Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und In Situ Nähe Ligatur Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Vor- und Nachteile der Co-Immunpräzipitation (Co-IP) und des Proximity-Ligation-Assays (PLA) bei der Visualisierung von Proteinprotein-Wechselwirkungen in verschiedenen zellulären Kompartimenten zu vergleichen. Der hier vorgestellte Vergleich zweier verschiedener Methoden kann den Wissenschaftlern bei der Untersuchung der Verteilungsmuster von Protein-Protein-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma einer Zelle bei der Untersuchung der Verteilungsmuster von Protein-Protein-Wechselwirkungen helfen. Der Hauptvorteil von co-ip besteht darin, authentische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu detektieren.

Im Gegensatz dazu besteht der Vorteil von pla darin, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen in Institutsproteinen auf Einzelzellebene schnell analysiert werden können. Nach dem Züchten und Ernten von hex293-Zellen gemäß dem Textprotokoll auf 3 mal 10 bis 6. Zellen fügen Sie 300 Mikroliter kalte zytoplasmatische Extraktionslösung hinzu und wirbeln Sie die Zellen 15 Sekunden lang mit höchster Geschwindigkeit ein. Inkubieren Sie den Extrakt 30 Minuten lang auf Eis und während der Inkubation alle 10 Minuten die Probe fünf Sekunden lang.

Fügen Sie dann 16,5 Mikroliter kalte zytoplasmatische Extraktionslösung hinzu, wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang vor und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang auf Eis. Den Extrakt fünf Sekunden lang vortexen und die Probe fünf Minuten lang bei 16.000 x g und 4 Grad Celsius zentrifugieren. Füllen Sie das Übergewicht in ein neues vorgekühltes Röhrchen um und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf, dann verwenden Sie einen Milliliter kaltes PBS, um die unlöslichen Pellets dreimal zu waschen, indem Sie auf und ab pipettieren und das PBS nach jedem Waschen entfernen.

Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter kalte nukleare Extraktionslösung hinzu, wirbeln Sie sie 15 Sekunden lang vor und inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf Eis. Während der Inkubation alle 10 Minuten die Probe 15 Sekunden lang wirbeln und die Lösung mit einer 200-Mikroliter-Spitze 10 Mal pipettieren. Wirbeln Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang vor und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 16.000 x g bei 4 Grad Celsius, dann überführen Sie das Übergewicht mit dem Kernextrakt in ein neues vorgekühltes Röhrchen und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf.

Entfernen Sie jeweils 10 % des Volumens der Kern- und Zytoplasmaextrakte als Inputs, dann fügen Sie den verbleibenden Extrakten kaltes PBS bis zu einem Endvolumen von einem Milliliter hinzu. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Kombinieren Sie nach der Vorklärung der konjugierten magnetischen Beads mit Protein g bei Bedarf 40 Mikroliter konjugierte magnetische Kügelchen mit vier Mikrogramm schnellem polyklonalem Anti-RBM3-Antikörper oder schnellem IGG als Negativkontrolle in 200 Mikrolitern PBST.

40 Minuten auf einem Rotater auf Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell, entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie die Kügelchen dann mit 200 Mikrolitern PBST einmal.

Geben Sie einen Milliliter verdünnte Lisaten zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Legen Sie am nächsten Tag die Röhrchen auf das Magnetgestell und saugen Sie den Überstand an. Geben Sie 0,5 Milliliter PBST zu den Kügelchen und waschen Sie sie dreimal auf einem Rotator bei vier Grad Celsius mit einer festen Drehzahl von 20 U/min für 10 Minuten.

Eluieren Sie das Protein aus den Kügelchen, indem Sie 40 Mikroliter Probenpuffer hinzufügen und die Probe dann 10 Minuten lang auf 70 Grad Celsius erhitzen. Nachdem Sie die Kügelchen heruntergeschleudert haben, füllen Sie die Flüssigkeit in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Um die Immunzytätchemie durchzuführen, säen Sie HEK293-Zellen im Verhältnis 1,5 mal 10 auf die vier Zellen pro Kammer in einem mit Polydelysin beschichteten Objektträger mit acht Kammern.

In 0,4 Millilitern DMEM ergänzt mit 10% FPS und 100 Einheiten pro Milliliter Penstrep. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, saugen Sie dann das Medium an und fixieren Sie die Zellen mit 4 % PFA 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube. Aspirieren Sie dann das PFA und verwenden Sie 0,5 Milliliter PBS pro Kammer, um die Zellen dreimal zu waschen.

Fügen Sie 0,5 % TritonX100 mit 5 % NGS und PBS hinzu, um die Zellen zu permeablizieren und zu blockieren, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Verdünnen der monoklonalen Anti-NF90- und der polyklonalen Anti-RBM3-Primärantikörper von eins bis 100 werden die Primärantikörper in die Vertiefungen gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Shaker inkubiert. Am nächsten Tag verwenden Sie 0,5 Milliliter PBS, um die Kammern dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen.

Um eine immunzytäre Chemie durchzuführen, geben Sie den Zellen eine Verdünnung von grün Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Anti-Maus- und roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikaninchen-Antikörpern von einer bis 500 und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie eine Verdünnung von 1 bis 5.000 DAPHE NBPS hinzu, um die Zellkerne gegenzufärben, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, dann waschen Sie die Proben wie zuvor mit PBS. Entfernen Sie die Kammern vom Objektträger und trocknen Sie sie, bevor Sie 250 Mikroliter Eindeckmedium pro Objektträger zur Montage verwenden.

Zur Herstellung von Proximity-Ligations-Assay-Sonden des Röhrchens verdünnen Sie nach dem Inkubieren von Zellen und Primärantikörpern und dem Waschen wie gerade gezeigt die vorgefertigten Sonden eins zu 5 in 0,1 % Tritonx100 und 5 % NGS und PBS in einem Gesamtvolumen von 320 Mikrolitern für einen Objektträger mit acht Kammern. Inkubieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Kammern von der Glasseite, fügen Sie die verdünnten Sonden hinzu und inkubieren Sie die Kammern dann eine Stunde lang in einem Feuchtigkeitsinkubator bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie eine Ligationslösung vor, indem Sie acht Mikroliter Ligase, 64 Mikroliter 5x Ligationsmaterial und 248 Mikroliter Wasser mischen. Klopfen Sie die Flüssigkeit vom Objektträger ab und waschen Sie die Proben mit onex Waschpuffer A zweimal für jeweils fünf Minuten. Geben Sie die Ligationslösung zu den Proben und inkubieren Sie sie in einem Feuchtigkeitsinkubator bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Bereiten Sie die Amplifikationslösung vor, indem Sie vier Mikroliter Polymerase, 64 Mikroliter 5x Amplifikationsmaterial und 252 Mikroliter Wasser mischen und das Röhrchen in Folie einwickeln, um es vor Licht zu schützen. Klopfen Sie dann die Flüssigkeit vom Objektträger ab und verwenden Sie einen x Waschpuffer A, um die Proben zweimal für jeweils zwei Minuten zu waschen. Geben Sie die Amplifikationslösung zu den Proben und inkubieren Sie sie 100 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem dunklen, feuchten Inkubator.

Nachdem Sie die Flüssigkeit wie zuvor abgeklopft haben, waschen Sie die Proben zweimal für jeweils 10 Minuten in Waschpuffer B, bevor Sie sie einmal in 0,1 x Waschpuffer B waschen. Zum Schluss trocknen Sie den Objektträger und montieren Sie die Proben mit 250 Mikrolitern handelsüblichem Eindeckmedium mit DAPHE, untersuchen Sie die Fluoreszenz unter einem Mikroskop und nehmen Sie Bilder mit der CCD-Kamera auf. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit RBM3 als Köderprotein zeigten, dass NF90-RBM3-Wechselwirkungen überwiegend im Zellkern und eine Minderheit im Zytoplasma zu finden sind. In diesem Immunfluoreszenz-Experiment sind NF90 und RBM3 beide im Zellkern zu sehen.

Beide Proteine kommen auch im Zytoplasma von C2 vor, und beide Proteine zeigen eine perfekte Kolokalisation in jedem Kompartiment. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, zeigte der Proximity-Ligation-Assay das Muster der NF90-RBM3-Interaktionen, das der konventionellen Immunzytätchemie sehr ähnlich ist, die bei den meisten Zellen die meisten Wechselwirkungen im Zellkern aufweist. Nur ein kleiner Teil der Zellen zeigte eine überwiegend zytoplasmatische Verteilung von NF90-RBM3-Interaktionen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass PLA zwar bequemer ist, aber die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Proteinen nicht direkt widerspiegelt. Stattdessen erkennt co-ip gerichtete Interaktion. Darüber hinaus bestimmt die Spezifität des primären Antikörpers die Qualität des Ergebnisses.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine geeignete Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen zellulären Kompartimenten gemäß Ihrem eigenen experimentellen Zweck auswählen können.