Ein Visual Guide to Sortierung elektrophysiologischen Ableitungen Mit 'SpikeSorter'

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, Elektrophysiologen zu zeigen, wie sie das Programm SpikeSorter verwenden können, um Spikes in extrazellulären Aufzeichnungen von neuronalem Gewebe zu erkennen und zu sortieren, die mit Mikroelektrodenarrays erstellt wurden. Unser Ziel war es, eine einfache Lösung für diese Aufgabe der Spike-Sortierung mit einem Programm mit einer benutzerfreundlichen Oberfläche zu bieten. SpikeSorter kann Dateien in einer Vielzahl von Formaten lesen und bietet neben Sortier- und Datenexportoptionen eine Vielzahl von Vorverarbeitungs- und Ereigniserkennungsstrategien.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Analyse neuronaler Verhaltensweisen, die durch extrazelluläre Aufzeichnungen mit Multielektrodenarrays untersucht werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Komplexität der Aufgabe und des Mangels an Standardmethodik und objektiver Validierung Schwierigkeiten haben. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir vor dem Problem standen, unsere eigenen Aufnahmen mit 54-Kanal-Mehrelektrodenarrays zu sortieren und keine verfügbare Lösung fanden.

Um diesen Vorgang zu starten, öffnen Sie das Programm. Gehen Sie zu Datei und öffnen Sie und wählen Sie dann das Aufnahmedateiformat aus der Dropdown-Liste unten rechts im daraufhin angezeigten Dialogfeld zum Öffnen der Datei aus. Wählen Sie als Nächstes die Datei aus und klicken Sie auf Öffnen.

Klicken Sie auf OK, wenn der Lesevorgang abgeschlossen ist. Die Aufzeichnungssignale werden nun in der Anzeige der Spannungswellenform angezeigt. Wenn die Aufzeichnung ungefiltert ist und das lokale Feldpotenzial enthält, entfernen Sie es, indem Sie auf das Filtersymbol in der Symbolleiste klicken.

Wählen Sie den Hochpass-Butterworth-Filter, eine geeignete Grenzfrequenz und die Anzahl der Pole aus, und drücken Sie dann auf Ausführen.Drücken Sie OK, dann Fertig, und überprüfen Sie dann die gefilterte Wellenform im Display. Spannungssignale können überprüft werden, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten und dann ziehen. Verwenden Sie das Scrollrad, um bestimmte Funktionen zu vergrößern und wieder zu verkleinern.

Bewegen Sie den Mauszeiger über bestimmte Wellenformpunkte, um die entsprechenden Spannungswerte in der oberen linken Ecke anzuzeigen. Ein Doppelklick auf das Fenster öffnet einen Dialog, der auch verwendet werden kann, um schnell einen beliebigen Teil der Aufzeichnung zu untersuchen und bestimmte Ereignisse in Kanälen oder Clustern zu untersuchen, sobald die Ereigniserkennung und -sortierung abgeschlossen ist. Suchen Sie als Nächstes nach Kanälen, die möglicherweise fehlerhaft sind und maskiert werden müssen.

Klicken Sie auf das Symbol für die Kanalprüfung und überprüfen Sie das Diagramm. Um einen abgelegenen Kanal zu maskieren, wählen Sie entweder die Kanalnummer aus oder wählen Sie ihn aus der Problemliste aus. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie das Dialogfeld und klicken Sie dann in der Eingabeaufforderung auf Ja, um die Maskenwerte zu speichern.

Maskierte Kanäle sind in der Spannungsanzeige ausgegraut. Wechseln Sie in diesem Verfahren zur Vorverarbeitung der Ereigniserkennung, um das Dialogfeld für die Ereigniserkennung aufzurufen. Verwenden Sie den Schieberegler oben rechts, um den Rauschpegel auf den jeweiligen Kanälen zu überprüfen.

Eine sorgfältige Überprüfung der Spannungsanzeige kann auch stille oder ungewöhnlich laute Kanäle aufdecken, die maskiert werden müssen. Wählen Sie einen variablen Schwellenwert für die Ereigniserkennung aus. Der empfohlene Schwellenwertbereich liegt zwischen dem 4,0- und 6,0-fachen Rauschen.

Wählen Sie 4.5 aus. Wählen Sie die Erkennungsmethode für dynamische mehrphasige Filter aus der Dropdown-Liste aus. Legen Sie das Fenster so fest, dass es etwa halb so breit ist wie eine typische Spike-Wellenform, wobei die Werte im Bereich von 0,15 bis 0,5 Millisekunden liegen.

Wählen Sie anschließend die Ausrichtungsmethode aus, indem Sie die Option auswählen, die ein einzelnes, zeitlich lokalisiertes Feature der zu sortierenden Spitzen am besten identifiziert. Behalten Sie die Standardwerte für die anderen Optionen bei, und drücken Sie Start. Drücken Sie Fertig, um das Dialogfeld zu schließen.

Das Fenster für die Spannungswellenform zeigt die erkannten Ereignisse grau auf dem zugewiesenen mittleren Kanal an. Die Parameter für die Ereigniserkennung können basierend auf den zu diesem Zeitpunkt angezeigten Ergebnissen angepasst werden. Beispielsweise kann die Ereigniserkennung mit einem niedrigeren Erkennungsschwellenwert erneut ausgeführt werden, um mehr Ereignisse zu erkennen.

Der nächste Schritt wird normalerweise nicht vor der routinemäßigen Sortierung ausgeführt, aber es ist nützlich, ihn auszuführen, wenn Sie zum ersten Mal sortieren oder wenn Sie auf unbekannte Daten stoßen. Gehen Sie zu Sortieren, Kanäle in Cluster konvertieren, um einen einzelnen Cluster für jeden nicht maskierten Elektrodenkanal zu erstellen, wobei davon ausgegangen wird, dass jedem Kanal einige Ereignisse zugewiesen sind. Untersuchen Sie diese Cluster, indem Sie zu Cluster überprüfen, anzeigen, bereinigen und aufteilen, um ein weiteres Dialogfeld aufzurufen.

Verwenden Sie das Drehsteuerelement, um den Cluster auszuwählen, der angezeigt werden soll. Wählen Sie einen Cluster aus, der über zwei oder mehr unterschiedliche Subcluster verfügt, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neu ausrichten, um die Uhrzeit der einzelnen Ereignisse zu ändern und sie besser an die Form der Vorlage anzupassen. Drücken Sie anschließend auf Autosplit, um die Ereignisse basierend auf der Verteilung der Hauptkomponenten zu gruppieren.

Klicken Sie anschließend auf die Kontrollkästchen, um die Wellenformen in den Subclustern zu untersuchen. Verwenden Sie den Schieberegler, um die entsprechenden Wellenformen zu untersuchen. Verwenden Sie als Übung eine der kleinen geteilten Schaltflächen, um einen neuen Cluster zu erstellen und zu untersuchen.

Beachten Sie, dass der rote Cluster jetzt zwei Subcluster deutlicher zeigt, nachdem der grüne abgespalten wurde. Die Sortierung könnte auf diese Weise manuell fortgesetzt werden, aber es ist vorzuziehen, die schnellere Autosort-Prozedur zu verwenden. Drücken Sie auf Fertig und gehen Sie zu Sortieren, Automatisch sortieren.

Lassen Sie die Option Ereigniserkennung überspringen aktiviert, wenn die Ereigniserkennung bereits durchgeführt wurde, wie hier. Wenn diese Option nicht aktiviert ist, wird die Ereigniserkennung automatisch ausgeführt, wobei Parameterwerte und Auswahlmöglichkeiten verwendet werden, die vom Dialogfeld für die Ereigniserkennung übernommen wurden. Wählen Sie im Clustering-Bedienfeld unten ein Zeitfenster aus, das groß genug ist, um die gesamte Spike-Wellenform vor und nach dem Ausrichtungspunkt aufzunehmen.

Wählen Sie als Nächstes eine Neuausrichtungsoption aus, die während des Clusterings verwendet werden soll, und wählen Sie eine minimale Clustergröße aus. Entscheiden Sie sich für die Anzahl der Dimensionen im PC-Speicherplatz, die für das Clustering verwendet werden, und belassen Sie die Standardeinstellungen für andere Optionen. Drücken Sie danach Start, um die automatische Sortierung zu starten.

Nachdem die automatische Sortierung abgeschlossen ist, drücken Sie auf Weiter, um zur manuell geführten Zusammenführungs- und Teilungsphase zu gelangen, und drücken Sie dann auf Start. Im neuen Dialogfeld werden Cluster-Paare, die sich nicht eindeutig ähneln oder unterscheiden, nacheinander angezeigt. Verwenden Sie für jedes vorgestellte Paar die Schaltflächen, um auszuwählen, ob das Paar zusammengeführt, zusammengeführt und erneut geteilt werden soll, um das Paar als getrennt oder als mehrdeutig zu markieren, wenn unklar ist, was die beste Entscheidung ist.

Klicken Sie auf die Kontrollkästchen, um ein Diagramm der Höhe des Spike-Peaks oder der ersten oder zweiten Hauptkomponente in Abhängigkeit von der Zeit oder von Auto- und Kreuzkorrelationshistogrammen anzuzeigen. Diese können bei Entscheidungen helfen. Hier sehen wir ein Beispiel für eine Zusammenführungsentscheidung.

Gefolgt von einer Merge- und Split-Entscheidung. Wenn die Option "Zusammenführen und Teilen" keine eindeutig trennbaren Cluster finden kann, verwenden Sie den Schieberegler im angezeigten Dialogfeld, um einen Clustering-Parameter manuell zu variieren und eine Teilung zu finden, die zufriedenstellend aussieht. Wenn dies nicht erreicht werden kann, verwenden Sie die Schaltfläche Zurücksetzen, um zum ursprünglichen Zustand der beiden Cluster zurückzukehren.

Wenn Sie fertig sind, drücken Sie wie gezeigt auf Teilen. Gehen Sie nun zu Überprüfung, Nachbearbeitung. Verwenden Sie die Schaltfläche zum Bereinigen der Ausrichtung, um Ereignisse aus den Clustern zu entfernen, die nicht mit ihrer Clustervorlage übereinstimmen.

Verwenden Sie dann die Schaltfläche Recluster, um nicht gruppierte Ereignisse basierend auf dem Übereinstimmungswert bestimmten Vorlagen neu zuzuweisen. Die zurückgewonnenen Ereignisse werden als Subcluster jedes übergeordneten Clusters markiert und können mithilfe des Dialogfelds Cluster anzeigen, bereinigen und teilen überprüft werden. Diese Ereignisse verbleiben im Cluster und werden als solche exportiert, es sei denn, sie werden gelöscht.

Kehren Sie anschließend zum Nachbearbeitungsdialog zurück. Verwenden Sie die Schaltfläche "Löschen" und das Drehsteuerelement daneben, um die Cluster mit einem Signal-Rausch-Verhältnis zu löschen, das kleiner als der ausgewählte Schwellenwert ist. Verwenden Sie anschließend die Schaltfläche Sortieren, um die Cluster nach einem ausgewählten Kriterium neu zu nummerieren.

Diese Abbildung zeigt die Anzeige, die durch Aufrufen zur Ansicht der sortierten Wellenformen für die Aufnahme erhalten wurde, die gerade sortiert wurde. Die gängige Erfahrung ist, dass Wellenformen für ein Cluster-Paar auf demselben Kanal identisch aussehen, aber der Dialog zum Vergleichen von Paaren dennoch unterschiedliche Cluster in der PC-Projektion anzeigt. Zusammenführungsentscheidungen, die auf die vorherigen Sortierstufen folgen, werden manchmal durch Amplituden-Zeit-Diagramme und Kreuzkorrelogramme vorgeschlagen.

Dies veranschaulicht eine Zusammenführungsentscheidung, die auf dem Vorhandensein einer starken asymmetrischen Kreuzkorrelation in kurzen Zeitintervallen basiert, gepaart mit einer klaren Beziehung zwischen den ersten Hauptkomponentenwerten der beiden Einheiten, hier auf der vertikalen Achse. Diese Abbildung zeigt einen Fall, in dem ähnliche Beweise für eine Zusammenführung fehlen. Das Kreuzkorrelogramm ist nicht stark asymmetrisch und die Autokorrelogramme sind unterschiedlich.

Obwohl die Wellenformen ähnlich sind, sollten die beiden Einheiten aufgrund der unterschiedlichen Verteilungen der Hauptkomponenten wohl nicht zusammengeführt werden. Diese Abbildung zeigt einen Fall, in dem die Wellenformen ähnlich sind und die ersten Hauptkomponentenwerte zweier Einheiten übereinander übergehen, wenn eine von ihnen aufhört zu zünden und die andere startet. In diesem Fall scheint die Entscheidung für eine Zusammenführung einfach zu sein.

Wir hoffen, dass diese kurze Einführung in SpikeSorter nützlich war. Wir planen, das Programm weiterzuentwickeln und neue Funktionen hinzuzufügen, wo sie nützlich sein können. Zu diesem Zweck freuen wir uns über Fehlerberichte, konstruktives Feedback und Verbesserungsvorschläge.