Name: Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Isolierung mesenchymaler Stromazellen aus Nabelschnur und Plazenta mittels Explantatkultur. Diese Methode liefert hochwertige Zellpopulationen für die Stammzellbiologie.

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Die Studie wurde von OU-WB ISCRM, Oakland University und Michigan Kopf und Spine Institute unterstützt. N. Beeravolu und C. McKee erhielt den Provost Graduate Research Award von der Oakland University. Wir schätzen S. Bakshi für das Manuskript zu überprüfen.

Die Proben (n = 3) wurden aus dem zustimmenden erhalten, gesunden Spendern durch das Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI und das Providence Hospital, Southfield, MI unter HIC- (HIC # 2012-101) und IRB- (IRB # 820662- 3) jeweils genehmigte Protokolle und verarbeitet, wie von der IBC (# 2858) von der Oakland University, Rochester, MI genehmigt. 1. Verarbeitung Nabelschnur, Cord-Plazenta Junction, und Fetal Placenta und Isolieren von Zellen <ol><li> Aseptisch sammeln Proben von UC in etwa 10 cm in der Länge, einschließlich 5 - 6 cm an den CPJ verbunden ist und 3 bis 4 cm von FP. Unmittelbar jede Probe in einem Sammelbecher haltigem Medium (DMEM mit 4,500 mg / ml Glucose und Antibiotika-Lösung (0,1% Gentamicin, 0,2% Streptomycin und 0,12% Penicillin)) und bei 4 ° C, bis es ins Labor transportiert durch Platzieren sie es auf Eis in einer Styropor-Box. Verarbeiten der Probe bei 4 ° C innerhalb von 2 bis 4 h der Sammlung. </li><li> Die Probe wird in einem 150-mm-Petrischale gehalten onEis in einem Biosicherheitsschrank. Unter Verwendung einer Nadel und Spritze, spülen sie mehrmals mit eiskaltem PBS Blutgerinnsel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Probe mit PBS während der Verarbeitung feucht gehalten wird und nicht trocknen lassen. Sterilität, behandelt die Probe aseptisch mit autoklaviert PBS und chirurgischen Instrumenten im gesamten Probenverarbeitung zu erhalten. </li><li> sorgfältig prüfen, um die Probe unterschiedliche anatomische Bereiche zu identifizieren: UC, CPJ und FP. Zuerst die UC sezieren. Halten Sie das fetale Ende der UC mit einer Pinzette und sorgfältig den ersten Schnitt macht nur an der Spitze des CPJ eine Schere. Stellen der zweite Schnitt unterhalb des CPJ die CPJ zu trennen (1,5 bis 2,0 cm) vom FP. Platzieren Sie die getrennt UC, CPJ und FP in separaten Petrischalen für die weitere Verarbeitung. </li><li> Schneiden Sie die längs UC mit Hilfe von Schere und Pinzette, vollständig die Blutgefäße ausgesetzt wird und die umliegende WJ ohne das Epithel zu stören. </li><li> Kratzen Sie die WJ weg von den Blutgefäßen und inneren Epithel des subamnionmit einem Skalpell und dann die Blutgefäße entfernen. Achten Sie darauf, alle verbleibenden perivaskuläre WJ unter und um die Blutgefäße zu sammeln, und legen Sie die gesammelten WJ in einem separaten Petrischale. </li><li> Sammle das verbleibende Gewebe, cord Auskleidung (CL), in einem separaten Petrischale. </li><li> Nach der Trennung der Gewebe darstellen, CL, WJ, CPJ und FP, ersetzen den PBS mit 3 bis 5 ml handelsüblicher Trypsinlösung und getrennt jeden des Gewebes in 1- bis 2-mm-Stücke mit einer Schere schneiden. </li><li> Inkubiere die Gewebestücke in kommerzieller Trypsin - Lösung bei 37 ° C für 30 min in einem 5% CO 2 -Inkubator für partiellen Verdau der Proben. Beachten Sie die partielle Spaltung durch die Freisetzung von Zellen Visualisierung eines Phasenkontrastmikroskop. </li><li> Um die teilweise verdauten Proben ein gleiches Volumen an Kulturmedium (CM; DMEM mit 4,500 mg / ml Glucose und 2 mM L-Glutamin, ergänzt mit 10% menschliches Serum / FBS und Antibiotika-Lösung (0,1% Gentamicin, 0,2% Streptomycin und 0,12% Penicillin)), um die kommerzielle Trypsinlösung zu neutralisieren. Übertragen, um den Inhalt in 50-ml-Zentrifugenröhrchen und lassen die teilweise verdaute Gewebestück für 3 Minuten absetzen. </li><li> Aspirieren sorgfältig den Überstand, einschließlich dem einzelnen Zellen (dehnen sie sich nicht effizient) und die Platte 15 bis 20 teilweise verdauten Gewebestücke auf einer 75-cm 2 Gewebekulturflasche und füge 9 ml CM. Bei 37 ° C und nicht stört die Kulturflaschen für 2 - 3 Tage für die Haftung der Gewebestücke zu ermöglichen. HINWEIS: Der verbleibende Teil der teilweise verdauten Gewebeproben kann für die Zukunft Isolierung von Zellen kryokonserviert werden. </li><li> Nach 3 Tagen Inkubation die CM ändern und für das Auftreten von Auswachsen von Zellen aus dem Explantat auf einer täglichen Basis suchen; 4 Tage, 7 - - 10 Tage und von 11 bis 14 Tagen Inkubation für CPJ, CL / WJ und FP bzw. Zellwachstum sollte von dem adhärenten Explantate nach 3 ersichtlich. Von diesem Punkt an, ändern Sie die CM nach jeweils 3 Tagen oder alserforderlich. HINWEIS: Das Zellwachstum erreicht 70% Zusammenfluß von 7 bis 10 Tage nach der ersten Zellauswuchs aus dem Explantat. Beachten Sie, dass nicht-haftende Gewebestück nicht zu einer Zellauswuchs geben werden, bis sie am Kunststoff haften. Es muss darauf geachtet werden, dass der Kolben nicht in Ordnung gestört wird, um die Ablösung der anhaftenden Gewebestücke zu vermeiden. Wenn es irgendwelche schwebenden Stücke nach den ersten 3 Tagen der Kultivierung sind, könnten sie von ihnen in einen neuen Kolben übertragen für die Befestigung gerettet werden. HINWEIS: Wenn das Zellwachstum aus den Geweben Explantate 70% Konfluenz erreicht, sollten sie subkultiviert werden. 14 Tage, 14 - - Wie oben erwähnt, von MSCs CL / WJ, FP, CPJ und Einmündung in 10 erreichen 20 Tage und 17 bis 24 Tagen auf. </li><li> Zu entwachsen Zellen aus dem Explantaten Subkultur, dissoziieren die Zellen unter Verwendung von 1 bis 2 ml handelsüblicher Trypsinlösung / 75 cm 2 Kulturkolben und inkubieren bei 37 ° C für 3 min. Neutralisieren mit 1 bis 2 ml CM und zentrifugieren 1.500 xg für 3 min. Machensicher, dass die Flasche zu drehen, während im ganzen noch verbreitet Trypsin Zugabe. </li><li> HINWEIS: Die pelletierten Zellen werden als Passage 0 (P0) und werden in CM, gezählt und bei einer Saatdichte von 1 × 10 4 / cm 2 für die Amplifikation, Charakterisierung und Kryokonservierung subkultiviert ausgesetzt. Die überschüssigen Zellen können bei P0 kryokonserviert werden. </li></ol> 2. Charakterisierung der isolierten Zellen <ol><li> Koloniebildungseffizienz (CFE) -Assay <ol><li> Coat die 100-mm - Petrischalen (Oberfläche von 60 cm 2) mit 0,1% Gelatine für 30 min und legt sie in dem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. HINWEIS: Obwohl nicht notwendig, Gelatine-Beschichtung Zellhaftung verbessert. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Gelatine und Samen der beschichteten Platte mit P0 Zellen bei einer Konzentration von 1,63 Zellen / cm 2. 3 ml CM und Inkubation im CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Überwachen Sie die geimpften Platten für Klonwachstumdurch Lichtmikroskopie (LM) und das Medium alle 3 Tage ändern. </li><li> Nach 10 bis 14 Tagen des Zellwachstums, wäscht die Petrischalen zweimal mit PBS und fixiert die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Brillen während des Gebrauchs tragen. </li><li> Verfärbung die fixierten Zellen mit 0,1% Kristallviolett für 1 h bei Raumtemperatur und Spülen der Platte mit Leitungswasser, bis die ungebundene Bläue weg ist. </li><li> Zähle die Anzahl der Kolonien, die mindestens 50-Zellen, die aus unter Verwendung von LM. </li></ol></li><li> Die Expression von Zelloberflächenmarker <ol><li> Kultur die isolierten Zellen auf 70% Konfluenz, distanziere mit dem kommerziellen Trypsin-Lösung und waschen und Pellet durch Zentrifugation bei 1500 × g für 3 min. Suspendiert die Zellen in FACS-Puffer (1 × PBS mit 2% FBS und 0,1% Natriumazid). HINWEIS: Natriumazid ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Brillen während des Gebrauchs tragen. </li><liStain&gt; die Zellen (~ 10 6) mit FITC- oder APC-markierten MSC-spezifischen Antikörpern (FITC-konjugierter Antikörper gegen: CD44 und CD90 oder APC-konjugiertem Antikörper gegen: CD29, CD73 und CD105) in FACS - Puffer für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Zentrifugieren der gefärbten Zellen bei 670 · g für 5 min, um den Überstand absaugen und Resuspendieren der Zellen in 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer. </li><li> Analysieren Sie die Antikörper-gefärbten Zellen unter Verwendung von FACS nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li></ol> 3. Differenzierungspotenzial <ol><li> adipogenen Differenzierung <ol><li> Kultur die isolierten Zellen auf 70% Konfluenz, distanziere mit dem kommerziellen Trypsin-Lösung und waschen und Pellet durch Zentrifugation bei 1500 × g für 3 min. </li><li> In einem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C, der Kultur der Zellen bei einer Konzentration von 100.000 Zellen / Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen , die 2 ml CM. </li><li> Nach 24 h, ersetzen Sie das CM mit adipogENIC Differenzierungsmedium (0,5 uM Isobutyl-Methylxanthin, 1 uM Dexamethason, 10 &amp; mgr; M Insulin und 200 uM Indomethacin) und inkubieren. Ändern Sie das Differenzierungsmedium alle 3 Tage oder so oft wie nötig. </li><li> Nach 3 Wochen Inkubation, fixieren die Zellen mit 2 ml 4% Paraformaldehyd pro Napf für 30 min bei Raumtemperatur und Fleck mit Oil Red O, die Produktion von Lipidtröpfchen, um adipogenen Differenzierung zu analysieren, um zu ermitteln. HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Brillen während des Gebrauchs tragen. </li><li> Behandelt die fixierten Zellen mit 60% Isopropanol (2 ml / Vertiefung von 6-Loch-Platte) für 5 min. </li><li> Ersetzen des Isopropanols mit 2 ml Ölrot O-Färbung (Filter 3 Teile Ölrot O-Färbung und 2 Teile destilliertes Wasser), Inkubation für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur und wäscht 3 bis 4-mal mit Leitungswasser, um jegliches ungebundenes Fleck zu entfernen . </li><li> Visualisieren der rot-gefärbten Lipidtröpfchen, indikativ für adipogenen Zelllinie, usingen LM. </li></ol></li><li> chondrogene Differenzierung <ol><li> Kultur isolierte Zellen auf 70% Konfluenz, distanzierten mit der kommerziellen Trypsin-Lösung und Waschen mit PBS. </li><li> Um Zellen für die chondrogene Induktion Zentrifuge 250.000 Zellen in einer 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 ml CM bei 11000 · g für 8 min pelletieren. Inkubiere die Pellets über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Nach 24 h ersetzen sanft das CM mit chondrogenen Differenzierungsmedium (20 ng TGF-Beta1, 10 ng Insulin, 100 nM Dexamethason und 100 &amp; mgr; M Ascorbinsäure), ohne das Pellet zu stören und die Inkubation fortzusetzen. Ändern Sie das Differenzierungsmedium alle 3 Tage oder so oft wie nötig. </li><li> Nach 3 Wochen Inkubation, fixiert die Zellen mit 2 ml 4% Paraformaldehyd pro Napf für 30 min bei Raumtemperatur. Kryoschnitt und flecken mit 1% Toluidinblau das Vorhandensein oder die Produktion der extrazellulären Matrix zu untersuchen, um die chondrogene Differenzierung zu bestimmen. HINWEIS: Paraformaldehyde ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Brillen während des Gebrauchs tragen. </li><li> Für Kryoschneiden waschen behutsam die geernteten Zellpellets zweimal mit PBS und fixieren mit 1 ml 4% Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Augenabnutzung während des Gebrauchs tragen. </li><li> Waschen Sie die Pellets zweimal mit PBS, die Paraformaldehyd und Überführung in eine Saccharose / ÜLG Lösung zu entfernen (1: 2, 20% Sucrose: OCT). Inkubieren bei Raumtemperatur für 24 h die Lösung vollständig zu erlauben, zu den Zellpellets sickern in; dies wird glatt Schnitte ermöglichen. </li><li> Übertragen Sie die Pellets in den Oktober Formen. Frieren der Formen bei -20 ° C für 4 - 6 h und Kryoschnitt etwa 10 bis 12 Mikrometer dicke Abschnitte der Zellpellets unter Verwendung eines Kryostaten für Toluidinblau-Färbung. </li><li> Waschen Sie die Kryoschnitte vorsichtig mit PBS; fügt einige Tropfen 1% Toluidinblau-Färbung, für die Pelletabschnitte auf dem Schieber vollständig; und incUbate für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit mehrfach PBS entfärben. Entfernen der überschüssigen Farbstoff durch den Schieber in HCl-basierten Alkohollösung getaucht (95% Alkohol + 0,5 ml HCl) mehrere Male, bis die ungebundene blaue Farbe verschwunden ist. Montieren Sie die gefärbten Schnitten unter Verwendung von 100 &amp; mgr; l Lösung für die langfristige Erhaltung der Folien Montage. HINWEIS: Die blaue Färbung der Abschnitte das Vorhandensein von Glykosaminoglykane und Glykoproteine ​​zeigt und wird unter Verwendung von LM beobachtbar sein. </li></ol></li><li> osteogene Differenzierung <ol><li> Wiederum dissoziieren Kultur die isolierten Zellen auf 70% Konfluenz mit dem kommerziellen Trypsinlösung und wasche und Pellet durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 3 min. </li><li> Subkultur der Zellen bei einer Konzentration von 100.000 Zellen / Well Platten mit 6 Vertiefungen , die 2 ml CM in einem CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach 24 h, die mit CM osteogenen Differenzierungsmedium ersetzt (0,1 μ; M Dexamethason, 10 uM β-Glycerophosphat und 50 uM Ascorbat Phosphat) und die Inkubation fortzusetzen. Ändern Sie das Differenzierungsmedium alle 3 Tage oder so oft wie nötig. </li><li> Nach 3 Wochen Inkubation, fixieren die Zellen mit 2 ml 4% Paraformaldehyd pro Napf für 30 min bei Raumtemperatur und Fleck mit Alizarinrot das Vorhandensein einer Kalkablagerung zu erfassen, um die osteogene Differenzierung zu bestimmen. HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig. Bitte üben Vorsicht durch Handschuhe und Brillen während des Gebrauchs tragen. </li><li> mit 2% Alizarinrot Fleck (2 ml / Vertiefung in einer 6-Well-Platte) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkel schonend wäscht die fixierten Zellen zweimal mit destilliertem Wasser und behandeln. </li><li> Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff durch vorsichtiges Waschen mit Leitungswasser, so dass die Kalkablagerungen lösen nicht. </li><li> Visualisieren Sie die rot gefärbten Kalziumablagerungen mit LM. </li></ol></li></ol> 4. Quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Chain Reaktion (qRT-PCR) Analyse <ol><li> Kultur die isolierten Zellen auf 70% Konfluenz mit dem kommerziellen Trypsinlösung, waschen und Pellet durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 3 min Zur Isolierung der gesamten zellulären RNA dissoziieren. </li><li> die Zellen mit PBS waschen Spuren von FBS zu entfernen, und dann an die RNA-Isolierung gehen Kommerzielle RNA-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Reinige den isolierten Gesamt-RNA durch bei 37 ° C mit DNase Behandlung für 30 min ein Thermocycler verwendet. Synthetisiere cDNA folgenden Anweisungen des Herstellers kommerziellen Kits. </li><li> Bereiten dreifache Ausfertigung 10-uL PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte, wobei jede Reaktion mit 5 ul SYBR-Grün PCR Supermix; 3 ul bidestilliertem Wasser; 0,5 &amp; mgr; l jedes Primers, vorwärts und rückwärts; und 1 &amp; mgr; l der verdünnten (1:10) cDNA. </li><li> Führen PCR unter den folgenden Parametern: 10 min bei 98 ° C, gefolgt von 44 Zyklen von 30 s bei 98 &amp; jedem# 176; C, 20 s bei 60 ° C und 30 s bei 72 ° C. </li><li> Normalisieren der Amplifikation der Zielgene zu den Referenzgenen, GAPDH und β-Actin; Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. </li></ol> 5. Statistische Analyse <ol><li> Führen Sie alle Analysen statistische Software. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM. Ergebnisse mit einem p-Wert (** p ≤ 0,01 und * p ≤ 0,05) wurden als statistisch signifikant betrachtet. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Jüngste Fortschritte in der Stammzellforschung verbessert nicht nur das Verständnis der grundlegenden Prozesse der Entwicklung , sondern auch zur Verfügung gestellt viel versprechende Möglichkeiten für den Einsatz von Stammzellen in der Biotechnologie, der pharmazeutischen, Zelltherapie, regenerative Medizin und Tissue - Engineering - Anwendungen 18, 19, 20. Während pluripotenten aus frühen Embryonen isoliert WSR die vielversprechendsten sind, stehen sie vor technische Herausforderungen und ethische Dilemmata 21, 22, 23. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS - Zellen) aus adulten Zellen abgeleitet sind eine Alternative, aber auch sie ähnliche technische und Sicherheitsprobleme 23 gegenüber . Darüber hinaus werden iPSCs nicht genetisch stabil oder können unterzogen genetische Veränderungen aufweisen, wodurch ihre therapeutische Verwendung zu beschränken. Stammzellen haben auch in einer Vielzahl von postnatalen tis berichtetklagt und Organe. Die häufigsten Quellen dieser ASCS sind das Knochenmark, Fettgewebe und Muskelgewebe. Allerdings ASCS aus postnatalen Quellen hat das Wachstum und Differenzierungspotenzial begrenzt 24, 25. Sie leiden auch durch Alterung und die Exposition gegenüber Umweltbelastungen und damit sind nicht immer wirksam für therapeutische Anwendungen 26, 27, 28. Dies hat uns und andere führt nach neuen Quellen von Stammzellen zu suchen, die mehr naiv sind als ASCS. Wir haben perinatale Quellen für primitive Stammzellen als Alternative zu ASCS suchen. In diesem Bericht stellen wir eine zuverlässige, robuste und einfache Methode, menschliche MSCs aus Akku- / Plazenta Proben zu isolieren. Im Vergleich zu anderen Quellen und für die Isolierung von ASCs verwendeten Methoden stellt dieses Verfahren ein effizienten und nicht-invasive Verfahren zur Isolierung von großen Mengen an high-Qualität MSCs. Es betont ferner das höhere Wachstums- und Differenzierungspotential von perinatalen MSCs im Vergleich zu MSCs aus adulten Quellen wie BM. Die UC den Fötus mit der Plazenta Befestigung ist ein großes Organ mit unterschiedlichen anatomischen Regionen, einschließlich der zwei Arterien, eine Vene, CL, und WJ (umgebende Gewebe die Blutgefäße). Mehrere Studien haben die Isolierung von MSCs aus der gesamten Schnur, WJ, oder der Plazenta mit variabler Wachstums- und Differenzierungspotentiale 25 gemeldet, 29. Dennoch ist bislang keine Studie effektiv untersucht und die Zellen von verschiedenen anatomischen Regionen der Akku- / Plazenta Probe verglichen. Wir bieten hier eine systematische und einfache Methode zur Präparation der UC, CPJ und verbunden FP für die Isolierung von MSCs. Wir zeigen Ihnen auch ein umfassendes und einfaches Protokoll zu charakterisieren und die Qualität der isolierten Zellen bewerten durch ihre Proliferation capabil Bestimmungkeiten sowie ihre Selbsterneuerung und Differenzierungspotenziale. Dieses Verfahren ist reproduzierbar und liefert eine große Menge an qualitativ hochwertigen MSCs. Wir fanden, dass die partielle Verdauung von Gewebestücken 1-2 mm in der Größe einer handelsüblichen Trypsinlösung reproduzierbar ergaben Zellen aus den Explantaten mit, während die vollständige Verdauung von Geweben in einzelne Zellen schlechte Ausbeuten an isolierten Zellen hatte. Eine Studie berichtete jedoch, dass größere Gewebe Explantaten von UC in etwa 10 mm in der Größe zur Zellisolierung 30 optimal waren. Umgekehrt wird vorgeschlagen , ein andere Studie , dass das Gewebe - Explantat - Verfahren in einer längeren Kulturzyklus geführt und geringere Ausbeute an Zellen im Vergleich zu der Enzymverdau Methode 31. In früheren Berichten, die Behandlung von Geweben Kord mit Kollagenase und Hyaluronidase II getrennt oder nach der Trypsin, durchgeführt wurde 32 Kord Zellen zu isolieren, 33 <sup&gt;, 34. Nicht nur gibt es viel Variation bei der Verdauung Methoden des Nabelschnurgewebes vor der Kultivierung, sondern auch die isolierten Zellen erschienen heterogen. Die Verwendung von harten Enzymen für längere Zeiträume kann die Zellmembran beeinträchtigt, Zellhaftung und Proliferation zu beeinträchtigen. Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, dass teilweise verdaute perinatales Gewebeexplantate, ohne dass umfangreiche Zellschädigung Auswuchs von Zellen bereitgestellt, die Lebensfähigkeit beibehalten, und ergaben höhere Mengen von homogenen Populationen von MSCs. Während das Protokoll für die Präparation und Isolierung von Zellen aus den Explantaten einfach ist, beweisen einige der Schritte können eine Herausforderung sein. Erstens sorgen Explantation Einhaltung durch ihre Befestigung an der Oberfläche der Kulturflasche ermöglicht. Dies kann durch Verwendung einer kleinen Menge des Mediums erleichtert werden, nur Abdecken der Gewebestücke für die ersten 2 h der Kultur, und dann sorgfältig Zugabe des restlichen Mediums. Second, begrenzen die Anzahl der Explantate auf weniger als 15 pro T75-Kolben. Zu wenig Raum zwischen den Stücken oder zu viele Stücke pro Kolben sind hemmend für Zellauswuchs. Drittens Gewebestücke, die auf der Oberfläche der Kulturflasche haften nicht nach 3 Tagen Inkubation sollte in einen neuen Kolben für die Einhaltung und die Züchtung übertragen werden. Viertens Gewebestücke werden sollte frei von Zelltrümmern, die Bindung hemmt kultiviert werden. Fünftens erfordert die Züchtung von großen Stücken mehr Medium und verbessert nicht Zellauswuchs Effizienz. Schließlich überwacht die Explantation Kulturen eng, vor allem nach dem Erscheinen von Zellauswuchs, da die Zellen schnell konfluent werden können und unterscheiden von der Gewebequelle abhängig. Einige Einschränkungen der Technik gehören ein Mangel an Know-how in die Proben zu sezieren die CL, WJ, CPJ und FP zu trennen; eine kleine Probengrße, was zu einer niedrigen Ausbeute WJ; und verzögerte verarbeitungs die Proben erforderlich sind innerhalb von 2-4 h Sammel zu verarbeitenden AvOid ein Verlust in Zellgewinnung. Der Goldstandard für die Charakterisierung von MSCs ist die Fähigkeit, Kunststoff, bilden die fibroblastic Phänotyp zu haften, und differenzieren sich in mehrere Linien. Diese sind auch allgemein verwendeten Kriterien für die Definition MSCs , wie durch die ISCT 35 beschrieben. In dieser Studie wird aus allen vier Quellen isolierte Zellen waren haftend an Kunststoff und hatten positiven Ausdruck für MSC-Marker (CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105) aber negativen Ausdruck für den hämatopoetischen Marker CD45. Darüber hinaus äußerte sie Human-Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse I, aber für HLA-Klasse-II-negativ war. Im Vergleich zu dem BM-MSCs, WJ und CPJ abgeleiteten Zellen waren höher. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den früheren Berichten von UC-abgeleitete MSCs 33, 36, 37, 38. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass CL-, WJ, CPJ-, FP-MSCs pluri ausgedrücktPotenz Gene wie OCT4, NANOG und SOX2; jedoch war ihr Ausdruck niedriger als die der WSR, wie zuvor 39 berichtet. Diese Ergebnisse waren auch in Übereinstimmung mit einer früheren Studie, die die Expression von Pluripotenz Marker in perinatalen abgeleiteten Zellen 40 berichtete. Interessanterweise wurde beobachtet, dass die Expression von pluripotenten Marker höher war in CPJ-MSCs als aus anderen Quellen isolierten Zellen. Es wurde auch bemerkt , dass der UC-MSCs mehr Selbsterneuerungspotential als BM-MSCs 41 ausgestellt. Interessanterweise trotz Ähnlichkeit in phänotypischen Eigenschaften, die von den vier Quellen isolierten Zellen hatten variable KSE-Werte. Jedoch mit Ausnahme der FP-MSC, hatten sie alle besser CFE Werte als BM-MSCs. CPJ-MSCs hatte den höchsten KSE-Wert und Proliferationsrate, wenn alle anderen MSCs verglichen. Zusätzlich angezeigt WJ und CPJ-MSCs höhere Differenzierungspotentiale als BM-MSCs. CL-MSCs zeigte die geringste DifferentiationPotential , in alle drei Linien (dh adipogenen, chondrogene und osteogene), während CPJ-MSCs hatte das höchste trilineage Differenzierungspotential und FP-MSCs das geringste adipogenen Differenzierungspotential angezeigt. Abschließend zeigten unsere Ergebnisse, dass die Qualität und Quantität der isolierten MSCs zwischen den vier Quellen in der Akku- / Plazenta Probe unterschieden. CPJ-MSCs mehr Proliferationskapazität hatte und mehr Selbsterneuerungspotenzial. Sie waren auch potent in ihrer Differenzierung in die trilineage Zelltypen. Aufgrund ihrer geringen Verdopplungszeit kann CPJ-MSCs schnell 1000-fach und für Hochdurchsatz-Arzneimittel oder Biomaterial Screening erweitert werden. Diese Zellen könnten eine vielversprechende Quelle für die Zelltherapie und regenerative Medizin-Anwendungen sein.

Stammzellen sind in verschiedenen Organen und Geweben des Körpers. Sie besitzen regenerative Potenzial und spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur beschädigtes Gewebes im Körper während der gesamten Spanne des menschlichen Lebens 1, 2. Dies hat sehr viel Interesse an adulten Stammzellen (ASCS) erzeugt, vor allem da, im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), hat die Verwendung von ASCS nicht moralischen und ethischen Dilemmas darstellen. Mehrere Studien haben die Isolierung von ASCs, wie beispielsweise mesenchymale Stromazellen (MSCs) berichtet; hämatopoetischen Stammzellen (HSCs); und verschiedenen Vorläufern, einschließlich verschiedener Quellen Erwachsenen im Bereich von Knochenmark (BM) , um Fettgewebe (AT) und Zahnpulpa 3, 4, 5. die Anzahl der ASCS jedoch in den meisten der erwachsenen Nischen beschränkt sind und ihre Isolation beinhaltet im Allgemeinen eine invasive und schmerzhafte Prozedur mit möglichen SpendernMorbidität. Darüber hinaus Spenderalter und Umweltstress könnten auch eine wichtige Rolle spielen , um die Qualität und die biologische Aktivität der isolierten Zellen 6, 7, 8 bei der Bestimmung. ASCS zeigt auch begrenzte Proliferation und Differenzierungspotenzial während der Kultur in vitro. Zur Überwindung dieser Nachteile des aktuellen ASCS, neue Quellen verfolgt worden, um Stammzellen zu isolieren. Diese Anstrengungen haben zur Isolierung von Stammzellen aus perinatalen Quellen geführt, einschließlich Nabelschnurblut, Marksgeweben, Plazenta und Fruchtwasser 9. Diese Quellen haben gewonnen Aufmerksamkeit wegen ihrer leichten und reichlichen Verfügbarkeit 10, 11, 12, 13. Weiterhin kann perinatale Gewebe nicht-invasiv erhalten werden, und Zellen, die von ihnen abgeleitet sind, stammenprimitiver als aus adulten Quellen 14, 15 isoliert ASCS. Sie werden aus den bei der Geburt erhielten Gewebe isoliert und gelten als minimale Veränderungen im Genom unterzogen werden aufgrund von Alterung und Umweltbelastungen 16. Allerdings erneuern Selbst die berichteten Eigenschaften von Stammzellen aus perinatalen Quellen und ihr Potenzial sowie zu unterscheiden sind sehr unterschiedlich 11, 17. Dies könnte teilweise aufgrund der Tatsache, dass die menschliche Nabelschnur (UC) ist ein komplexer Organ. Wir vermuten, dass die diskreten Bereiche der perinatalen Gewebe schaffen Nischen, die für die Variationen und primitive Natur dieser Stammzellen im Vergleich zu nicht-ASCs von perinatalen Quellen abgeleitet. Diese Studie beschreibt die Präparation von Akku- / placenta Proben in drei diskrete anatomische Regionen: UC, schnur Placenta-Übergang (CPJ), eind fötale Placenta (FP). Die UC wurde weiter in zwei Zonen seziert: Schnur Futter (CL) und Wharton Gelee (WJ). Die Analyse der isolierten Zellen aus CL, WJ, CPJ und FP gezeigt, dass sie alle fibroblastoiden Morphologie und ausgedrückt MSC Marker zeigte, aber sie unterschieden sich in ihrer Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. CPJ abstammenden Zellen zeigten eine höhere Proliferationsrate und Selbsterneuerungspotential zu UC- und FP-abgeleiteten Zellen verglichen, so dass sie eine vielversprechende Quelle für die Zelltherapie, regenerative Medizin und Tissue Engineering zu machen.

<table><tbody><tr><td>DMEM mit 4.500 mg/ml Glukose</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Isobutyl-methylxanthin</td><td>Sigma</td><td>I5879-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Prospec</td><td>CYT-270</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>TGF&Beta; 1</td><td>Prospec</td><td>CYT-716</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A-7631</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbat 2-phosphat</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat</td><td>Sigma</td><td>G-6251</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>50591419</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET RNA Aufreinigungskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Sso-Advanced Universal SYBR Grün Supermix Kit</td><td>Biorad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot O&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>STORO100</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Thermo Scientific</td><td>S71363</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin rot Färbung</td><td>Thermo Scientific</td><td>S25131</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus anti-human CD29</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>559883</tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD34</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>555824</tr><tr><td>FITC Maus anti-human CD44</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555478</tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human-CD45</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555482</tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD73</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>560847</tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human-CD90</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>561969</tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD105</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>562408</tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>IEC</td><td>93522M-2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop (LM)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II und Diva Software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Canto II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ Research Inc.</td><td>PTC-100</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von mesenchymalen stromazellen aus nabelschnur und fetal placenta

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Der menschliche Nabelschnur (UC) und Plazenta sind nicht-invasive, primitive und reichlich Quellen von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), die immer mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen haben, weil sie Bedenken keine ethischen oder moralischen Pose. Gängige Verfahren MSCs von UC ergeben geringe Mengen an Zellen mit variabler Proliferations Potentialen zu isolieren. Da UC ein anatomisch-komplexer Organ ist, können Unterschiede in der MSC-Eigenschaften zu den Unterschieden in den anatomischen Regionen ihrer Isolierung bedingt sein. In dieser Studie wurden seziert wir zuerst die Schnur / placenta Proben in drei diskreten anatomischen Regionen: UC, schnur Placenta-Übergang (CPJ) und fetalen Plazenta (FP). Zweitens zwei verschiedene Zonen, Schnur Futter (CL) und Wharton-Gelee (WJ), getrennt. Die Explantation Kulturtechnik wurde dann verwendet, um Zellen von den vier Quellen zu isolieren. Die Zeit für die Primärkultur von Zellen aus den Explantaten erforderlich variiert abhängig von der Quelle des Gewebes. Auswachsen der Zellen erfolgte in 3 - 4 days der CPJ Explantate, wohingegen das Wachstum nach 7 beobachtet wurde, - 10 Tage und 11 - 14 Tage von CL / WJ und FP Explantate, respectively. Die isolierten Zellen wurden adhärente auf Kunststoff und angezeigt fibroblastoiden Morphologie und Oberflächenmarker, wie CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105, ähnlich wie Knochenmark (BM) -abgeleiteten MSCs. Jedoch zeigt die Koloniebildungsfähigkeit der Zellen variiert, mit CPJ-MSCs und WJ-MSCs höheren Wirkungsgrad als BM-MSCs. MSCs aus allen vier Quellen differenziert in adipogenen, chondrogene und osteogene Abstammungslinien, was darauf hinweist, dass sie multipotent waren. CPJ-MSCs differenzierte effizienter im Vergleich zu anderen MSC Quellen. Diese Ergebnisse legen nahe , dass der CPJ die potenteste anatomische Region ist und ergibt eine höhere Anzahl von Zellen mit einem größeren Proliferation und Selbsterneuerungskapazität in vitro. Zusammenfassend zeigte die vergleichende Analyse der MSCs aus den vier Quellen, die CPJ eine vielversprechende Quelle von MSCs für die Zelltherapie ist, regenerative Medizin und Tissue Engineering.

Dissection und Isolierung von Zellen aus humanen Nabelschnur, Cord-Plazenta Junction, und Fetal Placenta Perinatale Gewebe besteht aus drei diskreten anatomischen Regionen. Die erste ist die UC, enthaltend zwei Arterien und einer Vene, sowie zwei getrennte Zonen: CL (die Außenverkleidung des Kords) und WJ (das gallertartige Material, das die Blutgefäße in der Schnur umgeben). Das zweite ist, CPJ (die Verbindung zwischen dem Kabel und der Plazenta), und die dritte ist FP, die unmittelbar nach dem CPJ ist (das Kabel fügt in die Plazenta, die an der Gebärmutterwand der Mutter angebracht ist). Die schematische Darstellung des Isolierungsprotokolls von Zellen von perinatalen Geweben ist in Abbildung 1 dargestellt. Die vier Quellen-CL, WJ, CPJ und FP-sind deutlich erkennbar und wurden getrennt Zellen aus den Explantaten zu isolieren, wie in Abbildung 2 dargestellt. Ter Erscheinen Zellauswuchs aus Explantatkulturen wurde routinemäßig überwacht und durch LM aufgezeichnet. Adhärenten Fibroblastoidzellen wurde nach 3-4 Tagen der Kultivierung des CPJ Explantaten beobachtet. Zellen mit ähnlicher Morphologie erschienen 7-8, 9-10 und 11-14 Tage nach der WJ, CL und FP Explantate Kultivierung ist. Das Auswachsen der Zellen aus den Explantaten , die die verschiedenen Quellen (CL, WJ, CPJ und FP) ist in 3A dargestellt. Diese Zellen wurden als P0 angesehen. Wenn Zellen P0 subkultiviert wurden, erschienen sie klonal zu wachsen, eine fibroblastoiden Morphologie ähnlich der BM-MSCs anzeigt. Jedoch zeigten sie Variation in der Populationsverdopplungszeit, im Bereich von 32 h bis 94 h für die Zellen , die aus CPJ und FP, wie in 3B und C gezeigt. Zellen von WJ und CL hatten ähnliche Verdoppelung mal CPJ und FP medial. Eine weitere Analyse der P0-Zellen zeigte an, dass sie auch in der CFE variiert, 16-92 Kolonien reichen.Zellen aus dem CPJ hatten die höchste (92), während der FP-Zellen die niedrigsten (16) CFE hatten. Zellen von CL und WJ CFE hatten Werte von 59 und 80 Kolonien, bzw. (4A -C). Die Zellen von CL hatten CFE Werte ähnlich den BM-MSCs. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CPJ-abgeleiteten Zellen haben eine höhere proliferative und Selbsterneuerung Fähigkeiten. Immunoprofile der isolierten Zellen Zellen aus dem CL, WJ, CPJ isoliert und FP wurden für die Expression von zellspezifische Marker untersucht. P3-5 Zellen zeigten positiven Ausdruck für MSCs Marker wie CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105 (5A und B). Diese Zellen sind auch bekannt zu Major Histocompatibility Klasse drücke ich Marker HLA-ABC, und drücken nicht Klasse - II - Marker, HLA-DR 3. Der prozentuale Anteil der positiven Zellen für these Marker ausgewählt aus allen vier Quellen, die ähnlich wurde durch Standard-BM-MSCs ausgedrückt. Jedoch zeigen die MFI - Verhältnisse , die WJ und CPJ abgeleiteten Zellen nahezu ähnlich sind , und ist sogar höher als die CL- und FP-abgeleiteten Zellen (5C). Interessanterweise ist trotz der CFE Werten variiert wird, alle Zellen, die aus verschiedenen Quellen ausgedrückt ähnliche Niveaus der MSC-Marker. Basierend auf den Ergebnissen der Zelloberflächenmarker wurden die isolierten Zellen aus allen vier Quellen als MSCs angesehen. Eine weitere Analyse dieser Zellen zeigten , dass sie drücken auch Pluripotenz Gene, OCT4, NANOG, KLF4 und SOX2, wie in 5D gezeigt. Die CPJ-MSCs hatte den höchsten Ausdruck von Pluripotenz Marker, gefolgt von WJ, CL- und FP-MSCs. Differenzierungspotenzial von isolierten MSCs Der Goldstandard für MSCs charakterisierenden ist ihre Fähigkeit, verschierentiate in mehrere Linien. Unsere Ergebnisse zeigten, dass isolierte MSCs aus allen der perinatalen Quellen differenziert leicht in adipogenen, chondrogene und osteogene Zelltypen. Adipogenen Derivate hergestellt Lipidtröpfchen , die mit Oil Red O positiv gefärbt waren, wie in 6A gezeigt. Toluidinblau - Färbung des chondrogenen Derivat von MSCs zeigte die Anwesenheit von Proteoglycanen und Glycoproteinen , die in der Produktion der extrazellulären Matrix (6B) unterstützt. Osteogene Derivate von MSCs positiv mit Alizarin Rot gefärbt zeigen die Anwesenheit der Calcium - Ablagerungen in der Knochenmineralisation involviert, wie in 6C gezeigt. Wie erwartet, zeigte die Transkriptionsanalyse von isolierten MSCs aus allen Quellen trilineage Differenzierung (6D -F). Allerdings ist der Topfential Differenzierungs variiert abhängig von der Quelle von MSCs. Adipogenen Derivate von WJ-MSCs hatte 2-fach höhere Expressionsniveaus der ausgewählten Gene adipogenen (CEBPβ, FABP4 und PPAR &amp; ggr;) im Vergleich zu CPJ-MSCs. CL- und FP-MSCs hatte die niedrigste Expression dieser Gene. Im Falle der chondrogenen Differenzierung drückte CPJ-MSCs Derivate chondrogene Gene (SOX9 und COL2) ausgewählten 50-fach höher als die WJ und FP-MSCs Derivate. Ähnlich wie bei den Armen adipogenen Differenzierung von CL-MSCs, hatten sie geringere chondrogene Potential, wie offensichtlich durch die niedrigste Expression von Genen chondrogenetischen. CPJ-MSCs zeigte auch das höchste osteogene Differenzierungspotential, wie es durch das 2-fach höher Transkriptniveaus ausgewählte osteogene Gene angegeben (COL1, OPN und OCN). Jedoch war die Expression des Marker-Vorläufer RUNX2 höchste in osteogenen Derivate von WJ-MSCs, was darauf hinweist, dass diese Zellen in Reaktion auf Differenzierungsbedingungen langsam waren. Auch hier zeigte CL-MSCs schlechtDifferenzierung in osteogenen Linie. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CPJ-MSCs und WJ-MSCs größeres Differenzierungspotenzial als CL- und FP-MSCs angezeigt. Die CL-MSCs hatte das niedrigste Potential in trilineage Derivate zu unterscheiden. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von Zellen aus menschlichen Nabelschnur, Cord-Placenta Junction, und Fetal Placenta. Untersuchen der gesammelte Probe und geht mit der Dissektion. Schritt 1. Manuelles seziert und die Schnur / Plazenta Probe in drei diskrete Bereiche trennen: Nabelschnur (UC), Cord-Placenta - Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP). Man trennt die zwei verschiedenen Zonen des UC in Kord Auskleidung (CL) und die Wharton-Sulze (WJ) mit einer Schere und Pinzette. Schritt 2. Schneiden jede der sezierten Gewebe getrennt in 1-to 2 mm-Stücke einer Schere und teilweise um die Stücke zu verdauen. Schritt 3. Kultur die Gewebestücke. Schritt 4. Isolieren Sie die Zellen aus den Explantaten durch Trypsin - Behandlung. Subkultur und charakterisieren die isolierten Zellen. Schritt 5. isoliert und charakterisiert Zellen können für verschiedene Anwendungen verstärkt und verwendet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig2.jpg" /> Abbildung 2: Dissection und Kultur von Explantaten aus Nabelschnur, Cord-Plazenta Junction, und Fetal Placenta. Dargestellt sind drei verschiedene anatomische Bereiche des Cords / Placenta Beispiels: UC (split in die CL und WJ), CPJ und FP sowie die zugehörigen Arterien und Venen. CL, WJ, CPJ,und FP wurde durch manuelle Dissektion getrennte Zellen aus den Explantaten zu isolieren. Jeder der Bereiche zergliedert wurde getrennt in kleine Fragmente und kultiviert in 75-cm 2 Platten unter Verwendung von 9 ml CM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig3.jpg" /> Abbildung 3: Morphologie der isolierten Zellen aus humanen Nabelschnur, Cord-Placenta Junction, und Fetal Placenta. (A) Zell Auswuchs aus den Explantaten aus Cl, WJ, CPJ und FP, wie durch LM visualisiert. (B) Subkultur der isolierten Zellen aus CL, WJ, CPJ und FP - Explantate zeigten fibroblastoiden Morphologie. Der Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m (Vergrößerung: 4X). (C) Populationsverdopplungszeit von ter isolierte Zellen aus CL, WJ, CPJ und FP. BM-MSCs wurden als Standard verwendet. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert der drei Messungen (** p ≤ 0,01 und * p ≤ 0,05). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig4.jpg" /> Abbildung 4: Koloniebildungsfähigkeit der Zellen von menschlichen Nabelschnur, Cord-Placenta Junction, und Fetal Placenta. (A) Das Wachstum der Zellen (P0) , isoliert aus CL, WJ, CPJ und FP, ausplattiert in einer Dichte von 1,63 klonalen Zellen / cm 2, wurde durch LM visualisiert. (B) Mikroskopische Aufnahmen von Zellen mit Kristallviolett gefärbt Anzeige koloniebildende Fähigkeit. (C) Einzelkolonie von Zellen gefärbt with Kristallviolett. Die Skalierungsbalken stellen 100 um (Vergrößerung: 4X). (D) Grafische Darstellung der Anzahl von Kolonien , die aus den Zellen von CL, WJ, CPJ und FP gebildet abgeleitet. BM-MSCs wurden als Standard verwendet. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert der drei Messungen (** p ≤ 0,01 und * p ≤ 0,05). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig5.jpg" /> Abbildung 5: Analyse von MSC Marker von den von Human Umbilical Cord, Cord-Placenta Junction isolierten Zellen exprimiert und Fetal Placenta. (A) Expression von mesenchymalen Oberflächenmarkern (CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105) durch die Zellen aus CL, WJ, CPJ und FP als abzuschreckenmittels Durchflusszytometrie abgebaut. (B und C) Grafische Darstellung der Prozentsatz der positiven Zellen und die mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) -Verhältnisse für die ausgewählten mesenchymalen Oberflächenmarker. MFI-Verhältnisse wurden durch Dividieren des MFI-Wert des Markers (erzeugt von der Software auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität von gated Zellpopulationen), berechnet durch den MFI-Wert des Isotyps. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert der drei Messungen. (D) Die Expression der Gene Pluripotenz (OCT4, NANOG, KLF4 und SOX2) durch die Zellen aus CL, WJ, CPJ und FP, wie durch qRT-PCR bestimmt. (** p ≤ 0,01 und * p ≤ 0,05). Die Genexpression wurde zu GAPDH und β-Actin normalisiert, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert der drei Messungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 6: Multilineage Differenzierung von MSCs Isoliert von Nabelschnur, Cord-Placenta Junction, und Fetal Placenta. (A) Die Zellen wurden für 3 Wochen in adipogenen Differenzierungsmedium inkubiert und gefärbt mit Oil Red O, was das Vorhandensein von Lipidtröpfchen. (B) Die Zellpellets wurden in chondrogenen Differenzierungsmedium für 3 Wochen inkubiert. Histologische Cryoschnitten Pelletkulturen wurden mit Toluidinblau gefärbt, um das Vorhandensein von Glykosaminoglykanen anzeigt. (C) Die Zellen wurden für 3 Wochen in osteogenen Differenzierungsmedium inkubiert und mit Alizarin rot gefärbt, die Produktion von Kalkablagerungen Anzeigen darauf hindeutet Knochenmineralisation. Alle Bilder wurden von LM erhalten. Der Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m (Vergrößerung: 4X). BM-MSCs wirwieder als Standard verwendet. (DF) Expression ausgewählter Gene (CEBPβ, FABP4 und PPAR &amp; ggr; SOX9, ACAN und COL2 und COL1, RUNX2, OPN und OCN die Differenzierung von MSCs in adipogenen darstellt, chondrogene und osteogene Abstammungslinien, jeweils), bestimmt durch qRT-PCR-Analyse (** p ≤ 0,01 und * p ≤ 0,05). Genexpression wurde GAPDH normalisiert und β-Actin, und Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert der drei Messungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Gen </td><td> Primer - Sequenzen </td><td> Produktlänge </td></tr><tr><td> OCT4 </td><td> Zukunfts CCCCTGGTGCCGTGAA </td><td> 97 </td></tr><tr><td></td><td> Rückwärts-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> NANOG </td><td> Forward- AAAGAATCTTCACCTATGCC </td><td> 110 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT </td><td></td></tr><tr><td> KLF4 </td><td> Forward- CGAACCCACACAGGTGAGAA </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX2 </td><td> Forward- TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA </td><td> 75 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX9 </td><td> Forward- AGCGAACGCACATCAAGAC </td><td> 85 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG </td><td></td></tr><tr><td> COL2 </td><td> Forward- CTCGTGGCAGAGATGGAGAA </td><td> 252 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- CACCAGGTTCACCAGGATTG </td><td></td></tr><tr><td> EINE KANNE </td><td> Forward- AGCCTGCGCTCCAATGACT </td><td> 103 </td></tr><tr><td></td><td&gt; Reverse- GGAACACGATGCCTTTCACC </td><td></td></tr><tr><td> COL1 </td><td> Forward- AAGGTCATGCTGGTCTTGCT </td><td> 114 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- GACCCTGTTCACCTTTTCCA </td><td></td></tr><tr><td> RUNX2 </td><td> Forward- TGCTTCATTCGCCTCACAAA </td><td> 111 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- AGTGACCTGCGGAGATTAAC </td><td></td></tr><tr><td> OPN </td><td> Forward- CATACAAGGCCATCCCCGTT </td><td> 112 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC </td><td></td></tr><tr><td> OCN </td><td> Forward- TAAACAGTGCTGGAGGCTGG </td><td> 191 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- CTTGGACACAAAGGCTGCAC </td><td></td></tr><tr><td> CEBPβ </td><td> Forward- TATAGGCTGGGCTTCCCCTT </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG </td><td></td></tr><tr><td> FABP4 </td><td> Forward- TTAGATGGGGGTGTCCTGGT </td><td> 158 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA </td><td></td></tr><tr><td> PPAR </td><td> Forward- GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC </td><td> 74 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG </td><td></td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> Forward- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG </td><td> 101 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- GCCATCACGCCACAGTTTC </td><td></td></tr><tr><td> ACTIN </td><td> Forward- AATCTGGCACCACACCTTCTAC </td><td> 170 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Menschen Primer - Sequenzen in dieser Studie verwendet.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mesenchymale stromale Zellen aus vier verschiedenen perinatalen Gewebeproben zu isolieren: der Nabelschnurmembran, der Gallertschicht (Wharton's jelly), der Verbindungsstelle von Nabelschnur und Plazenta sowie der fetalen Plazenta. Diese Methode kann zur Weiterentwicklung der Stammzellbiologie und der alternativen Medizin beitragen, indem sie auf nicht-invasive Weise hochwertige mesenchymale Stammzellen gewinnt. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie produktiv große Mengen homogener Zellpopulationen von hoher Qualität aus unterschiedlichen perinatalen Gewebeproben liefert.Multipotente, aus dieser Technik gewonnene mesenchymale stromale Zellen der Nabelschnur können zur Behandlung verschiedener Erkrankungen und Störungen eingesetzt werden, da sie ursprünglicher sind als mesenchymale Stammzellen, die aus adulten Geweben isoliert wurden. Diese Methode kann Einblicke in die Eigenschaften mesenchymaler stromaler Zellen aus unterschiedlichen Segmenten und spezifischen Nischen der Nabelschnur und Plazenta liefern. Beginnen Sie damit, die Probe in einer 150 Millimeter Petrischale auf Eis in einem Biosicherheitswerkbank zu platzieren, und spülen Sie das Gewebe mehrmals mit eiskaltem PBS unter Verwendung einer Nadel und einer Spritze aus.Wenn alle Blutgerinnsel entfernt wurden, untersuchen Sie die Probe sorgfältig, um die verschiedenen anatomischen Regionen zu identifizieren. Greifen Sie dann mit der Pinzette das fetale Ende der Nabelschnur und schneiden Sie mit der Schere vorsichtig einen Einschnitt am oberen Rand der Schnur-Plazenta-Verbindung. Führen Sie einen zweiten Einschnitt unterhalb der Verbindung durch, um die Schnur-Plazenta-Verbindung von der Plazenta zu trennen.Und teilen Sie die getrennten Gewebe in einzelne Petrischalen auf. Schneiden Sie als Nächstes die Nabelschnur längs, um die Blutgefäße und das umgebende Whartonsche Gel vollständig freizulegen, ohne das Epithel zu beschädigen. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Whartonsche Gel vorsichtig von den Blutgefäßen und dem Interstitium des Subamnions abzukratzen.Entfernen Sie anschließend die Blutgefäße und überführen jegliches verbleibende perivaskuläre Gelee unterhalb und um die Blutgefäße herum in die Whartonsche-Gelee-Schale. Legen Sie das verbleibende Nabelschnurgewebe in eine eigene Schale. Nachdem alle Gewebe präpariert wurden, ersetzen Sie das PBS in jeder Schale durch drei bis fünf Milliliter Trypsin und zerkleinern jede Gewebeprobe mit einer Schere in Stücke von ein bis zwei Millimetern Größe. Führen Sie eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid durch. Beobachten Sie mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops die partielle Verdauung, indem Sie die Freisetzung von Zellen aus dem Gewebe sichtbar machen.Am Ende der partiellen Verdauungszeit das Trypsin durch Zugabe eines gleichen Volumens an Kulturmedium neutralisieren und die Proben in einzelne kegelförmige 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Gewebestücke drei Minuten lang absitzen lassen. Anschließend vorsichtig den Überstand abpipettieren und 15 bis 20 teilweise verdauten Gewebestücke pro Probe in einzelne 75-Quadratzentimeter-Zellkulturflaschen ausplattieren.Fügen Sie anschließend neun Milliliter Kulturmedium hinzu, um eine Inkubation über zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius durchzuführen. Wechseln Sie das Kulturmedium nach drei Tagen und untersuchen Sie die Xplants mittels Phasenkontrastmikroskopie auf Zellauswanderung. Wenn das Zellwachstum eine Konfluenz von 70 Prozent erreicht hat, lösen Sie die Zellen in ein bis zwei Milliliter Trypsinlösung pro Kolben auf, rotieren Sie den Kolben für eine gleichmäßige Benetzung mit der Enzymlösung und inkubieren Sie die Kulturen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Anschließend neutralisieren Sie die Reaktion mit ein bis zwei Milliliter Kulturmedium. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedium zur Unterpflanzung mit einer Aussaatdichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Quadratzentimeter. Die Zellen aus der Nabelschnurmembran- und Wharton’schen-Gallert-Kulturen weisen Werte für die Koloniebildungs-Effizienz von 59 bzw. 80 Kolonien auf.Der Wert der Koloniebildungsrate der Zellen aus der Nabelschnur-Plazentagrenze ist jedoch vergleichbar mit dem von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark, was darauf hindeutet, dass die aus der Nabelschnur-Plazentagrenze gewonnenen Zellen höhere proliferative und Selbstvermehrungsfähigkeiten besitzen. Eine zytometrische Analyse der Einzelzell-Suspensionen, die aus diesen perinatalen Geweben isoliert wurden, zeigt, dass die Anteile positiver Zellen für spezifische Marker mesenchymaler Stammzellen aus allen vier Gewebequellen denen der Standard-Mesenchymalzellen aus Knochenmark ähneln. Die medianen Fluoreszenzintensitätsverhältnisse deuten jedoch darauf hin, dass die aus Whartonscher Pulp und der Nabelschnur-Plazentagrenze stammenden Zellen denen aus der fötalen Plazenta-Linie sehr ähnlich oder sogar überlegen sind.Interessanterweise exprimieren alle Zellen aus den verschiedenen perinatalen Quellen, trotz unterschiedlicher Werte hinsichtlich ihrer Koloniebildungs-Effizienz, ähnliche Mengen an Pluripotenzmarkern in der quantitativen RT-PCR-Analyse, mit Ausnahme der mesenchymalen Stromazellen aus der Nabelschnur-Plazenta-Übergangsregion, die die höchsten Expressionsniveaus für alle getesteten Pluripotenzmarker aufwiesen. Darüber hinaus differenzieren sich die mesenchymalen Stromazellen aus allen perinatalen Quellen leicht in adipogene, chondrogene und osteogene Zelltypen und zeigen somit eine tri-lineare Differenzierungsfähigkeit. Allerdings variiert das Differenzierungspotential je nach Herkunft der mesenchymalen Stromazellen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei effizienter Durchführung in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die laterale Technik zu üben und eine Kreuzkontamination zwischen den Gewebeproben zu vermeiden. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, um die Beschaffenheit von Stammzellnischen in perinatalen Geweben zu untersuchen.

isolation-characterization-mesenchymal-stromal-cells-from-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben ein Differenzierungspotenzial in Richtung osteoblastischer Linie, wenn sie mit löslichen Faktoren oder spezifischen Biomaterialien stimuliert werden. Diese Arbeit stellt eine neuartige Option für die Verabreichung von MSCs aus der humanen Amnionmembran (AM-hMSCs) vor, die die bovine Knochenmatrix Nukbone (NKB) als Gerüst verwendet.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.

Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Diese Studie stellt ein einzigartiges stumpfes Dissektionsverfahren vor, um die Integrität von Wharton-Gelee (WJ) zu erhalten, was zu weniger beschädigtem WJ und einer größeren Menge und Lebensfähigkeit der entnommenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) führt. Die Methode zeigt eine überlegene Ausbeute und Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen scharfen Dissektionsmethoden.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus der Nabelschnur mit hoher Ausbeute und geringer Schädigung

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopf Muskeln über ein 9 Wochen alten Ratte. Die Muskeln aus unterschiedlichen Kiemenbögen. Anschließend werden die Satellitenzellen auf einem Spotlackierung von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Expansion und Passagieren von Satellitenzellen.

Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Lernen Sie die Isolierung mesenchymaler Stromazellen aus Nabelschnur und Plazenta mittels Explantatkultur. Diese Methode liefert hochwertige Zellpopulationen für die Stammzellbiologie.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

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