Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, das Pflegeverhalten von Drosophila zu messen, indem der verbleibende Anteil einer gefärbten brillantgelben Farbe am Körper der Tiere unter gepflegten und ungepflegten Bedingungen quantifiziert und verglichen wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie und der Verhaltensgenetik zu beantworten, beispielsweise zur Koordination feiner motorischer Fähigkeiten sowie zu den damit verbundenen molekularen Regulatoren und Schaltkreisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie schnell, robust und einfach von vielen Experimentatoren und Studierenden mit unterschiedlichem Erfahrungsgrad durchführbar ist.

Den Ablauf dieses Verfahrens wird Frankie Barradale, ein Student in meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie einen Aspirator vorbereiten, um lebende Drosophila aus einer Kulturröhrchen in die Pflegekammer zu befördern. Schneiden Sie mit einer Schere 1,5 Fuß Tygon-Schlauch zu.

Schneiden Sie mindestens einen Zentimeter von der Spitze einer Ein-Milliliter-Wegwerfmikropipettenspitze ab und halten Sie das quadratische Stück Netz mit einer Kantenlänge von einem Zentimeter über die 196 Zoll große Öffnung der abgeschnittenen Spitze. Setzen Sie eine neue, frische Ein-Milliliter-Mikropipettenspitze fest über das Netz und die abgeschnittene Spitze, um eine Haltekammer für die Fliegen zu erzeugen. Schneiden Sie die äußerste Spitze der neuen Mikropipettenspitze ab, um die Öffnung so weit zu vergrößern, dass ein einzelner Fliege hindurchpassen kann.

Das Loch passt ungefähr zur Öffnung der Pflegekammer. Setzen Sie die ineinander gesteckten Spitzen fest am Ende des Tygon-Schlauchs an. Drücken Sie die Spitzen in den Schlauch, um einen dichten Sitz zu gewährleisten, der Vakuumdruck ermöglicht.

Schneiden Sie am anderen Ende des Schlauchs die Spitze einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze ab und stecken Sie das schmale, abgeschnittene Ende in den Schlauch, um die Mundseite des Aspirators zu bilden. Um die Staubbeprobungsgefäße vorzubereiten, wiegen Sie fünf Milligramm Brillantgelb-Farbstoff auf Wiegepapier ab. Geben Sie das Pulver in ein 8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und verschließen Sie den Deckel fest.

Als Nächstes pipettieren Sie ein Milliliter 100 % Ethanol in 15-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um Ethanolröhrchen herzustellen. Beschriften Sie die Röhrchen, verschließen Sie sie und bewahren Sie sie zur abschließenden Durchführung des Pflegeverhaltens-Assays auf. Fügen Sie außerdem mindestens eine Blindprobe mit nur einem Milliliter Ethanol ohne Fliege für negative Kontrollen hinzu.

Bauen Sie jede Pflegekammer zusammen, indem Sie die verschiebbare Deckplatte mit den kleineren Löchern anschrauben, die Bodenplatte mit den größeren Löchern jedoch entfernt lassen, um das Hinzufügen des Staubs zu ermöglichen. Stellen Sie jede erforderliche Pflegekammer flach auf einen Tisch, wobei die Oberseite nach unten zeigt. Geben Sie fünf Milligramm einer Portion gelben Brillantfarbstoffs in jede Kammer, indem Sie das Röhrchen gegen die Oberfläche der Kammer über dem gewünschten Brunnen antippen.

Tippen Sie die Kammer gegen den Tisch, um sicherzustellen, dass der gesamte Staub durch das Netz fällt und sich auf der Oberseite der Platte sammelt. Schrauben Sie dann die Bodenplatte an jede Kammer, sodass die breiteren Enden der konischen Öffnungen nach außen zeigen und die Löcher nicht über den Vertiefungen liegen. Befestigen Sie die Bodenplatte fest, damit sie nicht verrutscht und Farbstoff freisetzt.

Drehen Sie die Kammer um und klopfen Sie sie mehrmals flach auf den Tisch, damit der Staub durch das Netz fällt und auf der unteren Platte liegen bleibt. Verschieben Sie die obere Platte der Kammer in die offenen Positionen, sodass die kleinen Löcher mit den 15 Vertiefungen ausgerichtet sind, wodurch die Einführung der Fliegen in die einzelnen Vertiefungen ermöglicht wird. Laden Sie eine Fliege in den Mundpipettierer, indem Sie vorsichtig durch ein Ende des Pipettierers saugen, als ob Sie einen Strohhalm benutzen würden.

Bringen Sie die Fliegen durch vorsichtiges Anblasen an, wobei die Öffnung auf das Ziel ausgerichtet sein sollte. Nachdem ein Loch beladen wurde, schieben Sie die obere Platte so, dass die Fliege in der Kammer eingeschlossen ist, und verschließen Sie die Öffnung des Lochs mit Klebeband während des Beladens der übrigen Kammern, um das Entkommen der Fliege zu verhindern. Falls mehrere Fliegen in ein einzelnes Loch aufgesaugt werden, lassen Sie diese Öffnung so lange unbedeckt, bis nur noch eine Fliege übrig ist.

Nachdem alle erforderlichen Vertiefungen mit Fliegen gefüllt sind, drehen Sie die Kammer um, sodass die Bodenplatte nach oben zeigt und der Staub durch das Sieb hindurch auf die Fliegen fallen kann. Befestigen Sie die obere und untere Platte fest, indem Sie die Schrauben anziehen, und wirbeln Sie die Kammer vier Sekunden lang, um die Fliegen mit dem Puder zu bestäuben. Schlagen Sie die Kammer zweimal mit der oberen Platte nach unten auf den Tisch, damit das Farbpulver auf die andere Seite durchfällt.

Drehen Sie dann die Kammer um, sodass die obere Platte nach oben zeigt, und klopfen Sie zweimal leicht dagegen, um sicherzustellen, dass die Farbe sich auf dem Boden der unteren Kammer absetzt und nicht in der Nähe der im oberen Teil der Kammer festgehaltenen Fliege ist. Bei Kontrollfliegen, denen das Putzen untersagt ist, fahren Sie sofort mit der Probenvorbereitung fort. Stellen Sie die Kammer flach auf den Tisch oder die Arbeitsplatte, wobei die obere Platte nach oben zeigt, und lassen Sie die Fliegen 30 Minuten lang putzen.

Stellen Sie die Kammer an einen geräusch- und vibrationsfreien Ort, um die Umgebungsbedingungen für alle Pflegeexperimente konstant zu halten. Halten Sie die Kammer waagerecht mit der oberen Platte nach oben und schrauben Sie vorsichtig die untere Platte ab, wobei Sie darauf achten, keine Farbe zu verlieren. Stellen Sie die Kammer auf ein CO2-Kissen mit geringer Luftzufuhr, bis die Fliegen anästhesiert sind.

Lösen Sie die obere Platte von der Kammer, greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette ein Bein und entfernen Sie eine bestäubte Fliege aus jeder Kammer, um sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Ethanol zu geben. Sobald sich in jedem Mikrozentrifugenröhrchen eine Fliege befindet, schließen Sie den Deckel und stülpen Sie die Röhrchen dreimal um, um die Lösung aus Farbstoff und Ethanol zu durchmischen. Inkubieren Sie die Röhrchen mit Ethanol und Fliegen fünf Stunden bei Raumtemperatur, um einen vollständigen Übergang des Farbstoffs von der Fliege in die Lösung sicherzustellen.

Nach fünf Stunden kurz jeden Kolben zwei Sekunden lang verwirbeln, um sicherzustellen, dass die Farbstoffe von den Fliegen abgetragen wurden. Portionieren Sie 50 Mikroliter aus dem experimentellen 1,5-Milliliter-Kolben in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte, wobei die Position jeder Probe auf der Platte zu dokumentieren ist. Geben Sie 200 Mikroliter Ethanol hinzu, um die Probe fünffach zu verdünnen, um Versiegelungseffekte durch stark bestäubte Fliegen oder große Pflegedefekte zu vermeiden.

Analysieren Sie jede Probe mithilfe eines Plattenlesegeräts bei 397 Nanometern. Erfassen Sie die Probe mit dem Plattenlesegerät und speichern Sie die Tabelle mit den aufgezeichneten Proben auf der Platte. Wir verwendeten diese Methode, um DopR zu untersuchen, indem wir die Pflegeleistung eines starken Hypomorphen und von DopR-Null-Mutanten mit einem Wildtyp-Stamm verglichen.

Die DopR-Mutanten behielten signifikant mehr Farbstoff als ihre Wildtyp- oder komplementierten Gegenstücke, was darauf hindeutet, dass die DopR-Mutanten weniger effizient im Pflegeverhalten waren. In einem parallelen Experiment mit Rutabaga-Fliegen zeigten die Mutanten höhere Farbstoffansammlungen als die DopR-Mutanten, was auf eine bedeutende Rolle von DopR im Pflegeverhalten schließen lässt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fliegen für Verhaltensassays handhabt und das Pflegeverhalten messen kann.