Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Vor- und Nachteile der Co-Immunpräzipitation, oder Co-IP, und des Ligationsnachweises durch Nähe, oder PLA, beim Visualisieren von Protein-Protein-Interaktionen in verschiedenen zellulären Kompartimenten zu vergleichen. Der hier vorgestellte Vergleich zweier unterschiedlicher Methoden kann Wissenschaftlern helfen, zu entscheiden, welche Methode besser für ihren spezifischen Zweck geeignet ist, wenn sie die Verteilungsmuster von Protein-Protein-Interaktionen im Zellkern und im Zytoplasma einer Zelle untersuchen. Der Hauptvorteil der Co-IP liegt darin, authentische Protein-Protein-Interaktionen nachzuweisen.

Im Gegensatz dazu liegt der Vorteil von PLA in der schnellen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen auf Einzelzellebene. Nach dem Anzüchten und Sammeln der HEK293-Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll werden 300 µL kalte zytoplasmatische Extraktionslösung zu 3 × 10⁶ Zellen gegeben und die Zellen 15 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexiert. Der Extrakt wird 30 Minuten auf Eis inkubiert, wobei während der Inkubation alle 10 Minuten jeweils 5 Sekunden vortexiert wird.

Gegeben Sie anschließend 16,5 µL kalte zytoplasmatische Extraktionslösung hinzu, wirbeln Sie fünf Sekunden lang und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang auf Eis. Wirbeln Sie den Extrakt erneut fünf Sekunden lang und zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g und 4 °C für fünf Minuten. Überführen Sie das Überstand in ein neues vorgekühltes Röhrchen und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf. Waschen Sie die unlöslichen Pellets anschließend dreimal mit je einem Milliliter kalter PBS, indem Sie die PBS mehrmals auf- und abpipettieren und nach jedem Waschschritt die PBS entfernen.

Fügen Sie anschließend 150 Mikroliter kalte Kernextraktionslösung hinzu, wirbeln Sie 15 Sekunden lang und inkubieren Sie eine Stunde lang auf Eis. Vortexen Sie die Probe alle 10 Minuten während der Inkubation 15 Sekunden lang und pipettieren Sie die Lösung mit einer 200 Mikroliter-Spitze 10-mal auf und ab. Vortexen Sie das Reagenzglas 15 Sekunden lang und zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g und 4 Grad Celsius 10 Minuten lang. Überführen Sie anschließend das Überstand enthaltende nukleäre Extrakt in ein neues vorab gekühltes Reagenzglas und lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis.

Entnehmen Sie jeweils 10 % des Volumens der nukleären und zytoplasmatischen Extrakte als Input-Fraktionen und geben Sie kaltes PBS zu den verbleibenden Extrakten hinzu, um ein Endvolumen von einem Milliliter zu erreichen. Bewahren Sie die Proben bis zur Verwendung auf Eis auf. Nachdem Sie gegebenenfalls die mit Protein G konjugierten magnetischen Perlen vorgereinigt haben, mischen Sie 40 Mikroliter der mit Protein G konjugierten magnetischen Perlen mit vier Mikrogramm des schnellen polyklonalen Anti-RBM3-Antikörpers oder mit schnellem IgG als negativen Kontrollantikörper in 200 Mikrolitern PBST.

Inkubieren Sie bis zur Raumtemperatur auf einem Rotator für 40 Minuten. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Magnetrack und entfernen und entsorgen Sie anschließend den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen danach einmal mit 200 µL PBST.

Geben Sie ein Milliliter verdünntes Lysat zu den Kügelchen und inkubieren Sie über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag stellen Sie die Röhrchen auf einen Magnetrack und aspirieren das Überstand. Fügen Sie 0,5 Milliliter PBST zu den Kügelchen hinzu und waschen Sie diese dreimal auf einem Rotator bei vier Grad Celsius mit einer festen Geschwindigkeit von 20 U/min über jeweils 10 Minuten.

Eluieren Sie das Protein von den Kügelchen, indem Sie 40 Mikroliter Probenpuffer hinzufügen, und erhitzen Sie die Probe anschließend 10 Minuten lang auf 70 Grad Celsius. Nachdem die Kügelchen abzentrifugiert wurden, überführen Sie die Flüssigkeit in ein neues 1,5-Milliliter-Gefäß. Für die Immunzytochemie säen Sie HEK293-Zellen mit einer Dichte von 1,5 × 10⁴ Zellen pro Kammer in eine acht-Kammer-Polylysin-beschichtete Objektträgerkammer aus.

In 0,4 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FPS und 100 Einheiten pro Milliliter Pen/Strep, inkubieren. Die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, dann das Medium abziehen und die Zellen mit 4 % PFA bei Raumtemperatur 10 Minuten lang in einer laminaren Flusshaube fixieren. Anschließend das PFA abziehen und die Zellen dreimal mit jeweils 0,5 Milliliter PBS pro Kammer waschen.

Fügen Sie 0,5 % Triton X100 mit 5 % NGS und PBS hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren und zu blockieren, und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie danach die primären Antikörper anti-NF90 monoklonal und anti-RBM3 polyklonal im Verhältnis 1:100, geben Sie die primären Antikörper in die Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Schüttler. Am folgenden Tag waschen Sie die Kammer dreimal mit jeweils 0,5 Millilitern PBS für zehn Minuten.

Um die immunzytochemische Färbung durchzuführen, geben Sie eine 1:500-Verdünnung von mit grünem fluoreszierendem Farbstoff gekoppelten Antimaus- und mit rotem fluoreszierendem Farbstoff gekoppelten Antikaninchen-Antikörpern zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Geben Sie eine 1:5.000-Verdünnung von DAPHE NBPS zur Kontrastfärbung der Kerne hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, anschließend waschen Sie die Proben wie zuvor mit PBS. Entfernen Sie die Kammerobjektträger vom Objektträger und trocknen Sie sie ab, bevor Sie sie mit je 250 µL Eindeckmedium pro Objektträger eindecken.

Um die Proben für den Röhrchen-Proximity-Ligationsassay vorzubereiten, nachdem die Zellen und die primären Antikörper inkubiert und wie gerade gezeigt gewaschen wurden, verdünnen Sie die vorgefertigten Proben im Verhältnis 1:5 in 0,1 % Triton X-100 und 5 % NGS in PBS auf ein Gesamtvolumen von 320 Mikrolitern pro Acht-Kammer-Objektträger. Inkubieren Sie die Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Kammern vom Glasobjektträger und geben Sie die verdünnten Proben hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Kammern eine Stunde lang in einem feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Stellen Sie eine Ligationslösung her, indem Sie acht Mikroliter Ligase, 64 Mikroliter 5x Ligationspuffer und 248 Mikroliter Wasser mischen. Entfernen Sie die Flüssigkeit vom Objektträger ab und waschen Sie die Proben zweimal mit Wash-Puffer A je fünf Minuten. Geben Sie die Ligationslösung zu den Proben hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Stellen Sie die Amplifikationslösung her, indem Sie vier Mikroliter Polymerase, 64 Mikroliter 5x-Amplifikationsgrundlösung und 252 Mikroliter Wasser mischen, und wickeln Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie ein, um es vor Licht zu schützen. Danach entfernen Sie die Flüssigkeit vom Objektträger ab, und waschen Sie die Proben zweimal je zwei Minuten mit einer x Waschpuffer A-Lösung. Geben Sie die Amplifikationslösung zu den Proben hinzu und inkubieren Sie sie 100 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer dunklen, feuchten Inkubationskammer.

Danach, nachdem die Flüssigkeit wie zuvor abgetippt wurde, die Proben zweimal je 10 Minuten in Waschpuffer B waschen, bevor sie anschließend einmal in 0,1 x Waschpuffer B gewaschen werden. Schließlich das Objektträger trocknen und die Proben mit 250 µL handelsüblichem Einbettmedium mit DAPHE eindecken, die Fluoreszenz unter dem Mikroskop untersuchen und Bilder mit einer CCD-Kamera aufnehmen. Ko-Immunpräzipitationsversuche mit RBM3 als Köderprotein zeigten, dass NF90-RBM3-Interaktionen vorwiegend im Zellkern vorliegen, während eine Minderheit im Cytoplasma nachweisbar ist. In diesem Immunfluoreszenzversuch sind sowohl NF90 als auch RBM3 im Zellkern sichtbar.

Beide Proteine finden sich ebenfalls im Cytoplasma in C2, und beide Proteine zeigen eine perfekte Kolokalisation in jedem Kompartiment. Wie an diesen Bildern zu erkennen ist, zeigte der Nachweis mittels Ligationsassay in unmittelbarer räumlicher Nähe das Muster der NF90-RBM3-Wechselwirkungen, das dem herkömmlichen immunzytochemischen Nachweis sehr ähnlich ist und bei dem die meisten Wechselwirkungen im Zellkern in der Mehrheit der Zellen lokalisiert sind. Nur ein geringer Anteil der Zellen zeigte eine vorwiegend cytoplasmatische Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die PLA, obwohl sie bequemer ist, keine direkten Protein-Protein-Interaktionen widerspiegelt. Stattdessen detektiert die Co-IP eine gerichtete Interaktion. Außerdem bestimmt die Spezifität des primären Antikörpers die Qualität des Ergebnisses.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie je nach Ihrem eigenen experimentellen Ziel eine geeignete Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen zellulären Kompartimenten auswählen können.