Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta
3. April 2017
Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mesenchymale Stromazellen aus vier verschiedenen perinatalen Gewebequellen zu isolieren: der Nabelschnurschleimhaut, dem Wharton-Gelee, dem Nabelschnur-Plazenta-Übergang und der fetalen Plazenta. Diese Methode kann dazu beitragen, das Gebiet der Stammzellbiologie und der alternativen Medizin voranzubringen, indem mesenchymale Stammzellen von besonderer Qualität nicht-invasiv gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie produktiv eine große Anzahl hochwertiger homogener Zellpopulationen aus unterschiedlichen perinatalen Gewebequellen liefert.
Multipotente mesenchymale Stromazellen, die aus dieser Technik gewonnen werden, können zur Behandlung verschiedener Krankheiten und Störungen eingesetzt werden, da sie primitiver sind als mesenchymale Stammzellen, die aus adultem Gewebe isoliert wurden. Diese Methode kann Aufschluss über die Eigenschaften von mesenchymalen Stromazellen aus verschiedenen Segmenten und spezifischen Nischen des Rückenmarks und der Plazenta geben. Beginnen Sie damit, die Probe in eine 150 Millimeter große Petrischale auf Eis in einer Bio-Sicherheitswerkbank zu legen und spülen Sie das Gewebe mit Nadel und Spritze mehrmals mit eiskaltem PBS aus.
Wenn alle Blutgerinnsel entfernt wurden, untersuchen Sie die Probe sorgfältig, um die verschiedenen anatomischen Regionen zu identifizieren. Fassen Sie dann mit einer Zange das fötale Ende der Nabelschnur und verwenden Sie eine Schere, um vorsichtig einen Schnitt an der Spitze des Nabelschnur-Plazenta-Übergangs zu machen. Machen Sie einen zweiten Schnitt unterhalb des Übergangs, um den Nabelschnur-Plazenta-Übergang von der Plazenta zu trennen.
Und teilen Sie das abgetrennte Gewebe in einzelne Petrischalen auf. Als nächstes schneiden Sie die Nabelschnur in Längsrichtung durch, um die Blutgefäße und das umgebende Wharton-Gelee vollständig freizulegen, ohne das Epithel zu stören. Kratzen Sie mit einem Skalpell das Wharton-Gelee von den Blutgefäßen und dem Interepithel des Subamnions ab.
Entfernen Sie dann die Blutgefäße, übertragen Sie das verbleibende perivaskuläre Gelee unter und um die Blutgefäße in die Wharton-Geleeschale und legen Sie das verbleibende Nabelschnurauskleidungsgewebe in eine eigene Schale. Wenn alle Gewebe präpariert sind, ersetzen Sie das PBS in jeder Schale durch drei bis fünf Milliliter Trypsin und schneiden Sie jede Gewebeprobe mit einer Schere in ein bis zwei Millimeter große Stücke für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop, um die partielle Verdauung zu beobachten, indem Sie die Freisetzung von Zellen aus dem Gewebe visualisieren.
Am Ende der Teilaufschlussphase wird das Trypsin mit einem gleichen Volumen Kulturmedium neutralisiert und die Proben in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Lassen Sie die Taschentücher drei Minuten lang ruhen. Anschließend wird der Überstand vorsichtig aspiriert und 15 bis 20 teilverdaute Gewebestücke pro Probe in einzelne 75 Quadratzentimeter große Gewebekulturflaschen abgefüllt.
Fügen Sie als Nächstes neun Milliliter Nährmedium für eine zwei- bis dreitägige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu. Wechseln Sie nach drei Tagen das Nährmedium und untersuchen Sie die Xplants mit dem Phasenkontrastmikroskop auf Zellwachstum. Wenn das Zellwachstum eine Konfluenz von 70 Prozent erreicht, dissoziieren Sie die Zellen in ein bis zwei Millilitern Trypsinlösung pro Kolben, drehen Sie den Kolben für eine gleichmäßige Beschichtung mit der Enzymlösung und inkubieren Sie die Kulturen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Anschließend wird die Reaktion mit ein bis zwei Millilitern Nährmedium neutralisiert. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, indem Sie das Pellet in Kulturmedium für die Subkultur bei einer Aussaatdichte von eins mal zehn bis zu den vierten Zellen pro Quadratzentimeter resuspendieren. Die Zellen aus der Nabelschnurauskleidung und den Wharton'schen Geleekulturen weisen koloniebildende Effizienzwerte von 59 bzw. 80 Kolonien auf.
Der Wert der koloniebildenden Effizienz der Nabelschnur-Plazenta-Übergangszellen ist jedoch ähnlich wie bei mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks, was darauf hindeutet, dass Zellen aus dem Nabelschnur-Plazenta-Übergang höhere proliferive und Selbsterneuerungsfähigkeiten aufweisen. Eine metrische Analyse der Einzelzellsuspensionen, die aus diesen perinatalen Geweben isoliert wurden, zeigt, dass die Prozentsätze positiver Zellen für spezifische mesenchymale Stammzellmarker aus allen vier Gewebequellen ähnlich sind wie bei standardmäßigen mesenchymalen Zellen aus dem Knochenmark. Die medianen Fluoreszenzintensitätsverhältnisse deuten jedoch darauf hin, dass die von Wharton-Gelee und Nabelschnur-Plazenta-Übergang abgeleiteten Zellen sehr ähnlich oder höher sind als die Nabelschnurauskleidung in fetalen Plazentazellen.
Interessanterweise exprimieren trotz ihrer unterschiedlichen Werte für die koloniebildende Effizienz alle Zellen aus den verschiedenen perinatalen Quellen in der quantitativen RTPCR-Analyse ähnliche Niveaus an Pluripotenzmarkern, mit Ausnahme der mesenchymalen Stromazellen, die von der Nabelschnur-Plazenta-Verbindung abgeleitet sind und die höchsten Expressionsniveaus für alle getesteten Pluripotenzmarker exprimierten. Darüber hinaus differenzieren mesenchymale Stromazellen, die aus allen perinatalen Quellen isoliert wurden, leicht in adipogene, chondrogene und osteogene Zelltypen und zeigen eine Triliniendifferenzierung. Das Differenzierungspotenzial variiert jedoch je nach mesenchymaler Stromazellquelle.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie effizient ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die laterale Technik zu üben und eine Kreuzkontamination zwischen den Gewebequellen zu vermeiden. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, um die Natur von Stammzellnischen in perinatalen Geweben zu erforschen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion der menschlichen Nabelschnur und der fetalen Plazenta zur Isolierung mesenchymaler stromaler Zellen (MSCs) mithilfe der Explantkulturtechnik. Die Methode ermöglicht die Charakterisierung von MSCs aus unterschiedlichen perinatalen Geweben, was zur Weiterentwicklung der Stammzellbiologie beiträgt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Regenerativmedizin
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Mesenchymale stromalzellen (MSCs) besitzen therapeutisches Potenzial aufgrund ihrer Multipotenz.
- Perinatale Gewebe sind reichhaltige Quellen primitiver mesenchymaler Stammzellen (MSCs).
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Ausbeute an hochwertigen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Nabelschnur und Plazenta zu verbessern.
- Das Verständnis der Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus verschiedenen Gewebequellen kann deren klinische Anwendungen unterstützen.
Zweck der Studie
- Gewinnung von MSCs aus dem Nabelschnurlining, der Gallertschicht (Wharton’s Jelly), der Verbindungsstelle von Nabelschnur und Plazenta sowie aus der fetalen Plazenta.
- Beurteilung der Qualität und Eigenschaften der aus diesen Geweben gewonnenen MSCs.
- Bereitstellung einer nicht-invasiven Methode zur Gewinnung von MSCs für Forschung und therapeutische Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Dissektion der Nabelschnur und Plazenta in unterschiedliche anatomische Regionen.
- Verwendung von Trypsin zur partiellen Verdauung von Gewebeproben.
- Kultur der dissezierten Gewebe unter spezifischen Kulturbedingungen.
- Beurteilung des Zellwachstums und Charakterisierung mittels Mikroskopie und Durchflusszytometrie.
Hauptergebnisse
- Hohe Kolonie-bildende Effizienz wurde in Zellen aus dem Whartonschen Gallert und der Nabelschnur-Plazenta-Verbindung beobachtet.
- Alle mesenchymalen Stromazellen (MSCs) exprimierten ähnliche Pluripotenzmarker, wobei Unterschiede in der Expressionsstärke auftraten.
- Die mesenchymalen Stromazellen (MSCs) zeigten die Fähigkeit zur Differenzierung in mehrere Zelllinien.
- Die Methode kann innerhalb von zwei bis drei Stunden effizient durchgeführt werden.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige Methode zur Isolierung hochwertiger MSCs aus perinatalen Geweben bereit.
- Das Verständnis der Eigenschaften von MSCs aus verschiedenen Quellen kann deren therapeutische Anwendungen verbessern.
- Es wird empfohlen, die Stammzellnischen in perinatalen Geweben weiter zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung mesenchymaler stromaler Zellen (MSCs) aus verschiedenen perinatalen Gewebeproben und bietet eine nichtinvasive, ethisch vorteilhafte Alternative zu aus Knochenmark gewonnenen MSCs. Durch den Vergleich anatomischer Regionen wie der Nabelschnur-Plazenta-Übergangszone (CPJ), der Gallertschicht (WJ), der Nabelschnurmembran (CL) und der fetalen Plazenta (FP) unterstützt die Methode die Zielvalidierung und das mekanistische Risikomanagement in regenerativen Medizin-Pipelines. Die höhere koloniebildende Effizienz und die stärkere Expression von Pluripotenzmarkern, die bei aus CPJ gewonnenen MSCs beobachtet wurden, liefern eine vorhersagbare Zuverlässigkeit für Anwendungen in der Zelltherapie und helfen bei der Identifizierung führender Kandidaten sowie der Selektion von Wirkstoffen innerhalb eines Portfolio-Managements.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Isolierung von MSCs aus diskreten perinatalen Nischen mit unterschiedlichen Proliferations- und Selbstvermehrungskapazitäten.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch funktionelle Validierung der Multipotenz entlang adipogener, chondrogener und osteogener Linien.
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in den Zielansatz, indem die CPJ als potente MSC-Quelle mit überlegener Kolonie-bildender Effizienz und Expression von Pluripotenzmarkern identifiziert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Operativer Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem homogene, adhärente MSC-Populationen mit definierten Oberflächenmarkern (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105) gewonnen werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Trägt durch konsistente Explantenkulturtechniken und quantitative Ausgangsgrößen wie Koloniebildungs-Effizienz und Durchflusszytometrie-Parameter zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei.
- Operativer Wert: Unterstreicht die Eignung für das Screening und die Skalierbarkeit, da das Protokoll innerhalb von zwei bis drei Stunden abgeschlossen ist und somit eine zuverlässige Wirkstoffbewertung in präklinischen Screening-Kaskaden ermöglicht.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz und die Übereinstimmung mit translationalen Biomarkern, indem die tri-lineare Differenzierungsfähigkeit gezeigt wird, ein zentraler funktioneller Endpunkt für die präklinische Validierung.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität vom Entdeckungsstadium bis zur präklinischen Validierung, indem mesenchymale Stromazellen bereitgestellt werden, die eine adhärente, fibroblastenähnliche Morphologie sowie Oberflächenmarkern aufweisen, die mit denen aus Knochenmark gewonnener mesenchymaler Stromazellen vergleichbar sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungsrisikoverringerungswert, indem gezeigt wird, dass sich CPJ-MSCs effizienter differenzieren als solche aus anderen Quellen, was risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung unterstützt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung bis zur Leitstrukturfeststellung und präklinischen Arbeit und unterstützt Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen sowie die biologische Risikominderung durch anatomisch aufgelöste MSC-Isolierung.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen unterstützt, indem sie den Vergleich von MSC-Eigenschaften aus Nabelschnurlining, Whartonscher Gelatine, Nabelschnur-Plazenta-Übergang und fetaler Plazenta ermöglicht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft für Assays, Reproduzierbarkeit und quantitative Ergebnisse wie die koloniebildende Effizienz (59 für CL, 80 für WJ, vergleichbar mit BM für CPJ) sowie die Analyse der Markerausprägung mittels Durchflusszytometrie.
- Analytik: Betont Messgrößen wie die koloniebildende Effizienz, Fluoreszenzintensitätsverhältnisse und quantitative RT-PCR für Pluripotenzmarker, die Teams dabei helfen, Bedingungen zu vergleichen und den Vorhersagewert zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Differenzierung von MSCs in adipogene, chondrogene und osteogene Linien demonstriert und so die Abstimmung von Biomarkern sowie die funktionelle Validierung unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar statt als Einmaltechnik und ermöglicht dadurch eine Standardisierung über verschiedene perinatale Gewebequellen hinweg für eine konsistente MSC-Versorgung in Programmen der regenerativen Medizin.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten durch anatomisch aufgelöste MSC-Isolierung und funktionelle Charakterisierung.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit mittels Explantenkultur, definierter Verdauungsparameter und konsistenter Ansiedlungsdichte (1×10⁴ Zellen/cm²).
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und reduziertes biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien durch frühzeitige Identifizierung hochwirksamer MSC-Quellen wie CPJ in der Entdeckungsphase.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend auf unterschiedlicher Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierungseffizienz zwischen perinatalen MSC-Quellen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse umfassen Gewebeexzision, sterile Zellkultur und Durchflusszytometrie zur Markerauswertung.
- Zu den erforderlichen Instrumenten und analytischen Infrastrukturen gehören Phasenkontrastmikroskopie, Zentrifugen, Inkubatoren (37 °C, 5 % CO₂) und Durchflusszytometer zur Bestimmung von CD-Markern und Fluoreszenzintensität.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg beinhalten konsistente Protokolle für die Gewebeexzision, Trypsinneutralisation und Ansiedlungsdichten, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen.
- Anpassungsüberlegungen bei verschiedenen Modellsystemen umfassen die Anpassung der Explantatgröße und Verdauungszeit je nach Gewebequelle, da die Auswuchsdauer variiert (3–4 Tage für CPJ, 7–10 Tage für CL/WJ, 11–14 Tage für FP).
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, beinhalten die Notwendigkeit, Kreuzkontaminationen zwischen verschiedenen Gewebeproben während der Exzision zu vermeiden, sowie die Variabilität der koloniebildenden Effizienz und der Auswuchszeit zwischen verschiedenen anatomischen Regionen.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
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Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
