mark Flankenhaut (2 cm x 2 cm), die den acufected Bereich. </li><li> Verwenden Q-tip Applikator topisch IMQ Creme auf der markierten Oberfläche anzuwenden. Hinweis: Schritt 5.1 wird nur für die erste Dosis durchgeführt (60 mg / Dosis).Die nächsten aufeinanderfolgenden Dosen werden nicht-narkotisierten Mäusen angewandt. </li><li> Dokumentieren Sie die Änderungen von IMQ behandelten Rückenhaut täglich mit einem High-Definition-Camcorder. Hinweis: Eine Person hält die Maus, während ein anderes aufnimmt. Standbilder werden geschossen und zu einem späteren Zeitpunkt bearbeitet werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch eine Überdosis von Tribromethanol (800 &amp; mgr; g pro Gramm Körpergewicht) Injektion, gefolgt von Genickbruch am Tag 4 oder Tag 7 nach IMQ Behandlung. Die Haut wird ausgeschnitten und verarbeitet (Schritte 4,1-4,5). </li></ol> 6. Homogenat von Mäusehaut <ol><li> Verwenden, um eine chirurgische Schere einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes zu machen. Verfahren bilateral an die Basis der hinteren Gliedmaße und weiterhin vertikal entlang der Flanke mit der Basis des Vorderbeins schneiden. </li><li> Vorsichtig die Haut von dem darunterliegenden Gewebe von posterior zum anterioren. Verwenden Sie die Schere die dorsale Haut abzuschneiden. Legen Sie die Haut auf einer sterilen Petrischale. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell Ziel auszuschneidenHaut und in flüssigem Stickstoff sofort einzufrieren. Anmerkung: Die gleiche Größe acufected Haut ohne (1 cm x 1 cm) oder mit IMQ Behandlung (2 cm x 2 cm) wird für jede Maus befestigt zu minimieren Experiment zu Experiment Variationen. </li><li> Das tiefgefrorene Hautgewebe in der Mitte eines vorgekühlten 2-Kammer-Mörtel mit Griffen und einem Stößel. Verwenden Sie einen Bleihammer auf dem Mörtel um das Gewebe zu pulverisieren. </li><li> Schnell platzieren das pulverisierte Gewebe in ein neues Röhrchen 500 ul Zelllysereagenz zur RNA-Extraktion oder in ein Röhrchen, das 50 ul PBS und 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail enthält Proteinlysat zu erhalten. </li></ol> 7. H &amp; E und immunhistochemische Färbung von Haut Section <ol><li> Platzieren Sie die Hautgewebe in einer Kassette und tauche sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht. </li><li> Einbetten und Gewebeschnitt, die in unserem Fall durch das Pathologie-Labor an der LAC, NTU durchgeführt wurden. Hinweis: Der Abschnitt in einer Dicke von 5 um geschnitten. Platz Gewebe Abschnitons auf positiv geladene Objektträger. </li><li> Wärme , um die Objektträger bei 65 ° C für 15 min. </li><li> Legen Sie die Folien in einer Färbebank. Tauchen Sie die Zahnstange in der entsprechenden Behältern enthalten Xylolersatz zweimal für 5 min, gefolgt von aufeinanderfolgenden Eintauchen in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% und 50% Ethanol (jeweils 5 min) zur Rehydratisierung. Tauchen Sie die Objektträger in Leitungswasser für 3 Minuten vor der Färbung. </li><li> Führen Sie Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Hinweis: H &amp; E-Färbung wurde an der LAC, NTU auf Anfrage bei Pathology Laboratory durchgeführt. </li><li> Für immunhistochemische Färbung, blockieren den Abschnitt mit Blocklösung bei Raumtemperatur für 5 min nicht spezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Hinweis: Die Blocklösung wird im Handel mit Immunfärbungstechniken entwickelt. Kein Tierserum ist in diesem Produkt enthalten sind. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in PBS die Blocklösung auszuspülen. </li><li> Verdünne die Blocklösung in PBS bei 1:10 und fügen 2% fötalen Rinderserum (FBS) (Verdünnungslösung). </li><li&gt; Pipette der in geeigneten primären Antikörper auf den Abschnitt verdünnt und für 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Die Antikörper werden in Verdünnungslösung verdünnt. Die Antikörperkonzentrationen für diese Färbung wurden bei 1 optimiert: 800 und 1: 200 für Ki67 (Klon SolA15) und Ly6G (Klon 1A8) verbunden sind. Diese Konzentrationen gefunden werden, ohne Hintergrundfärbung deutlichen Fleck zeigen. <ol><li> Befleckt einen seriellen Abschnitt im gleichen Durchlauf mit der gleichen Lösung des primären Antikörper verzichtet wird, um nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu steuern. </li></ol></li><li> Wasch gleitet dreimal in TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST-Lösung) für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen. </li><li> Pipette einen Tropfen von markierten Polymeren zu jedem Abschnitt und inkubiere bei Raumtemperatur für 40 min. Hinweis: Das markierte Polymer durch Kombination von kommerziell Aminosäurepolymere mit Peroxidase und sekundärem Antikörper hergestellt wird, die zu einem Fab&#39;-Fragmente reduziert wird. Das Reagenz ist bereit für die Verwendungimmunhistochemische Färbung von Maus-Gewebeschnitten. </li><li> Wash gleitet dreimal in TBST für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen. </li><li> Pipette 3,3&#39;-diaminobenzindine tetrahydrochlorid (DAB) Lösung auf Gewebeschnitt und läßt bei Raumtemperatur stehen, bis ein brauner Niederschlag unter einer Hellfeldmikroskopie sichtbar ist. Hinweis: Die Zeit für DAB in Gegenwart von Peroxidase zu fällen ist etwa 30 min. </li><li> Tauchen Sie gleitet in Wasser zu Peroxidase-Aktivität zu stoppen. Dip Slides in Methyl grüne Lösung für die Kernfärbung. Wash gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Platzieren ein Deckglas über den gefärbten Abschnitt, der mit permanentem Befestigungsmedium (8 &amp; mgr; l pro Abschnitt) abgedeckt ist. </li></ol> 8. Foto und Analyse von gefärbten Gewebeschnitten <ol><li> Visualisieren H &amp; E gefärbt und IHC Gewebeschnitte unter einem Hellfeld-Mikroskop. Erfassen von Bildern unter Verwendung von ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) Kamera an das Mikroskop angebracht ist. für qengenAnalyse können Bildverarbeitungssoftware verwendet werden, <ol><li> Scannen Sie die ganzen gefärbten Schnitten eine Scanscope mit einem 20x-Objektiv verwendet wird. </li><li> Messen Sie die epidermale Dicke im 1-mm-Segment der Epidermis und die Anzahl der Ki67-immunoreaktive Zellen innerhalb des Segments zählen. HINWEIS: Die quantitative Analyse wird unter Verwendung von Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software durchgeführt. Epidermisdicke wird durch den Abstand zwischen der Basalschicht und der äußersten Schicht der Epidermis definiert. </li><li> Zähle die Anzahl der Ly6G-immunoreaktive Zellen in der dermalen Bereich (230 x 270 um2 Rechteck) unmittelbar unter topischer IMQ behandelten Haut. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Der kritischste Schritt die Expression des acufected Plasmid-DNA, um sicherzustellen, ist gleichmäßig zu schwingen und die Hornschicht der Haut zu lösen. Während die Nadeln drückt sanft, ohne die Haut zu schneiden, sollte die Kraft stark genug sein, um die Oberfläche zu drücken. Zur Erleichterung der Aufnahme von DNA in 10 &amp; mgr; l Lösung auf einer 1 cm x 1 cm Oberfläche, sollten die Nadeln oszillieren up-and-down für etwa 100-mal in 30 s. Man kann die Kraft bestimmen, die die Haut stechen muss und durch die Anzahl ...

Die Haut ist die erste Linie der Verteidigung des Wirts. Keratinozyten (KCS) ist der Hauptzelltyp in der Haut von Menschen und Mäusen. Als Reaktion auf Umweltreize (zB Sonnenlicht, Sauerstoff, Chemikalien und pathogene invasion) wird KCs aktiviert , und eine Vielzahl von proinflammatorischen Zytokine und Chemokine, wie IL-8 produzieren, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α und GM-CSF - 1. Gemeinsam lösen sie die Rekrutierung von Immunzellen auf der Haut. VERSCHLIMMERT kutanen Entzündung ist oft mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen , einschließlich akut ectopic Kontaktdermatitis und chronischen T - Zell-vermittelte Entzündung (zB allergische Kontaktdermatitis und Psoriasis) 2 verbunden. proinflammatorischen Reaktionen in der Haut modulierenden durch KC Aktivierung Hemmung ist ein plausibler Ansatz Hautentzündung zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz zur transient ein Zytokin-Gen in den Epidermis, um auszudrücken Immun res zu studierenponse Folge einer solchen Behandlung in der Haut. Die Epidermis bildet die oberflächliche Schicht der Haut. Es dient als physikalische Barriere zu halten externe Substanzen, wie Nukleinsäuren und Pathogenen aus den tieferen Schichten der Haut eintritt. Mehrere nadelfreie Techniken wurden für DNA - Transfer epidermalen 3, 4 aufgebaut. DNA in Lösung oder in Verbindung mit kationischen Liposomen oder Adenovirusvektoren wurde an die Epidermis mit Techniken modifiziert wie die Entfernung des Stratum corneum oder die Behandlung mit depilating Reagenz direkt angewendet. Die Entfernung des Epithels verhornten erleichtert DNA die epidermalen Barriere und Interaktion mit Keratinozyten und Langerhans&#39;schen Zellen kreuzen 5 - Immunantworten zu induzieren. Während eine große Oberfläche für die DNA-Transfer zur Verfügung steht und dieser Ansatz ist nicht mit Nadeln, gibt es einschließlich Nachteile der Anforderungfür die großen Mengen an DNA (10-100 ug), harter Behandlung auf der Haut durch Strippen und die inkonsistenten Ergebnisse der Immunantwort in den immunisierten Tieren ohne DNA - Abgabe Booster 6 induziert wird . Mikroteilchen-vermittelte intrazelluläre Abgabe nackten DNA auf die Haut wurde zum Induzieren von Immunantwort , 7, 8 sehr leistungsfähig und reproduzierbar erwiesen. Tragbares Genkanone verwendet worden ist, die Haut Zielstelle mit Plasmid - DNA-beschichteten Goldteilchen 2 &amp; mgr; m-Durchmesser in der Größe mit Hilfe von Druckluft Heliumstrom 9 zu bombardieren. Der Plasmid - DNA wird vermutlich durch KCsand dendritische Zellen (DCs) in der Haut und das Protein aufgenommen wird lokal ausgedrückt , oder 10 bis ableitenden Lymphknoten von DCs transportiert wird. Obwohl die Gen - Kanone System ist einfach und erfordert begrenzte technische Erfahrung, die Kosten für die Herstellung und Lieferung des &quot;DNA - bullassen &quot;(dh Goldpulver, Heliumgas) und für die Gen - Kanone selbst seine allgemeine Geltung hat beschränkt. Darüber hinaus die Leichtigkeit des Genkanone Transports die Forderung nach einem Heliumgas - Abgabesystem begrenzt , wenn die Experimente an verschiedenen Orten durchgeführt werden. Microseeding ist 11 eine höhere Effizienz des Gentransfers als Einzelinjektion und Teilchenbeschuss gezeigt zu erreichen. Microseeding eine Tätowierung Pistole verwendet , ohne die Verwendung von Partikeln Wülste 11. Oszillieren der Mikronadel auf der Haut ist mit diesem Ansatz DNA auf die Haut zu liefern wahrscheinlich direkt die Zellmembran schaben und so DNA zu mehreren Zellen gleichzeitig übertragen. jedoch mit der großen Anzahl von Injektionen verbundenen Schmerzen mit 0,254 mm Durchmesser Nadeln ein Nachteil ist. Hier bieten wir einen alternativen Ansatz zur DNA - Verabreichung in vivo. Die „acufection“ </strOng&gt; Protokoll wir hier beschrieben wird, liefert eine wirtschaftliche und effiziente Weise Plasmid-DNA in Mäusehaut zu liefern. Kurz gesagt, wurden zehn Akupunkturnadel (0,2 mm Durchmesser x 13 mm Länge) in einem Bündel durch ein Klebeband gebunden. Ein Volumen von 10 &amp; mgr; l PBS mit 10 ug Plasmid-DNA, die das Transgen von Interesse enthält, wurde auf der rasierten, Enthaarungscreme behandelter Flanke Haut platziert. Durch die Verwendung von Bündel der Akupunkturnadel, die Oberfläche (1 cm x 1 cm) der Haut, die Keratine an der Hornschicht zu oszillieren wurden gelöst und die Plasmid-DNA auf die Oberfläche aufgebracht wurde, in die Epidermis absorbiert. Hautschäden wurden überwacht und minimal sein gefunden. Die Expression des transfizierten Gens in der acufected Haut wurde sowohl durch quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA bestätigt. Die immunmodulatorische Wirkung von acufection-lieferte IL-15ΔE7 auf kutane Entzündung wurden unter Verwendung des IMQ behandelter demonstriert Mausmodell 12. Während acufection beweist eine einfache und weniger dema seinnden Verfahren zur DNA - Verabreichung in vivo, hat sie die optimale Menge an DNA für verschiedene Gene und die Zeiten , um die Haut stechen sorgfältig optimiert werden , um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Medizinprodukt</td></tr><tr><td>NairTM Lotion</td><td>Church & Dwight</td><td>N/A</td><td>Zur Haarentfernung verwenden</td></tr><tr><td>Shandon Xylin Ersatz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Entparaffinierung</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Lösungsmittel zum Auflösen von Avertin</td></tr><tr><td>DifcoTM LB Brühe, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Vermehrung und Erhaltung von E. coli für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Maus IL-15/IL-15R Komplex ELISA Ready-SET-Go kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Messung des IL-15-Proteins</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G</td><td>BioLegend 127601</td><td></td><td>Antikörper zur immunhistochemischen Färbung</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Antikörper zur Messung immunhistochemischer Farbstoff</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagenz zum Blockieren des Hintergrundsignals in Maus-auf-Maus-Färbung</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase (HRP) Substrat Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Peroxidse-Substrat für immunhistochemische Färbung</td></tr><tr><td>Ultra V Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Reduzieren Sie unspezifische Hintergrundfärbungen</td></tr><tr><td>Methylgrün</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Dauerhafte Konservierung histochemischer Färbungen</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Hemmung der Proteaseaktivität im Zelllysat</td></tr><tr><td>Aldara Creme</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% Imiquimod Creme</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Verwendung zur Pulverisierung von Hautgewebe</td></tr><tr><td>ABI7900HT Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>quantitativer real-time PCR Assay</td></tr><tr><td>Camcorder</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Bilddokumentation</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Hellfeldmikroskopie</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines wirtschaftlich dna delivery system von „acufection“ und seine anwendung auf die hautforschung

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation der Immunantwort in der Haut ist mit zahlreichen menschlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht. Ein direkte Übertragung von immunbezogenen Genen in Hautgewebe ist ein faszinierender Ansatz Immunmodulation von Hautentzündung in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein kostengünstiges Protokoll, die nackte DNA in Mäusehaut geliefert und führt zu einem Transgen-Expression. Das Verfahren wird geprägt „acufection“, bezeichnet ACU Punktur-vermittelter DNA trans fektion. Zur Durchführung acufection, Mäusehaut wurde zuerst mit DNA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend gespitzt leicht mit einem Bündel von Akupunkturnadeln infundiert die Aufnahme von DNA und Transfektion in Zellen zu erleichtern. Der Plasmid-DNA wird vermutlich durch die Keratinozyten und dendritischen Zellen (DCs) in der Haut und in dem Protein exprimiert aufgenommen. Mechanische Stich mit der Nadel per se nicht Hautschäden verursachen oder Keratinozyten - Aktivierung induzieren. Der Ausdruckdie transfizierten Gene wurde sowohl für 2 Tage nach acufection Transkriptions- und Translationsniveau in der Haut detektiert und gehalten bis 7 Tage. Das primäre Ziel für die Entwicklung dieser acufection Methode war eine zuvor nicht definiert Isoform von IL-15 zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahren wird eine alternativ gespleißte IL-15-Isoform mit teilweise deletierten Exon 7 (IL-15ΔE7) wurde in der Haut exprimiert und anschließend mit einem Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) -Agonisten, Imiquimod (IMQ) behandelt, um Entzündung zu induzieren. Acufection-lieferte IL-15ΔE7 in der Haut unterdrückt Keratinozytenproliferation, epidermale Dicke und neutrophile Rekrutierung in IMQ-induzierte Hautentzündung. Mit zunehmendem Interesse der Regulationsmechanismen der Hautentzündung bei der Identifizierung beschriebenes Protokoll hier bietet eine kostengünstige und vielseitige Alternative zu dem Genkanone System oder Microseeding zur DNA - Verabreichung in vivo. Es kann möglicherweise Entdeckung der Funktion eines neuen erlaubenGene in der Haut oder für neue Behandlung für Hautkrankheiten zu untersuchen.

Während einige Rötung innerhalb der ersten Stunde nach dem Einstechen mit Akupunkturnadeln evident war, die Haut am Tag 2 und kein nachteiliger Hautreaktionen 7 bis Tag gelöscht wurde nach Einstechen (2A) beobachtet. Nadeleinstich sehr niedriges Niveau von epidermalen Orthokeratose und minimaler dermalen Infiltration von H &amp; E - Analyse im Vergleich zu unbehandelter Haut (2B) induziert. Die Dicke der Epidermis <strong class=...

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben.

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, immunrelevante Gene in das Hautgewebe einzubringen, um die funktionelle Rolle eines bestimmten Gens bei einer kutanen Entzündung zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, die Funktion eines neuartigen Gens in der Haut zu entschlüsseln, beispielsweise für die Entwicklung neuer Therapien bei kutanen Erkrankungen wie Psoriasis.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine kostengünstige Möglichkeit bietet, Plasmid-DNA in der Maushaut zu exprimieren. Um die Plasmid-DNA vorzubereiten, impfen Sie drei Milliliter LB-Medium, das mit Antibiotikum ergänzt wurde, mit der zuvor transformierten und ausgewählten Bakterienkolonie an. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Schüttelinkubator.Nach der Übernacht-Inkubation die Bakterienkultur in 250 Milliliter LB-Medium verdünnen, das mit Antibiotika ergänzt wurde, um die Kultur zu vergrößern. Die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Ein qualitativ hochwertiges endotoxinfreies Plasmidpräparationskit verwenden, um eine große Menge DNA herzustellen.Verdünnen Sie die gewonnene Plasmid-DNA in steriler PBS-Pufferlösung auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Nach der Anästhesie des Mäuschens tragen Sie einen tierärztlichen Augen- und Augenpflegebalsam auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Rasieren Sie anschließend die Haut auf dem Rücken des Tieres. Und tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um die Keratinproteine in den verbleibenden Haarschäften aufzulösen. Nach der Enthaarung entfernen Sie die Creme mit wassergesättigter Baumwolle. Desinfizieren Sie die Hautoberfläche mithilfe eines sterilen Wattestäbchens, das in 70 %igem Ethanol getränkt ist, und markieren Sie den Zielbereich der Haut mit der zuvor vorbereiteten Schablone. Geben Sie 10 Mikroliter der DNA-Lösung, die 10 Mikrogramm Plasmid-DNA enthält, auf den gewünschten Hautbereich.Um die Maus zu akupunktieren, halten Sie die Akupunkturvorrichtung senkrecht zur Haut und stechen Sie wiederholt in die vorgesehene Fläche ein. Entweder 100-mal innerhalb von 30 Sekunden oder bis die auf die Haut aufgetragene Lösung vollständig absorbiert ist. Um einen erfolgreichen Ausdruck der Plasmid-DNA im Hautgewebe zu erzielen, ist es wichtig, nicht zu tief in die Haut einzuschneiden, und sicherzustellen, dass die DNA-Lösung gut absorbiert wird.Nach Abschluss des Verfahrens das behandelte Tier auf eine Heizplatte legen, um die Körpertemperatur bis zur Erholung von der Anästhesie aufrechtzuerhalten. Wenn die Maus ausreichend bei Bewusstsein ist, zurück in den Käfig bringen und Wasser und Futter bereitstellen. Das Tier in den ersten 48 Stunden nach dem Eingriff sorgfältig auf Anzeichen von Unwohlsein überwachen, einschließlich Verhaltensänderungen und abnormem Erscheinungsbild.Kennzeichnen Sie die Flankenhaut, die den zuvor mit IL-15deltaE7 behandelten Bereich von zwei Zentimetern mal zwei Zentimetern bedeckt. Tragen Sie anschließend mit einem Wattestäbchen Imiquimod-Creme topisch auf die markierte Fläche auf. Um tägliche Veränderungen der mit Imiquimod behandelten Rückenhaut zu überwachen, nimmt ein Forscher die Aufnahme vor, während ein zweiter Forscher die Maus sicher hält und den behandelten Bereich in das Sichtfeld der HD-Videokamera bringt.Beobachten Sie Veränderungen wie silbrige Schuppung, Plaques oder Erytheme auf der behandelten Haut. Nach der wie beschrieben durchgeführten Tötung der Maus führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen horizontalen Schnitt an der Basis des Schwanzes durch und erweitern den Schnitt beidseitig in Richtung der Basis jedes Hinterbeins. Fahren Sie anschließend mit vertikalen Schnitten entlang der Flanken fort, die bis zur Basis aller vier Gliedmaßen reichen.Lösen Sie vorsichtig die Haut vom darunterliegenden Gewebe, beginnend am Schwanz in Richtung Kopf des Tieres. Schneiden Sie mithilfe einer Schere die Rückenhaut aus und überführen Sie die gewonnene Probe in eine sterile Petrischale. Entnehmen Sie mit einem Skalpell eine geeignete Probe der Zielhaut.Anschließend sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Um das Hautgewebe zu pulverisieren, die gefrorene Probe in die Mitte eines zuvor gekühlten zweiteiligen Gewebepulverisierers mit Griffen und einem Stößel geben und mit einem Hammer auf dem Mörser arbeiten. Das pulverisierte Gewebe unverzüglich in neue Röhrchen überführen, die die für eine anschließende Analyse geeigneten Reagenzien enthalten.Beginnen Sie die Färbeprozedur, indem Sie die Objektträger mit den formalinfixierten, paraffineinbetteten Hautschnitten, die wie im Textprotokoll beschrieben hergestellt wurden, 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius erwärmen. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylol ein. Anschließend rehydrieren Sie die Objektträger über einen Ethanol-Gradienten.Spülen Sie die Objektträger abschließend drei Minuten lang mit Leitungswasser, bevor Sie sie einfärben. Für die immunhistochemische Färbung zeichnen Sie zuerst mit einem wasserfesten Stift einen Kreis um das Gewebe und inkubieren anschließend den Schnitt mit der Blockierungslösung, um eine unspezifische Hintergrundfärbung auszuschließen. Nach der Blockierung wird die Probe in PBS gewaschen.Als Nächstes pipettieren Sie den verdünnten primären Antikörper auf den Schnitt und inkubieren ihn 60 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST. Anschließend geben Sie einen Tropfen des markierten Polymers über den Schnitt und inkubieren den Objektträger 40 Minuten bei Raumtemperatur.Anschließend die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST waschen, wobei die Lösung zwischen den Waschungen gewechselt wird. Danach 100 Mikroliter DAB-Lösung auf die Gewebeschnitte geben und bei Raumtemperatur reagieren lassen, bis unter dem Mikroskop ein braunes Produkt sichtbar wird.Anschließend die Objektträger mit Wasser waschen, um die Peroxidase-Aktivität zu stoppen. Den Schnitt für fünf Sekunden mit Methyl-Grün-Lösung kontrastfärben, die spezifisch an DNA bindet. Die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen.Überdecken Sie den gefärbten Schnitt mit acht Mikrolitern permanentem Eindeckmedium und legen Sie einen Deckgläser auf. Bilden Sie schließlich die Objektträger wie im Textprotokoll beschrieben ab. Abgebildet ist hier eine Kontrollmaus und eine Maus, die eine Stunde, zwei Tage, fünf Tage oder sieben Tage vor dem Zeitpunkt der Aufnahme elektroporiert wurde.Wie hier gezeigt, verursachte die Akufektionsprozedur keine erkennbaren Hautschäden. Außerdem beeinflusste die Akufektion weder die Hautdicke noch die Anzahl der Ki67-positiven Zellen. Dies bestätigt weiter, dass die Prozedur keine Gewebestörungen oder epidermale Zellproliferation verursacht.Die Expression von CXCL-1 und IL-6 wurde mittels qRT-PCR gemessen und bestätigt die unter Akufektion beobachtete minimale Keratinozytenaktivierung. Andererseits zeigten qRT-PCR und ELISA einen deutlichen Ausdruck von IL-15 in der Haut von Mäusen, die mit dem IL-15-Gen akufiziert wurden.Schließlich verhindert die mittels Akufektion vermittelte Abgabe des IL-15deltaE7-Gens in das Hautgewebe die Entstehung schuppiger Haut und die Infiltration von Neutrophilen bei mit Imiquimod behandelten Mäusen. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 12 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, für jede Akufektion ein neues Nadelbündel sowie eine Charge hochwertiger Plasmid-DNA vorzubereiten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Virusinfektionen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Funktion eines neuartigen Gens bei der Modulation der antiviralen Immunantwort. Nach ihrer Entwicklung wird dies Immunologieforschern den Weg ebnen, die Immunantwort in der Haut zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Expression von Plasmid-DNA auf kosteneffiziente Weise in der Maushaut induziert werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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