Name: Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie eine skalierbare Methode zur Quantifizierung von Grooming-Verhalten bei Drosophila durch Farbstoffakkumulation. Diese Technik liefert robuste quantitative Daten für die Neurobiologie und Verhaltensgenetik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon und Rose Hedreen für die frühe Arbeit bei der Prüfung und Etablierung dieser Methodik und Kammermusik. Wir danken Kelly Tellez und Graham Buchan für das Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Wir danken Andrew Seeds und Julie Simpson für ihre Pionierarbeit und ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorgabe der Verwendung von Brilliant Yellow Dye (Sigma). Diese Arbeit wird zum Teil von der Mary E. Groff Chirurgischen und medizinischen Forschung und Bildung Charitable Trust, dem Bronfman Science Center und dem Hellman Fellows Programm unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie einen Aspirator für das Bewegen von lebenden Drosophila aus einer Kulturfläschchen in die Putzkammer vor. Aspiratoren erlauben den Transfer von bewussten Tieren in die Verhaltenskammern, um sicherzustellen, dass die Anästhesie die nachfolgende Verhaltensbeobachtung nicht beeinträchtigt. <ol><li> Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot; .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze. ANMERKUNG: Die meisten 1mL Spitzen haben eine Abstufungslinie, in der die Spitze in der Verpackungskasten sitzt, die normalerweise zu dieser Linie geschnitten wird. </li><li> Lege eine frische 1-ml-Mikropipettenspitze über die Mesh / Cut-Spitze legen. Beobachten Sie die Maschenform eine feste Barriere zwischen den beiden Spitzen. Das Innere der neuen Spitze schafft eine Haltekammer für Fliegen. </li><li> Schneiden Sie die extreme Spitze der neuen Mikropipettenspitze, um die Öffnung zu erweitern, um den Durchgang einer einzelnen Fliege zu ermöglichen. Das holE entspricht etwa der Öffnung der Putzkammer (ca. 1,5-2 mm im Durchmesser). </li><li> Legen Sie die verschachtelten Spitzen bequem auf das Ende des Tygonschlauches. Schieben Sie die Spitzen in das Rohr, um eine feste Passung zu gewährleisten, um Vakuumdruck zu ermöglichen. </li><li> Am anderen Ende des Schlauches, schneiden Sie die Spitze einer 200 μl Mikropipettenspitze und passen Sie das schmale Schnittende in den Schlauch. Dies ist die &quot;Mund&quot; -Seite des Aspirators. </li></ol></li><li> Staub-Aliquot-Rohre vorbereiten. Wiegen Sie etwa 5 mg brillanten gelben Farbstoff auf tariertem Wägepapier. Den Staub in ein 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Kappe fest schließen. HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Nitrilhandschuhen während der Aliquotvorbereitung, da einige Latexhandschuhe für den Farbstoff durchlässig sind. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer). </li><li> Ethanol (EtOH) -Röhrchen vorbereiten: 1 ml 100% EtOH in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Etikettenröhrchen für Genotypen oder Bedingungen/ Li&gt; <li> Wiederholen Sie Schritt 1.4) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer). Cap und rette die EtOH-Röhrchen für die Fertigstellung des Grooming-Assays. Dazu gehören auch mindestens eine &quot;Blank&quot; -Probe, die nur 1 mL EtOH ohne Fliege für Negativkontrollen sein wird. </li><li> Montieren Sie jede Putzkammer, indem Sie die Schiebeplatte (mit den kleineren Löchern) verschrauben, aber die Bodenplatte (mit den größeren Löchern) entfernt werden, um Staub zu entfernen. </li><li> Legen Sie jede notwendige Grooming-Kammer flach auf einen Tisch mit der Oberseite nach unten. Fliege Eintrittsseite ist verdeckt. </li><li> Laden Sie 5 mg brillantes gelbes Farbstoffaliquot in jede Kammer, indem Sie das Röhrchen gegen die Oberfläche der Kammer über dem gewünschten Brunnen klopfen. Klopfen Sie die Kammer gegen den Tisch, um sicherzustellen, dass der gesamte Staub durch das Netz auf die obere Platte fällt. </li><li> Schrauben Sie die Bodenplatte auf jede Kammer, so dass die breiteren Enden der konischen Öffnungen nach außen weisen und die Löcher nicht über den Brunnen ruhen. Sichern Sie den BotTom Platte fest, so dass es nicht gleiten und freisetzen Farbstoff. </li><li> Klappen Sie die Kammer um und klopfen Sie es ein paar Mal gegen einen Tisch, so dass der Staub durch das Netz fällt, um auf der Bodenplatte zu ruhen. </li><li> Schieben Sie die obere Platte der Kammer in die &quot;offene Position&quot;, so dass die kleinen Löcher mit den fünfzehn Brunnen übereinstimmen, so dass die Einführung von Fliegen in einzelne Brunnen. </li></ol> 2. Fliegen-Staub und Pflege <ol><li> Laden Sie eine Fliege in den Mund Aspirator durch sanft saugen durch ein Ende des Aspirators, als ob mit einem Stroh. Setzen Sie die Fliegen durch leichtes Blasen und richten Sie die Öffnung zum Ziel. </li><li> Aspirieren Sie eine Fliege in jeden Brunnen für das Experiment verwendet. Nach dem Laden eines Brunnens schieben Sie die obere Platte so, dass die Fliege in der Kammer eingefangen wird, und legen Sie das Band über die Öffnung dieses Brunnens während des Ladens der gesamten Kammer, um zu verhindern, dass die Flucht entweicht, während andere Brunnen geladen wird. Wenn mehrere Fliegen in ein sing. Aspiriert werdenE gut, lassen Sie diese Öffnung aufgedeckt, bis nur eine Fliege bleibt. </li><li> Nachdem alle notwendigen Brunnen mit Fliegen gefüllt sind, klappen Sie die Kammer so, dass die Bodenplatte nach oben ist, so dass der Staub das Potenzial hat, die Fliegen zu beschichten, indem er durch das Netz fällt. </li><li> Die obere und untere Platte fest anziehen, indem sie die Schrauben anziehen und die Kammer vorwischen, um die Fliegen für 4 s zu stauben. </li><li> Klopfe die Kammer (obere Platte nach unten) gegen einen Tisch zweimal, so dass der Farbstoff auf die andere Seite fällt. Dann umdrehen Sie die Kammer über (obere Platte nach oben) und klopfen Sie die Kammer zweimal, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff auf dem Boden der unteren Kammer abseits der in der oberen Kammer gehaltenen Fliege absetzt. </li><li> Für Kontrollfliegen, die nicht gepflegt werden sollen, fahren wir sofort mit Schritt 3 des Protokolls fort. Für Fliegen, die den Assay abschließen, fahren Sie mit Schritt 2.7 fort. </li><li> Legen Sie die Kammer flach auf einen Tisch oder Arbeitsplatte mit der oberen Platte nach oben für dreißig Minuten, damit die Fliegen zu bräunen. Legen Sie die SohleEr in einem geräusch- und vibrationsfreien Raum, um Ihre Umgebung für alle Grooming-Experimente (Beleuchtungsstärke, Feuchtigkeit und Temperatur) konstant zu halten. Ein Tisch-Inkubator bei RT oder 25 ° C mit Feuchtigkeitskontrollen ist ideal. </li></ol> 3. Vorbereitung der Proben und Absorptionsanalyse <ol><li> Halten Sie das Kammerniveau mit der oberen Platte nach oben, schrauben Sie die Bodenplatte vorsichtig ab und entfernen Sie es aus der Kammer, wobei darauf zu achten ist, dass kein Farbstoff verloren geht. </li><li> Legen Sie die Kammer auf eine Fly CO 2 -Platte mit niedrigem Luftstrom, bis die Fliegen anästhesiert sind. </li><li> Schrauben Sie die obere Platte aus der Kammer heraus. Verwenden Sie sorgfältig eine Pinzette, um ein Bein zu packen und eine abgestaubte Fliege aus jeder Kammer zu bewegen und sie in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zu legen, das EtOH enthält. Die Übertragungszeit für 15 Kammern, die jeweils eine Fliege enthält, beträgt ca. 3-5 min. Experimentatoren sollten in Übertragungszeiten Faktor, wenn / wenn Staffelung Experimente mit mehreren Kammern, um eine effiziente Inszenierung von Experimenten zu gewährleisten. </Li&gt; <li> Sobald jedes Mikrozentrifugenröhrchen 1 Fliege enthält, schließen Sie die Kappe und umdrehen die Röhre dreimal, um zu rühren und die Lösung von Farbstoff und Ethanol zu mischen. </li><li> Inkubation von Röhrchen, die Ethanol enthalten, und fliegt 5 h bei RT, um eine vollständige Entfernung des Farbstoffs aus der Fliege in Lösung zu gewährleisten. Nach den 5 h, verwirren Sie jedes Röhrchen (2 s) kurz, um die Freisetzung des Farbstoffs von den Fliegen zu gewährleisten. </li><li> Aliquotieren Sie 50 &amp; mgr; l des experimentellen 1,5 ml-Röhrchens in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen, falls verfügbar, wobei die Lage der einzelnen Proben auf der Platte beachtet wird. Füge 200 μl EtOH hinzu, um die Probe 5x zu verdünnen. Die Verdünnung vermeidet Deckeneffekte von stark abgestaubten Fliegen oder großen Grooming Defekten. </li><li> Verwenden Sie einen Plattenleser, um jede Probe bei 397 nm zu analysieren. Alternativ kann die Extinktion für einzelne Proben und Zuschnitte auf einem Standard-Spektrophotometer im sichtbaren Spektrum gemessen werden, wenn ein Plattenleser nicht verfügbar ist. </li><li> Lesen und Aufzeichnen der Probe durch den Plattenleser und speichern Sie die Kalkulationstabelle mit dem RecordeD Proben auf dem Teller. </li></ol> 4. Quantifizierung der Ergebnisse <ol><li> Kompilieren Sie Ergebnisse für alle Proben und messen Sie die Varianz für jeden Genotyp oder Zustand. ANMERKUNG: Die Farbstoffansammlung zum Zeitpunkt 0 min und zum Zeitpunkt 30 min wird als separate Bedingungen unter Verwendung statistischer Analysen durch Einweg-ANOVA- und Bonferroni-Korrektur oder andere Korrekturen für mehrere parallele Vergleiche betrachtet. </li><li> Berechnen Sie die Grooming-Prozentsatzdifferenz für jeden Genotyp / Zustand unter Verwendung der folgenden Gleichung: [(Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0 &#39;- Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 30&#39;) / Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0] x 100. </li><li> Express den Prozentsatz für jeden Genotyp und Bedingung in Bar-Plots und vergleichen über Genotypen und Bedingungen. </li></ol>

<ol><li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347269800060">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li>
<li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=GB19770205092">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li>
<li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100(2011).</li>
<li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li>
<li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li>
<li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li>
<li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7953290">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li>
<li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMB%2C+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li>
<li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li>
<li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+D1+family+dopamine+receptor%2C+DopR%2C+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li>
<li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li>
<li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758(2015).</li>
<li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der Grooming-Assay ist relativ einfach, aber wir würden den Experimentatoren vorsichtig sein, den folgenden Problemen besondere Aufmerksamkeit zu widmen. Eine dichte Abdichtung durch Anziehen der Schrauben an der Ober- und Unterseite nach dem Einführen von Fliegen und Farbstoff ist für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Der brillante gelbe Farbstoff ist sehr fein und lose Gelenke werden Verluste an Farbstoff aus den Kanten der Kammer ermöglichen. Die Unregelmäßigkeit des Farbstoffgehalts für jede Vertiefung könnte...

Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) ist ein robustes angeborenes Verhalten, das die Koordination mehrerer unabhängiger motorischer Programme beinhaltet 1 . Fruchtfliegen reinigen ihre Körper von Staub, Mikroben und anderen Krankheitserregern, die die normale physiologische Funktion wie Seh- und Flucht behindern oder zu erheblichen Immun-Herausforderungen führen können. Beim Erfassen und Beantworten sowohl der mechanischen 2 als auch der immunen Aktivierung 3 reiben Fliegen wiederholt ihre Beine zusammen oder auf eine gezielte Körperregion, bis sie ausreichend sauber ist und das Grooming zu einem anderen Teil des Körpers fortschreitet. Fliegen führen Putzbewegungen in deutlichen Kämpfen durch, die weitgehend in stereotypen Mustern 1 , 4 auftreten . Eine Verhaltenshierarchie wird deutlich, wenn Putzsignale priorisiert werden. Schaltungen und Wirkungsmuster wurden in der Unterstützung identifiziert oFa-Modell, dass Grooming-Programme an der Spitze der Hierarchie auftreten zuerst und unterdrücken parallele Signale aus Bereichen des Körpers, die nachher gepflegt werden 5 . Höchste Priorität wird dem Kopf gegeben, dann dem Bauch, den Flügeln und schließlich dem Thorax 5 . Das Grooming-Programm in D. melanogaster ist ein ideales System für das Studium von neuronalen Schaltungen, modulatorischen molekularen Signalen und Neurotransmittern. Zum Beispiel verursachen Kompromisse der Neurofibromin-Funktion 6 , der Verlust des Drosophila- zerbrechlichen X-mentalen Retardierungsproteins ( dfmr1 ) 7 und die Exposition gegenüber Bisphenol A (BPA) 8 alle ein übermäßiges Putzen und andere Verhaltensweisen, die analog zu diskreten menschlichen Symptomen der Neurofibromatose, zerbrechlichen X sind Syndrom und Aspekte von Autismus-Spektrum-Störungen und Attention-Deficit Hyperaktivitätsstörung (ADHS). Grooming Verhalten kann auch habitua seinTed unterschiedlich über Mutantenstämme 2 , die dieses Motorprogramm für Studien der Verhaltenskraft verleihen. Die Breite der neurologischen Phänomene, die von Drosophila modelliert werden kann, verlangt einen neuartigen Vergleichsansatz, um die Fähigkeit der Fliegen zu messen, sich selbst zu pflegen. Die kombinierte Wirkung von vesikulären Monoamin-Transportern und die relative Häufigkeit von Dopamin und anderen biogenen Aminen im Körper wurde gezeigt, um das Fruchtfliegen-Groomverhalten 9 , 10 zu vermitteln. Octopamin und Dopamin stimulieren vergleichbare Hindleg-Grooming-Aktivität in enthaupteten Fliegen, während Tyramin, der Vorläufer des Octopamins, auch das Grooming in geringerem Maße auslöst 7 . Vier Dopaminrezeptoren wurden in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 identifiziert </supAufgaben Durch die Verwendung des in diesem Protokoll beschriebenen Grooming-Assay-Verfahrens haben wir eine Rolle für die Typ-I-Familie Dopamin Rezeptor DopR ( DopR, dDA1, dumm ) im Hindleg- Grooming-Verhalten 15 . Grooming kann indirekt quantifiziert werden, indem man das Ausmaß der Sauberkeit betrachtet, mit dem ein Tier nach dem Abstauben des ganzen Körpers mit einem Markerfarbstoff oder einem fluoreszierenden Staub 5 , 16 vollständig pflegen kann. Der Rest des Staubes, der auf dem Körper verbleibt, kann als relativer Marker für das Gesamtverhalten verwendet werden. Staubige Fliegen, nachdem sie genügend Zeit zum Bräutigam gegeben haben, können ein spezifisches Defizit im Putzverhalten manifestieren. Da die Grooming-Untersuchungen umfangreicher geworden sind, haben Protokolle solche Praktiken als Enthauptung integriert, um pharmakologische Behandlungen auf die Nacken-Binde-Nerven 10 hinzuzufügen, taktile Stimulation von Borsten, um die Grooming-Antwort 2 hervorzurufen,Und Videoaufzeichnung des Verhaltens 15 . Die direkte Beobachtung der Pflege kann leicht durch die visuelle Beobachtung und manuelle Aufzeichnung der Häufigkeit und Dauer der spezifischen Grooming-Ereignisse 4 untersucht werden . Wir haben eine Fünfzehn-Brunnen-Grooming-Kammer entworfen, die mit einem 3D-Drucker oder einem Laser-Cutter konstruiert werden kann und die Blaupause-Designs zur Reproduktion zur Verfügung stehen 15 . Die Konstruktion verwendet zwei miteinander verbundene Mittelplatten mit Öffnungen, die durch Mesh und zwei zusätzliche Gleit- und Bodenplatten, von denen Fliegen und / oder Farbstoff beladen werden, abgetrennt und getrennt sind. Nachdem wir dem Staub gesträubt haben, legen wir sie in Ethanol ab, um den Farbstoff zu solubilisieren und die Absorption dieser Lösung bei der Wellenlänge des Farbstoffs zu messen. Ein Plattenleser kann für mehrere parallele Proben verwendet werden oder ein Einzellesenspektrophotometer kann für einzelne Proben verwendet werden. Diese Methode minimiert den durch Handhabung verursachten Fehler und alTiefs für Grooming-Assays, die auf einer kleineren, kostengünstigen Skala laufen. Dieses Verfahren wird abgeleitet und von den Methoden , die von Julie Simpson und Andrew Seeds Pionier modifiziert, die mit Heizelementen für temperaturempfindliche Schaltung Manipulationen 5 größere Grooming Kammern verwenden. Das folgende Protokoll zeigt die Quantifizierung des Groomens des ganzen Körpers sowie die alternativen Methoden zur Quantifizierung der Farbstoffansammlung an einzelnen Körperteilen. Wir zeigen auch Beispielvergleichsdaten zwischen WT- und DopR- Mutanten sowie Methoden zur Berechnung eines einfachen Leistungsindexes für das Groomverhalten.

<table><tbody><tr><td>High-Flex Tygon PVC Klarsichtschlauch</td><td>McMaster-Carr</td><td>5229K54</td><td>ID 1/8", OD 1/4", verwendet mit Mikropipettenspitzen und Netz zur Herstellung von Mundsaugern</td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (1 mL und 200 &#956; L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-165, 24-150R</td><td></td></tr><tr><td>Nylon-Mesh-Sieb, 2 x 2,6 "</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T44</td><td>Wird verwendet, um Pflegekammer- und Mundsauger</td></tr><tr><td>zu konstruieren Dumont # 5 Pinzette</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5050</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Yellow Dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201375-25G</td><td>Wir empfehlen die Verwendung von Nitrilhandschuhen beim Umgang mit diesem Produkt</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>auf "Touch"</td></tr><tr><td>-Ethanol</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>86-1282</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR International</td><td>10025-726</td><td></td></tr><tr><td>0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR International</td><td>20170-293</td><td>Röhrchen können mit aufeinanderfolgenden Assays wiederverwendet werden</td></tr><tr><td>UV 96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td></td><td></td>26014017</tr><tr><td>BioTek Synergy HTX</td><td>Platereader BioTek</td><td>muss den Katalog herunterladen, um auf die Produktnummer zugreifen zu</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td></tr><tr><td>Gen5 Microplate Reader und Imager Software</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>Tritech</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td></td></tr><tr><td>1/4" Acryl Kunststoff</td><td>McMaster-Carr</td><td>8473K341</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 Muttern</td><td>McMaster-Carr</td><td>90257A009</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 x 1" Sechskantschrauben</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A199</td><td>die Bodenplatte muss für diese Größe mit einem Gewinde versehen werden</td></tr><tr><td>Schraube 8 - 32 x 1/2" Sechskantschrauben</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A194</td><td>die zweite Platte von oben muss mit einem Gewinde versehen werden</td></tr><tr><td>2 - 56 3/8" Flachkopf-Kreuzschlitzschrauben</td><td>McMaster-Carr</td><td>91500A088</td><td>diese halten die beiden mittleren Platten zusammen</td></tr><tr><td>0,175" ID, 1/4" OD, 0,34" Aluminiumrohr</td><td>McMaster-Carr</td><td>92510A044</td><td>Hergestellt im eigenen Haus; Das angegebene Produkt hat ungefähr die gleichen Abmessungen und sollte für Schrauben der Größe 8 geeignet sein. Diese dienen als Hüllen für die 1"-Schrauben und setzen die Sechskantkappe leicht von der Oberfläche der Deckplatte ab</td></tr></tbody></table>

quantifizierung von drosophila grooming behavior

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila- Grooming-Verhalten ist ein komplexes, mehrstufiges Lokomotiv-Programm, das eine koordinierte Bewegung von Vorder- und Hinterbeinen erfordert. Hier stellen wir ein Grooming-Assay-Protokoll und ein neuartiges Kammerdesign vor, das kostengünstig und skalierbar ist für kleine oder große Studien der Drosophila- Pflege. Fliegen sind ganz über ihren Körper mit Brilliant Yellow Farbstoff und gegebene Zeit, um den Farbstoff aus ihren Körpern in der Kammer zu entfernen. Fliegen werden dann in einem eingestellten Volumen an Ethanol abgelagert, um den Farbstoff zu solubilisieren. Die relative spektrale Extinktion von Farbstoff-Ethanol-Proben für gepflegte und nicht geschliffene Tiere wird gemessen und aufgezeichnet. Das Protokoll liefert quantitative Daten der Farbstoffakkumulation für einzelne Fliegen, die leicht gemittelt und über Proben verglichen werden können. Dies ermöglicht es, dass experimentelle Entwürfe die Grooming-Fähigkeit für mutierte Tierversuche oder Schaltungsmanipulationen leicht auswerten können. Dieses effiziente Verfahren ist vielseitig und skalierbar. Wir zeigen wOrk-flow des Protokolls und Vergleichsdaten zwischen WT-Tieren und mutierten Tieren für den Drosophila Typ I Dopamin Rezeptor ( DopR ).

Der Grooming-Assay liefert quantitative Daten, um die Verhaltensfähigkeit zu bewerten, basierend auf dem relativen Rest des angesammelten Farbstoffs, der auf den Körper der Fliegen nach einer festgelegten Zeit der Messung für das Grooming (30 min) zurückgelassen wurde. Probenbilder der Gleitpflegekammergestaltung und Hauptschritte des Assays sind in Fig. 1 hervorgehoben . Fliegen aggregieren eine signifikante Menge an Farbstoff aus der sofortigen Staubbildung durch Vorte...

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das Pflegeverhalten von Drosophila zu messen, indem der verbleibende Anteil einer gefärbten brillantgelben Farbe am Körper der Tiere unter gepflegten und ungepflegten Bedingungen quantifiziert und verglichen wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie und der Verhaltensgenetik zu beantworten, beispielsweise zur Koordination feiner motorischer Fähigkeiten sowie zu den damit verbundenen molekularen Regulatoren und Schaltkreisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie schnell, robust und einfach von vielen Experimentatoren und Studierenden mit unterschiedlichem Erfahrungsgrad durchführbar ist.Den Ablauf dieses Verfahrens wird Frankie Barradale, ein Student in meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie einen Aspirator vorbereiten, um lebende Drosophila aus einer Kulturr&ouml;hrchen in die Pflegekammer zu bef&ouml;rdern. Schneiden Sie mit einer Schere 1,5 Fu&szlig; Tygon-Schlauch zu.Schneiden Sie mindestens einen Zentimeter von der Spitze einer Ein-Milliliter-Wegwerfmikropipettenspitze ab und halten Sie das quadratische Stück Netz mit einer Kantenlänge von einem Zentimeter über

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Drosophila melanogaster ist eine genetisch und auf der Verhaltensebene praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet wurde, um die molekularen und zellulären Grundlagen von vielen wichtigen biologischen Prozessen seit über einem Jahrhundert ein zu verstehen. Drosophila wurde auch genutzt, um Einblicke in die genetischen Grundlagen der Fliege Verhalten zu gewinnen.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Dieses Video beschreibt eine Methode zum Bau eines Fliegensaugers, mit dem Insekten ohne Betäubung zwischen Gehegen transportiert werden können. Der Aspirator im Beispielprotokoll wurde für ein Experiment zur Quantifizierung des individuellen Pflegeverhaltens...

Fly Aspirator Tube: Ein einfaches Werkzeug zur Übertragung lebender Drosophila

Das automatisierte Nachführsystem Flywalk ist für hochauflösende Quantifizierung der Art der Duft Verhalten in Drosophila melanogaster verwendet.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Um neue Mutationen zu identifizieren, die die Mechanoempfindung beeinflussen, haben wir einen Assay entwickelt, der die Verhaltensreaktion auf taktile Stimulation von Fliegenborsten in mutierten Klonen misst, die mit der MARCM-Methode erzeugt wurden. Die Kombination der Techniken ermöglicht die Identifizierung mechanosensitiver Mutationen, die sonst tödlich wären.

Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieser Artikel beschreibt einen Verhaltenstest , die männliche Paarungs Laufwerk verwendet in Drosophila melanogaste r Motivation zu studieren. Mit dieser Methode können die Forscher fortgeschrittene Fliegenneurogenetischen Techniken verwenden, um die genetischen, molekularen aufzudecken und zellulären Mechanismen, die diese Motivation zu Grunde liegen.

Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Diese Arbeit beschreibt ein einfaches Verhaltensparadigma, das die Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fruchtfliegen ermöglicht. Die Methode basiert auf der Unterdrückung des angeborenen negativen Geotaxis-Verhaltens aufgrund der Assoziation zwischen einem bestimmten Umweltkontext und einem elektrischen Schlag.

Drosophila Passives Vermeidungsverhalten als neues Paradigma zur Untersuchung assoziativen aversiven Lernens

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist mit einer Beeinträchtigung des sozialen und kommunikativen Verhaltens und dem Auftreten von sich wiederholendem Verhalten verbunden. Um die Wechselbeziehung zwischen ASD-Genen und Verhaltensdefiziten im Drosophila-Modell zu untersuchen, werden in dieser Arbeit fünf Verhaltensparadigmen zur Untersuchung von sozialem Abstand, Aggression, Balz, Pflege und Gewöhnungsverhalten beschrieben.

Paradigmen für die Verhaltensbewertung im Drosophila-Modell der Autismus-Spektrum-Störung

Nagetiermodelle sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung von Kernverhaltensweisen im Zusammenhang mit der Autismus-Spektrum-Störung (ASS). In diesem Artikel erläutern wir zwei Verhaltenstests zur Modellierung der Kernmerkmale von ASD bei Mäusen: Self-Grooming, der sich wiederholendes Verhalten bewertet, und der Drei-Kammer-Test für soziale Interaktion, der soziale Beeinträchtigungen dokumentiert.

Strategien zur Beurteilung autistischer Verhaltensweisen bei Mäusen

Das hier vorgestellte Verfahren beinhaltet die manuelle Annotation von Filmmaterial, das von Drosophila melanogaster für spezifisches Pflegeverhalten aufgenommen wurde. Es ermöglicht die Quantifizierung sowohl der Anzahl der Grooming-Anfälle als auch der Gesamtzeit, die mit der Fellpflege verbracht wird, um atypische Selbstpflege-Phänotypen zu bewerten.

Quantifizierung des Grooming-Verhaltens von Drosophila melanogaster zur Bewertung exzessiver Grooming-Phänotypen

Lernen Sie eine skalierbare Methode zur Quantifizierung von Grooming-Verhalten bei Drosophila durch Farbstoffakkumulation. Diese Technik liefert robuste quantitative Daten für die Neurobiologie und Verhaltensgenetik.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Weitere Videos entdecken