Name: Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die hydraulische Extrusion des Rückenmarks und die Isolierung von Dorsalwurzelganglien bei Nagetieren. Diese schnelle Methode minimiert Gewebeschäden und ermöglicht präzise DRG-Identifizierung für neurobiologische Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchten David Kiel, Universität Aarhus, für das Filmen und Schneiden danken. Für die Verarbeitung von Mikroskop-Videosequenzen wurde die Software VirtualDub verwendet. Wir danken dem dänischen Forschungsinstitut für Translationale Neurowissenschaften - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, für den Zugang zu den Geräten und der Aarhus University Research Foundation, dem EU 7FP-Projekt PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) und der Lundbeck Foundation für die Finanzierung.

Alle Tiere wurden in voller Übereinstimmung mit dem dänischen und europäischen Vorschriften behandelt. Permission Nummer: 2012-15-2934. 1. Vorbereitung der Spritze für Hydraulik Extrusion des Spinal Cord <ol><li> Für einen erwachsenen Ratte, eine 10-ml-Spritze verwenden. Für einen erwachsenen Maus, verwenden Sie eine 5-ml-Spritze. Für Welpen, verwenden Sie eine 2,5-ml-Spritze. </li><li> Stellen Sie eine nicht-Filterpipettenspitze universell passend für 2-200 ul Pipetten durch das große Ende der Pipettenspitze trimmen, bis sie fest auf die Spritze passt. Legen Sie die eingestellte Pipettenspitze auf der Spritze. Für Welpen, eine 23 G oder ähnliche Nadel anstelle einer angepassten Pipettenspitze verwenden. </li><li> Absaugen eiskaltem sterilem PBS und die Spritze auf Eis bis zur weiteren Verwendung überlassen. </li></ol> 2. Euthanasie <ol><li> Nicht Genickbruch führen, da dies die Wirbelsäule Extrusion unmöglich macht stören. </li><li> Für erwachsene Ratte / Maus, einschläfern Gas wie CO 2 oder isofluRane. Diese Substanzen sind schädlich. Führen Sie die Euthanasie in einer Abzugshaube und behandeln die Substanzen gemäß Institution Richtlinien. (ACHTUNG: CO 2: H280, P410, P403, Isofluran: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Um sicherzustellen, dass das Nagetier tot ist, sicherzustellen, ohne Reflex durch eine Pfote mit einer Pinzette Kneifen. Enthaupten die Nager mit großen Schere. Für Welpen, durch Enthauptung einschläfern. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung der Wirbelsäule <ol><li> Streuen Sie Wasser auf das Fell die Haare zu steuern. </li><li> Verwendung einer Schere aufgeschnitten das Fell entlang der Wirbelsäule in einer distalen Richtung und isolieren der Wirbelsäule durch entlang der Wirbelsäule vorbei an der Beckenknochen auf beiden Seiten zu schneiden. Schneiden Sie das Rückenmark distal mit dem Beckenknochen mit einer Schere. HINWEIS: Die rostral-caudale Achse wird als die proximal-distale Achse gesamten Protokoll bezeichnet. <ol><li> Schneiden Sie die Wirbelsäule mit einer Schere die proximal zu vermeidenesten und am weitesten distal gelegenen Bereiche wie diese können die Wirbelsäule zu S-förmig für eine erfolgreiche Extrusion Rückenmark machen. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark an beiden Enden sichtbar ist. Wenn das Rückenmark nicht sichtbar ist, schneiden Sie die Wirbelsäule mit einer Schere, bis das Rückenmark sichtbar wird. </li></ol></li></ol> 4. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks <ol><li> Legen Sie eine Petrischale (100 mm Durchmesser) gefüllt mit sterilem PBS auf Eis. </li><li> Begradigen die Wirbelsäule durch einen Zeigefinger auf dem gebogenen Teil (am weitesten proximal gelegenen Ende) der Wirbelsäule Anwendung, wodurch die Wirbelsäule so viel wie möglich Begradigung. <ol><li> Für Welpen, vermeiden Sie die Wirbelsäule Biegen, als die Wirbel wird Rendering Rückenmark Extrusion unmöglich gestört werden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Pipettenspitze (23 G-Nadel für Welpen, alternativ 18 G-Nadel für erwachsene Mäuse) an der am meisten distalen Ende der Wirbelsäule. Wenn es richtig eingesetzt ist, wird die Spitze im Rücken Hohlraum stabilisiert. </li><li> Sicherzustellen, dass die Wirbelsäule so viel wie möglich begradigt wird. Wenden Sie stetigen Druck, und extrudieren das Rückenmark in die Petrischale auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark auf Eis feucht zu halten, indem sie es in PBS, bis die weitere Handhabung zu halten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Rückenmark. Hydraulisch Rückenmark extrudiert. Von links nach rechts: erwachsenen Ratte, erwachsenen Maus, Maus pup. Lendenwirbel Vergrößerungen von Feld markiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 5. Identifizierung von Dorsalwurzelganglien (DRGs) <ol><li> Teilen Sie die Wirbelsäule in zwei gleiche Teile Längs Schere und legen Sie die geteilte Wirbelsäule unter dem Mikroskop. </li><li> Identifizieren Sie die T13 Wirbels Segment<html> die Bindungsstelle des am weitesten distal gelegenen Costae auf die Wirbelsäule Aufmerksamkeit Ortung nicht Costae mit den nahe gelegenen Interkostalnerven zu verwirren. Die am weitesten distal gelegenen Costae werden dem proximalen Teil des Wirbels T13 Segment befestigt und das T13 DRG distal zu Wirbel T13 und proximal zu Wirbels L1 angeordnet. </li><li> Identifizieren gleichzeitige DRGs in distaler Richtung. Für einen erwachsenen Ratte, erscheinen die gleichzeitige DRGs weiß mit deutlich sichtbaren dorsalen und ventralen Wurzeln. Für einen erwachsenen Maus, erscheint begleitend DRGs weiß mit deutlich sichtbaren dorsalen und ventralen Wurzeln. Für Welpen, erscheinen die gleichzeitige DRGs als klare Sphären. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Abbildung 2: Identifizierung von DRGs in der Wirbelsäule nach der Extrusion des Rückenmarks. Die Wirbelsäule wurde aufgeteilt Visualisierung von DRGs ermöglicht, wie durch Pfeile angedeutet ist. Am Beispiel von erwachsenen Ratte und Maus pup.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 6. Isolierung von DRGs <ol><li> Anzahl Petrischalen (30 mm Durchmesser) entsprechend der spezifischen DRGs isoliert werden, beispielsweise L3, L4, L5. Füllen Sie die Petrischalen mit eiskaltem sterilem PBS und legen Sie sie auf Eis. </li><li> Mit Mikro Schere, schnitt dorsalen und ventralen Wurzeln so nah an den DRGs wie möglich, sie zu lösen, während die DRGs zu vermeiden beschädigen. </li><li> Mit der Spitze geschlossenen Pinzette, Schaufel sanft DRGs und übertragen sie an die entsprechenden nummerierten Petrischalen. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative isoliert DRGs. Von links nach rechts: erwachsenen Ratte, erwachsenen Maus, Maus pup.&quot;_blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 7. Verarbeitung von Geweben für die weitere Analyse <ol><li> Western-Blotting <ol><li> Isolieren Sie die Gewebebereich von Interesse, wie zB das Rückenmark Lendenanschwellung. Bei Bedarf trennen das Rückenmark in ipsilateralen und kontralateralen Seiten und weiter in dorsalen und ventralen Hörnern. </li><li> Platzieren des Gewebes in Lysepuffer wie TNE Lysepuffer (10 mM Tris-Base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in doppelt destilliertem H 2 O) , die geeignete Enzyminhibitoren auf Eis. </li><li> Homogenisieren für das Gewebe etwa 30 s auf Eis ein mechanisches Schleifen Stößel. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 16000 × g bei 4 ° C und mit den Überstand zur weiteren Verarbeitung nach Standardprotokollen 5, 6 oder Halten der Überstand bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> RNA-Analyse <ol><li> Isolieren Sie das Gewebe von Interesse. </li><li> Ab sofort setzen das Gewebe in Lösung RNA-Stabilisierung der RNA für die Lagerung zu stabilisieren. </li><li> Isolieren RNA nach Standardprotokollen 7. </li><li> Konvertieren RNA zu cDNA und führen qPCR nach Standardprotokollen 7. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Für gefrorenes Frischgewebe (für Rückenmark): <ol><li> Bereiten Sie Trockeneispulver durch Trockeneis Würfel Pulverisieren zu einer Menge, die zwei Esslöffel Pulver entspricht. Decken trocken Eiswürfel in ein Tuch und pulverisieren die Würfel mit einem Hammer. Platzieren Silberfolie (ca. 5 cm x 5 cm) auf einer Schicht aus trockenem Eiswürfel und decken die Silberfolie mit Trockeneispulver. </li><li> Legen Sie das Rückenmark-Bereich für weitere Analysen auf der Trockeneispulver ausgewählt Pinzette, lassen Sie es Snap-freeze, und übertragen das Rückenmark zu einem Kryo Röhrchen. Halten Sie es auf Trockeneis zu allen Zeiten oder lagern Sie es bei -80 ° C bis uns weitere. </li><li> Übertragen, das Rückenmark zu einem Kryostaten (-20 ° C). Wenn nötig, schneiden Sie das Rückenmark im Inneren des Kryostaten. Legen Sie das Rückenmark in Einbettungsmaterial im Innern des Kryostaten, um es an die Objektplatte zu befestigen. </li><li> Schneiden Sie das Rückenmark in der gewünschten Dicke, beispielsweise 5 &amp; mgr; m, und sammeln sich auf Glasplatten. Erhitzen Sie die Glasplatten mit einem Finger unmittelbar vor der Gewebesammlung für eine bessere Befestigung. Halten Sie alle übrig gebliebenen Gewebe in Kryoröhrchen bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Lassen Sie die Abschnitte auf Glasplatten im Inneren des Kryostaten, bis sie bereit für die Post-Befestigung. </li><li> Post-fix die Abschnitte durch Eintauchen in 4% PFA für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li><li> Fixiertem Gewebe für Kryo-Schnitte (für Rückenmark und DRGs) <ol><li> Fix Rückenmark und DRGs in 4% PFA (2 h für Rückenmark, 1,5 h für Maus DRGs und 4 h für Ratten-DRGs) bei4 ° C (in horizontaler Lage des Rückenmarks zu verhindern, dass in einer gebogenen Stellung von Befestigung). </li><li> Übertragen, um das Gewebe zu 25% w / v Saccharose über Nacht bei 4 ° C. Das Gewebe kann in 25% w / v Sucrose gespeichert werden Azid supplementiert mit wenigen Tropfen 10% -iger mikrobieller Kontamination bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu verhindern. Wenn nötig, schneiden Sie das Rückenmark nur die Lendenanschwellung zu bilden auf einem Silikon-Karton oder ähnliches. </li><li> Mit der Spitze eines Papiertuch, aspirieren aus dem Gewebe überschüssige Saccharoselösung. </li><li> Füllen Sie eine Kryo Form halber Strecke Material mit einzubetten. Schieben Sie alle Blasen an den Seiten der Kryo-Form mit Werkzeugen wie geschlossene Pinzette. </li><li> Legen Sie das Gewebe auf dem Einbettungsmaterial mit einer Pinzette und sorgen für die gewünschte Gewebeorientierung. </li><li> Füllen Sie die Kryo Form vollständig mit Einbettungsmaterial und schieben so weit weg von dem Gewebe wie möglich alle Blasen (zB durch geschlossene Pinzette). </li><li> Füllen Sie eine Petrischale (100 mmim Durchmesser) mit 2-methylbutan. Diese Substanz ist schädlich. Führen Sie diesen Schritt in einer Abzugshaube und geht mit dem Stoff gemäß Institution Richtlinien (ACHTUNG: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Legen Sie die Petrischale auf einer Schicht aus Trockeneis und fügen Sie zwei trockene Eiswürfel in die Petrischale. Legen Sie die Kryo-Form in der Petrischale und erlauben es dem Einbettungsmaterial vollständig einzufrieren. </li><li> Halten Sie das eingebettete Gewebe auf Trockeneis zu allen Zeiten oder bei -80 ° C in Parafilm bis zur weiteren Verarbeitung gewickelt. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe auf einem Kryostaten (-20 ° C) in die gewünschte Dicke, beispielsweise 5 um. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li><li> Fixiertem Gewebe für Paraffineinbettung (für Rückenmark und DRGs) <ol><li> Fix Rückenmark und DRGs in 4% PFA (2 h für Rückenmark, 1,5 h für Maus DRGs und 4 h für Ratten-DRGs) bei 4 ° C (Platz Rückenmarkin horizontaler Lage aus Fixierung in einer gebogenen Position zu verhindern). </li><li> Übertragen, um das Gewebe zu 25% w / v Saccharose über Nacht bei 4 ° C. Das Gewebe kann in 25% w / v Sucrose gespeichert werden Azid supplementiert mit wenigen Tropfen 10% -iger mikrobieller Kontamination bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu verhindern. </li><li> Isolieren Sie die Gewebebereich von Interesse, wie zB das Rückenmark Lendenanschwellung. </li><li> Füllen Sie eine Einbettform zur Hälfte mit Paraffin. </li><li> Kühlen Sie den Einbettform kurz, indem sie auf die Kühlfläche des Einbettungs Maschine platzieren das Paraffin leicht zu härten. Dies ermöglicht eine bessere Gewebe Positionierung. </li><li> Platzieren das Gewebe in der gewünschten Orientierung in dem Einbettungsform. Füllen Sie die Einbettform mit Paraffin und kühlen sofort. </li><li> Legen Sie das paraffinhaltige bei 4 ° C über Nacht Einbettform zu lassen, es härtet vollständig und entfernen Sie den Paraffinblock das Gewebe aus der Einbettform enthält. </li><li> Cut Abschnitte ona Mikrotom in der gewünschten Dicke, beispielsweise 5 um. </li><li> Führen nach Standardprotokollen Anfärben 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wenn die Wirbelsäule gestört wird, beispielsweise durch zervikale Dislokation, wird das Rückenmark bei der Extrusion aufgespalten. Wenn das Rückenmark nicht extrudiert werden kann, kann die Wirbelsäule leicht an beiden Enden abgeschnitten werden und die Extrusionsversuch wiederholt werden kann. Falls das gesamte Rückenmark für eine weitere Analyse erforderlich, dh der Halsanschwellung bestehend sowie der Lenden- Erweiterung sollte die Wirbelsäule nur geringfügig beschnitten werden. Wenn nur die Lendenanschwellung für die weitere Analyse erforderlich ist, sollte das Rückenmark nach der vorliegenden Protokoll getrimmt werden. Die Wirbelsäule sollte mit den Fingerspitzen gerade gerichtet werden Extrusion zu erleichtern. Das Protokoll ist für Nagetiere aller Altersgruppen und hier wird von einer erwachsenen Maus (8 Wochen), eine Maus pup (5 Tage) und einer erwachsenen Ratte (10 Wochen) veranschaulicht. Je nach Tierart und Stamm, die Anzahl der thorakalen und lumbalen Abschnitte variieren 9, </sup&gt; 10, 11. In Abhängigkeit von den Proteinen zu analysiere erwachsenen Nagetieren können mit enzymhemmende Lösungen vor der Euthanasie perfundiert werden. Wenn ein Experiment durchführen einseitige Nervenschaden, kann das Rückenmark in ipsilateralen und kontralateralen Seiten aufgeteilt werden unter Verwendung von ultrafeinen Pinzette sofort nach der Extrusion. Ferner kann jede Seite in dorsalen und ventralen Seiten aufgeteilt werden. Das Gewebe kann dann für weitere Analysen, wie zB Western - Blot verarbeitet werden. Transkardialer Perfusionsfixierung mit PFA vor dem Rückenmark Extrusion sollte vermieden werden, da dies das Rückenmark nicht flexibel macht und verhindert, dass das Rückenmark hydraulischen Extrusion. Hydraulische Rückenmark Extrusion werden die dorsalen Wurzeln abreißen. Für Experimente, wo angebracht Dorsalwurzeln notwendig sind, wird laminectomy empfohlen. Darüber hinaus werden durch hydraulische Rückenmarkshäuten Extrusion verloren, die durch Standard laminectomy vermieden werden können Hydraulik Extrusion des Rückenmarks und DRG Isolierung auch könnte unter Verwendung oxygenierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) anstelle von eiskaltem PBS durchgeführt. Die Verwendung von ACSF ermöglicht die Erhaltung des isolierten Gewebes in einer besseren physiologischen Umgebung, die bei der anschließenden elektrophysiologischen Ableitungen 12 besonders wichtig ist, 13. Eine Alternative zu ACSF könnte PBS , enthaltend 1 g / l Glucose zur Erzeugung von Primär DRG - Kulturen 14. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, wodurch Gewebebehandlungszeit und damit die Gefahr von Proteinschädigung vermindert wird. Perfusion mit einem Fixiermittel vor das Rückenmark durch Laminektomie zu isolieren, das Risiko von Gewebeschäden bei der Präparation und bei der endgültigen Entfernung des verringern kannRückenmark von der Wirbelsäule. Allerdings schließt Gewebefixierung seine Anwendbarkeit auf Analysen wie Western Blotting. Hydraulische Extrusions Ausbeuten strukturell unbeschädigte Gewebe 3 geeignet für ein breiteres Spektrum von Analysen. Konsistente Erkennung von DRGs kann schwierig sein. Dies ist jedoch für die Gewebeanalyse unerlässlich, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden. Die Färbung der Rückenmarksgewebe sowie von DRGs kann durch Ausführen der dargestellten Gewebebehandlung Variationen in Protokollschritt 7 skizziert optimiert werden.

Das Ziel dieser Methode ist das Rückenmark sowie zu identifizieren und zu isolieren DRGs 1, 2 zu isolieren. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, dh durch die Wirbelsäule eine nach brechen, und dieses Verfahren verringert das Risiko von Gewebe durch die Dissektion Prozess verursachten Schaden 3, 4 . DRGs kann schwierig sein, zu identifizieren. Die korrekte Identifizierung ist für Gewebeanalyse sehr wichtig, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden. Gewebe durch die hier gezeigt , isoliert Techniken können auf eine Vielzahl von Analysen , einschließlich Western - Blotting 5 aufgebracht werden,6, qPCR 7 und immunhistochemischen Färbung 8. Wenn DRGs identifizieren, ist es wichtig zu berücksichtigen , daß die Anzahl der Rückenmarkssegmente bekannt ist mit Tiertyp und Dehnungs 9, 10, 11 zu variieren. Die Vorteile bei der Durchführung dieses Verfahrens bei Mäusen sind die hohe Anzahl von gentechnisch veränderten Varianten und den relativ niedrigen Wohnkosten. Die Vorteile bei der Verwendung von Ratten sind die relativ hohen Gewebeausbeute und wenn Nervenverletzungen beteiligt, wird das Verfahren mit der Größe erleichtert werden.

<table><tbody><tr><td>Bonner Schere, extra fein, gerade, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Zum Aufschneiden des Rückenmarks vor der Isolierung von DRGs (adulte Maus, adulte Ratte); </td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td> Anderer Hersteller kann verwendet werden Zum <td>Zentrifugieren von homogenisiertem Gewebe</td></tr><tr><td>Kryostat-Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Zum Schneiden des eingebetteten Gewebes vor der Färbung; Andere Modelle und Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pinzette, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>Für die Handhabung des Rückenmarks nach der Extrusion; Andere Hersteller/Typen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pinzette, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Zur Isolierung von DRGs (erwachsene Maus, erwachsene Ratte, Welpe); Andere Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Isofluran (Furan) IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>Zur Einschläferung; Es können auch andere Hersteller verwendet werden; ACHTUNG: giftiges</td></tr><tr><td>Iso-Pentan GPR rectapur</td><td>VWR Chemikalien</td><td># 24872.298</td><td>Zum Einfrieren von Gewebe; Es können auch andere Hersteller verwendet werden; ACHTUNG:</td></tr><tr><td>toxisches Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Zum Schneiden von in Paraffin eingebettetem Gewebe; Andere Modelle und Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Paraffinwachspellets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>Für die Paraffineinbettung; Es können auch andere Hersteller verwendet werden</td></tr><tr><td>Einbettstation für Paraffingewebe</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Für die Paraffineinbettung von Gewebe für spätere Schnitte; Anderes Modell und anderer Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pellet-Pestel, Motor kabellos</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># Z359971-1EA</td><td>Zur mechanischen Homogenisierung von isoliertem Gewebe vor dem Western Blotting; </td></tr><tr><td>Petrischale, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td> kann auch verwendet werden <td>Zur Lagerung von isolierten DRGs; Andere Hersteller und Größen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Petrischale, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>Für die Extrusion des Rückenmarks; Andere Hersteller und Größen können verwendet werden</td></tr><tr><td>: Phosphatase-Inhibitor, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail zur Zugabe zu TNE-Lysepuffer, falls erforderlich; Es kann auch eine Pipettenspitze anderer Hersteller verwendet werden</td></tr><tr><td>, 1-200 &mu; L, ohne Filter</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Für hydraulisches Extrudieren; Ein anderer Hersteller kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor, Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Protease-Inhibitor-Cocktail zur Zugabe zu TNE-Lysepuffer, falls erforderlich; Anderer Hersteller kann verwendet werden</td></tr><tr><td>RNAlater-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># R0901</td><td>Zur RNA-Stabilisierung zur Lagerung; Andere Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>Für die RNA-Isolierung; Skalpell anderer Hersteller kann verwendet werden</td></tr><tr><td>; Swann-Morton Chirurgische Klinge Nr. 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Zur Isolierung des Lendenwirbelsäulenbereichs des Rückenmarks; Andere Hersteller/Typen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Schere, gerade, Typ 3, 25 mm Schneide</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Zur Isolierung der Wirbelsäule; Andere Hersteller/Typen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Schere, 130 mm Schneide</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Zur Isolierung des Rückenmarks (erwachsene Ratte)</td></tr><tr><td>Federschere, gerade, 8 mm Schneide</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Zum Aufschneiden der Wirbelsäule vor der Isolierung von DRGs (Pup) und zur Isolierung von DRGs (adulte Maus, adulte Ratte, Welpe); Andere Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Standardspritzen, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>Für die hydraulische Extrusion; Andere Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>Stereomikroskop MZ12.5 mit Objektiv 1X und Okular 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Anderer Hersteller/Typ kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>Für die hydraulische Extrusion; Kann auch nach Standardprotokollen hergestellt werden</td></tr><tr><td>Spritzennadel 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Für die hydraulische Extrusion bei Welpen; Anderer Hersteller/Typ kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Spritzennadel 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternative zur Pipettenspitze für die hydraulische Extrusion bei erwachsenen Mäusen; Andere Hersteller können verwendet werden</td></tr><tr><td>: Tissue-Tek</td><td>Sakura</td> <td># 4583</td><td>Tssue Einbettungsmaterial für spätere Kryosektionen</td></tr><tr><td>TNE-Lysepuffer</td><td>VWR Chemikalien</td> <td># 10128-582</td><td>Für die Gewebelyse vor Western Blotting; Es können auch andere Hersteller verwendet werden; Kann auch nach Standardprotokollen hergestellt werden</td></tr></tbody></table>

hydraulische extrusion des rückenmarks und isolierung von dorsalwurzelganglien in nagetiere

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionell wird das Rückenmark durch Laminektomie isoliert, d.h. indem die Wirbelsäule einzeln aufgebrochen wird. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch kann zu einer Schädigung des Rückenmarks führen, die durch den Dissektionsprozess verursacht wird. Hier zeigen wir, wie das Rückenmark mit Hilfe von hydraulischem Druck extrudiert werden kann. Die Handhabungszeit wird erheblich auf nur wenige Minuten reduziert, was wahrscheinlich zu einer Verringerung der Proteinschäden führt. Das geringe Risiko einer Schädigung des Rückenmarksgewebes verbessert die anschließende immunhistochemische Analyse. Durch die Durchführung einer hydraulischen Rückenmarksextrusion anstelle der herkömmlichen Laminektomie können die Nagetiere weiter für die DRG-Isolierung verwendet werden, wodurch die Anzahl der Tiere verringert und eine Analyse über Gewebe desselben Nagetiers hinweg ermöglicht wird. Wir demonstrieren eine konsistente Methode zur Identifizierung und Isolierung der DRGs entsprechend ihrer Lokalisation relativ zu den Costa. Es ist jedoch wichtig, diese Methode an das verwendete Tier anzupassen, da die Anzahl der Rückenmarkssegmente, sowohl im Brust- als auch im Lendenwirbelbereich, je nach Tiertyp und -stamm variieren kann. Darüber hinaus veranschaulichen wir weitere Aufbereitungsbeispiele der isolierten Gewebe.

Hydraulisch extrudiert Rückenmark zeigen eine glatte unbeschädigten Oberfläche in Figur 1 gezeigt. Die Lendenanschwellung kann leicht als der verdickte Bereich des Rückenmarks identifiziert werden, boxed in Abbildung 1. Die dorsalen und ventralen Seiten des Rückenmarks kann entsprechend der Morphologie durch Auge identifiziert werden. In Figur 1 ist die Bauchseite dem Betrachter zugewandt, identifizierbar durch eine klare Mittellinie entlang der gesamten Rückenmarks. Zwei breitere Linien entlang des Rückenmarks ermöglichen Identifizierung der dorsalen Seite. Am distalsten Ende der Cauda equina manchmal bleiben bei erwachsenen Ratten und erwachsene Mäuse befestigt. Einzel DRGs kann nur während in der Wirbelsäule, Figur 2 befindet identifiziert werden. Nach der Isolierung, Figur 3 können die einzelnen DRGs nicht Aussehen identifiziert werden. Bei Bedarf ist es daherwichtig, dass sie eindeutig auf Trennung getrennt zu halten. Nach der Isolierung kann das Rückenmark und die DRGs verarbeitet und gefärbt werden , wie in Schritt 7.3 und dargestellt in Abbildung 4 dargestellt. 4a zeigt eine immunhistochemische Färbung eines DRG - Abschnitt , wo die Neuronen und deren umgebenden Satelliten Gliazellen deutlich sichtbar sind. Durch die korrekte Identifizierung der DRG ist es möglich, die Wirkung der Ischiasnerv Verletzungen am soma des verletzten Neuronen sowie auf deren umgebenden Satelliten Gliazellen zu analysieren. Figur 4b zeigt eine Nissl - Färbung eines hydraulisch extrudiert Rückenmark , wo das Gewebe intakt ist , wie durch die glatten Kanten des Abschnitts reflektiert. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Gewebeschnitten. A. Immunhistochemische Färbung von DRG-Seite. B. Nissl gefärbten Section von hydraulisch extrudiert Rückenmark. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die hydraulische Extrusion des Rückenmarks sowie die Identifizierung und Isolierung spezifischer Spinsalwurzelganglien (DRGs) im selben Nagetier. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Isolierung des Rückenmarks ist diese Methode deutlich schneller und reduziert das Risiko von Gewebeschäden.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das Rückenmark durch hydraulische Extrusion zu isolieren sowie die dorsalen Wurzelganglien bei Mäusen und Ratten zu identifizieren und zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Nagetier euthanasiert und anschließend decapitiert wird. Die Haut wird entlang der Wirbelsäule eingeschnitten und von dem darunterliegenden Gewebe abgetrennt. Anschließend wird die Wirbelsäule durch Schnitte entlang beider Seiten der Wirbelsäule in distaler Richtung über den Beckenknochen hinaus von dem umgebenden Gewebe gelöst. Danach wird die Wirbelsäule distal zum Beckenknochen durchtrennt. An dem am weitesten distal gelegenen Ende des Rückenmarks wird eine Spritze mit einer angepassten Pipettenspitze eingeführt.Durch Anwendung von gleichmäßigem Druck wird das Rückenmark mit eiskaltem sterilen PBS in die auf Eis liegende Petrischale hinausgedrückt. Mit Federbändchen wird die Wirbelsäule längs geteilt. Anschließend werden die Ansatzstellen der am weitesten distal gelegenen Rippe lokalisiert.Dadurch wird die Identifizierung der am weitesten distal gelegenen thorakalen DRGs auf jeder Seite, bezeichnet als T13, ermöglicht. Anschließend können die folgenden DRGs identifiziert werden. Die DRGs, die der lumbalen Spinalverdickung entsprechen, befinden sich distal. Mit Hilfe von Feder-Scheren werden die dorsalen und ventralen Wurzeln durchtrennt und die DRG vorsichtig aus der Höhle herausgeschabt und in beschriftete Petrischalen mit steriler PBS auf Eis überführt. Die hydraulische Extrusion des Rückenmarks ist eine deutlich schnellere Methode als die traditionelle Laminektomie, bei der die Wirbel einzeln durchbrochen werden. Diese Methode verringert das Risiko einer Gewebeschädigung durch den Dissektionsprozess und liefert Gewebe, das für eine breite Palette von Analysen geeignet ist.Die Rückenganglien können im Allgemeinen schwer zu identifizieren sein. Eine korrekte Identifizierung ist jedoch für die weitere Analyse des Gewebes, beispielsweise nach einer Verletzung des Nervus ischiadicus, von großer Bedeutung. Durch die Nummerierung der Rückenganglien entsprechend ihrer Lokalisation relativ zur Rippe lassen sich die Rückenganglien einheitlich identifizieren.Bereiten Sie eine Spritze zur Extrusion des Rückenmarks vor, indem Sie das große Ende einer unfilterten Pipettenspitze abschneiden. Die Spitze sitzt fest, wenn sie richtig angepasst ist. Saugen Sie eiskalte sterile PBS auf und stellen Sie die Spritze bis zur weiteren Verwendung auf Eis.Bei erwachsenen Nagetieren die Tötung mit einem Gas wie CO2 oder Isofluran und anschließender Enthauptung durchführen. Die Halswirbel dislozieren nicht, da dies die Wirbelsäule beschädigen und das Herauspräparieren des Rückenmarks unmöglich machen würde. Jungtiere können durch direkte Enthauptung getötet werden.Streuen Sie Wasser auf das Fell, um die Haare zu kontrollieren. Schneiden Sie anschließend das Fell entlang der Wirbelsäule in distaler Richtung auf. Isolieren Sie die Wirbelsäule, indem Sie beidseits entlang der Wirbelsäule hinter dem Beckenknochen schneiden, und durchtrennen Sie die Wirbelsäule proximal zum Becken. Kürzen Sie die Wirbelsäule, um die proximalen und distalen Bereiche zu vermeiden, da diese die Wirbelsäule zu stark S-förmig machen könnten, was eine erfolgreiche Entnahme des Rückenmarks erschwert. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark an beiden Enden sichtbar ist. Falls das Rückenmark nicht sichtbar ist, kürzen Sie die Wirbelsäule so lange, bis das Rückenmark sichtbar wird.Stellen Sie eine Petrischale mit PBS auf Eis. Richten Sie die Wirbelsäule gerade, indem Sie den Zeigefinger auf den gebogenen Teil am proximalen Ende der Wirbelsäule legen. Führen Sie die Pipettenspitze am distalen Ende des Rückenmarks ein.Üben Sie gleichmäßigen Druck aus und pressen Sie das Rückenmark in die Petrischale. Schneiden Sie die Wirbelsäule auf. Durchtrennen Sie einige Wirbel auf der ventralen Seite der Säule und wechseln Sie dann, um einige Wirbel auf der dorsalen Seite zu durchtrennen.Wechseln Sie abwechselnd die Seiten entlang der gesamten Wirbelsäule fort. Legen Sie das offene Rückenmark unter ein Mikroskop. Identifizieren Sie das T13-Wirbelsegment, indem Sie die Ansatzstelle der am weitesten distal gelegenen Rippe in der Wirbelsäule lokalisieren.Vermeiden Sie es sorgfältig, die am weitesten distal gelegene Rippe mit den nahegelegenen Interkostalnerven zu verwechseln. Die am weitesten distal gelegene Rippe ist am proximalen Teil des T13-Wirbelsegments befestigt, und die T13-DRGs befinden sich distal zum T13-Wirbel und proximal zum L1-Wirbel. Identifizieren Sie begleitende DRGs in distaler Richtung. Bereiten Sie nummerierte Petrischalen vor, die eiskalte sterile PBS auf Eis enthalten.Um Schäden am DRG während der Entnahme zu vermeiden, greifen Sie mit einer feinen Pinzette anstelle des DRG selbst die dorsalen und ventralen Wurzeln. Schneiden Sie mit einer Mikroschere zunächst den peripheren Nerv, gefolgt von den dorsalen und ventralen Wurzeln. Bei Jungtieren sind diese Nerven nicht so deutlich sichtbar wie bei erwachsenen Nagetieren.Um die Nerven so nah wie möglich am DRG zu durchtrennen, lassen Sie die Scherspitze vorsichtig entlang des DRG gleiten, um die Schere vor dem Schneiden zu positionieren. Mit der Spitze geschlossener Pinzetten heben Sie die DRGs vorsichtig heraus und überführen sie in die entsprechende Petrischale. Bei adulten Ratten und adulten Mäusen sind die DRGs weiß mit deutlich sichtbaren dorsalen und ventralen Wurzeln, während sie bei Welpen als klare Kugeln erscheinen.Für die Westernblot-Analyse isolieren Sie das gewünschte Gewebe und geben Sie es in einen Lysepuffer. Anschließend homogenisieren Sie das Gewebe, zentrifugieren es, sammeln den Überstand und führen die Westernblot-Analyse gemäß Standardprotokollen durch. Für die RNA-Analyse isolieren Sie das gewünschte Gewebe und geben es unverzüglich in eine RNA-Stabilisierungslösung.Führen Sie anschließend eine qPCR gemäß Standardprotokollen durch. Für die Immunhistochemie an schockgefrorenem Gewebe bereiten Sie Trockeneispulver auf einem Stück Silberfolie vor. Legen Sie das Gewebe auf das Trockeneispulver, um es schockzufrieren.Überführen Sie das Gewebe anschließend in ein Kryostat und betten Sie es zur Schnittführung ein. Nachfixieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA und führen Sie die immunhistochemische Färbung gemäß Standardprotokollen durch. Zur Immunhistochemie an Kryoschnitten fixieren Sie das Gewebe in 4 % PFA bei vier Grad und überführen Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad in 25 % (Gewicht pro Volumen) Saccharose.Legen Sie das Gewebe in Einbettungsmaterial und frieren Sie es mit gekühltem 2-Methylbutan ein. Schneiden Sie das Gewebe in einem Kryostaten und führen Sie die immunhistochemische Färbung gemäß Standardprotokollen durch. Für die Immunhistochemie an Paraffinschnitten fixieren Sie das Gewebe in 4 % PFA bei vier Grad und überführen das Gewebe über Nacht bei vier Grad in 25 % (Gewicht pro Volumen) Saccharose.Das Gewebe in Paraffin einbetten, am Mikrotom schneiden und immunhistochemische Färbungen gemäß Standardprotokollen durchführen. Abhängig von den für die immunhistochemische Färbung verwendeten Antikörpern kann eine der beispielhaft dargestellten Gewebebearbeitungsmethoden als anwendbar erachtet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Rückenmark durch hydraulische Extrusion isoliert wird und wie die Spinalganglien konsistent identifiziert und isoliert werden können.Die hier gezeigten Methoden sind auf Mäuse und Ratten aller Altersstufen anwendbar, und das isolierte Gewebe kann für eine breite Palette von Analysen verwendet werden, einschließlich Methoden, die eine schnelle Isolierung von nicht fixiertem Gewebe erfordern.

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

In diesem Video demonstrieren wir die Extraktion von Spinalganglion oder DRG aus einer geernteten Rattenwirbelsäule für nachgelagerte Anwendungen.

Gewinnung von DRG aus der Wirbelsäule der Ratte: Ein Verfahren zur Extraktion des dorsalen Wurzelganglions aus der Wirbelsäule eines Rattenmodells

In diesem Video beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung des Rückenmarks aus einem Mausmodell für in vitro Studien.

Rückenmarkextraktion: Ein Protokoll zur Isolierung des murinen Rückenmarks für In-vitro-Studien

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Dieses Video stellt eine Methode zur Isolierung von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen aus dem periventrikulären Gewebe des Rückenmarks bei erwachsenen Ratten vor. Die Technik beinhaltet die Inkubation der Gewebefragmente in einer Lösung, die proteolytische Enzyme enthält, um die extrazelluläre Matrix zu zerstören und die Zellen freizusetzen. Anschließend werden die freigesetzten Zellen in ein Medium überzogen, das spezifische Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von neuralen...

Isolierung von neuralen Stammvorläuferzellen aus der periventrikulären Region des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Zellen der dorsalen Wurzelganglien (DRG) aus der Wirbelsäule der Ratte. DRGs, die aus der Wirbelsäule herausgeschnitten werden, werden mit Enzymen behandelt und mechanisch dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden in einem Medium kultiviert, das Inhibitoren und Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von Gliazellen begrenzen bzw. das neuronale Wachstum fördern.

Etablierung einer primären Zellkultur der Spinalganglien der Dorsalwurzel aus einer Wirbelsäule der Ratte

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Injektion eines dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches bei einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration dar. Dieses Modell eignet sich, um den Einsatz von Gentherapie zur Förderung der sensorischen Axonregeneration zu untersuchen.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Entnahme und Kultivierung von explantierten Spinalganglien (DRG) von adulten Sprague Dawley-Ratten in einem Multikompartiment-Gerät (MC).

Ernte, Einbettung und Kultivierung von dorsalen Wurzelganglien in Geräten mit mehreren Kompartimenten zur Untersuchung peripherer neuronaler Merkmale

Dorsale Wurzelganglien (DRG) enthalten primäre sensorische Neuronenzellen und leiten periphere sensorische Signale an das Rückenmark weiter. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur DRG-Dissektion der Maus, die eine standardisierte Isolierung strukturell intakter Ganglien, anatomische segmentale Identifikation, intuitive Anleitung für Anfänger und reduzierte prozedurale Gewebeschäden unterstützt.

Dissektion und Isolierung der Maus-Dorsalwurzelganglien

Lernen Sie die hydraulische Extrusion des Rückenmarks und die Isolierung von Dorsalwurzelganglien bei Nagetieren. Diese schnelle Methode minimiert Gewebeschäden und ermöglicht präzise DRG-Identifizierung für neurobiologische Analysen.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Weitere Videos entdecken