Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das Fellpflegeverhalten von Drosophila zu messen, indem der Rest des farbigen leuchtend gelben Farbstoffs auf dem Körper der Tiere unter gepflegten und ungepflegten Bedingungen quantifiziert und verglichen wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie und Verhaltensgenetik zu beantworten, wie z.B. die Koordination der feinmotorischen Fähigkeiten und der damit verbundenen molekularen Regulatoren und Schaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell, robust und von vielen Experimentatoren und Schülern unterschiedlicher Fähigkeitsstufen einfach durchzuführen ist.

Dieses Verfahren wird von Frankie Barradale, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Um das Experiment zu beginnen, bereiten Sie einen Aspirator vor, um lebende Drosophila aus einem Kulturfläschchen in die Putzkammer zu bringen. Schneiden Sie mit einer Schere 1,5 Fuß Tygon-Rohr ab.

Schneiden Sie mindestens einen Zoll der Spitze einer Einweg-Mikropipettenspitze ab und halten Sie das einen Zentimeter große Stück Netz über die 196 Zoll große Öffnung der abgeschnittenen Spitze. Platzieren Sie eine frische Mikropipettenspitze von einem Milliliter über dem Netz und schneiden Sie die Spitze ab, um eine Haltekammer für Fliegen zu schaffen. Schneiden Sie die äußerste Spitze der neuen Mikropipettenspitze ab, um die Öffnung so weit zu verbreitern, dass eine einzelne Fliege durchgelassen werden kann.

Das Loch entspricht in etwa der Öffnung der Putzkammer. Stecken Sie die ineinander verschachtelten Spitzen fest auf das Ende des Tygon-Schlauchs. Schieben Sie die Spitzen in das Rohr, um einen festen Sitz zu gewährleisten und einen Vakuumdruck zu ermöglichen.

Schneiden Sie am anderen Ende des Schlauchs die Spitze einer 200-Milliliter-Mikropipettenspitze ab und setzen Sie das schmale geschnittene Ende in den Schlauch ein, um die Mundseite des Aspirators zu bilden. Zur Herstellung von Staub-Aliquot-Röhrchen werden fünf Milligramm leuchtend gelber Farbstoff auf Wägepapier gewogen. Gießen Sie den Staub in ein 8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schließen Sie die Kappe fest.

Um Ethanolröhrchen vorzubereiten, pipettieren Sie anschließend einen Milliliter 100%iges Ethanol in 15-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften Sie die Röhrchen, verschließen Sie sie und bewahren Sie sie für den Abschluss des Grooming-Assays auf. Fügen Sie außerdem mindestens eine Blindprobe mit nur einem Milliliter Ethanol ohne Fliege für die Negativkontrollen hinzu.

Bauen Sie jede Putzkammer zusammen, indem Sie die verschiebbare obere Platte mit den kleineren Löchern verschrauben, aber die untere Platte mit den größeren Löchern entfernen, um den Staub hinzuzufügen. Stellen Sie jede notwendige Putzkammer flach mit der Oberseite nach unten auf einen Tisch. Laden Sie fünf Milligramm brillantgelben Farbstoff aliquot in jede Kammer, indem Sie das Röhrchen gegen die Oberfläche der Kammer über der gewünschten Vertiefung klopfen.

Klopfen Sie mit der Kammer gegen den Tisch, um sicherzustellen, dass der gesamte Staub durch das Netz auf die Oberseite der Platte fällt. Schrauben Sie dann die Bodenplatte auf jede Kammer, so dass die breiteren Enden der konischen Öffnungen nach außen zeigen und die Löcher nicht über den Vertiefungen aufliegen. Befestigen Sie die Bodenplatte fest, damit sie nicht verrutscht und Farbe freisetzt.

Drehen Sie die Kammer um und schlagen Sie sie einige Male flach gegen den Tisch, so dass der Staub durch das Netz fällt und auf der Bodenplatte aufliegt. Schieben Sie die obere Platte der Kammer in die offenen Positionen, so dass die kleinen Löcher mit den 15 Vertiefungen ausgerichtet sind, so dass die Fliegen in die einzelnen Vertiefungen eingeführt werden können. Laden Sie eine Fliege in den Mundsauger, indem Sie vorsichtig durch ein Ende des Saugers saugen, als ob Sie einen Strohhalm verwenden würden.

Lege die Fliegen ab, indem du leicht bläst und die Öffnung auf das Ziel richtest. Schieben Sie nach dem Laden eines Bohrlochs die obere Platte so, dass die Fliege in der Kammer gefangen ist, und legen Sie während des Ladens der Bohrlochkammer Klebeband über die Öffnung des Bohrlochs, um zu verhindern, dass die Fliege beim Laden der anderen Vertiefungen entweicht. Wenn mehrere Fliegen in eine einzige Vertiefung aspiriert werden, lassen Sie diese Öffnung unbedeckt, bis nur noch eine Fliege übrig bleibt.

Nachdem alle notwendigen Vertiefungen mit Fliegen gefüllt sind, drehen Sie die Kammer um, so dass die Bodenplatte nach oben zeigt und der Staub das Potenzial hat, die Fliegen zu beschichten, indem er durch das Netz fällt. Befestigen Sie die obere und untere Platte, indem Sie die Schrauben festziehen und die Kammer vier Sekunden lang wirbeln, um die Fliegen zu stauben. Stoße die Kammer mit der oberen Platte nach unten zweimal gegen den Tisch, so dass der Farbstoff durch die andere Seite fällt.

Drehen Sie dann die Kammer mit der oberen Platte nach oben um und klopfen Sie zweimal auf die Kammer, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff auf dem Boden der unteren Kammer absetzt, weg von der Fliege, die in der oberen Kammer gehalten wird. Bei Kontrollfliegen, die nicht geputzt werden dürfen, fahren Sie sofort mit der Probenvorbereitung fort. Lege die Kammer flach auf den Tisch oder die Arbeitsplatte, wobei die obere Platte 30 Minuten lang nach oben zeigt, damit die Fliegen sich putzen können.

Stellen Sie die Kammer an einem geräuschvibrationsfreien Raum auf, um Ihre Umgebung für alle Pflegeexperimente konstant zu halten. Halten Sie die Kammer auf einer Höhe mit der oberen Platte nach oben, schrauben Sie die untere Platte vorsichtig ab und entfernen Sie sie aus der Kammer, wobei Sie darauf achten, dass keine Farbe verloren geht. Stellen Sie die Kammer auf ein CO2-Pad mit geringem Luftstrom, bis die Fliegen betäubt sind.

Schrauben Sie die obere Platte von der Kammer ab, greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach einem Bein, entfernen Sie eine bestäubte Fliege aus jeder Kammer und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Ethanol. Sobald jedes Mikrozentrifugenröhrchen eine Fliege enthält, schließen Sie die Kappe und drehen Sie die Röhrchen dreimal um, um die Lösung aus Farbstoff und Ethanol zu rühren und zu mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen mit Ethanol und Fliegen fünf Stunden lang bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass der Farbstoff vollständig aus der Fliege in Lösung entfernt wird.

Nach fünf Stunden jede Tube zwei Sekunden lang kurz vortexen, um sicherzustellen, dass die Farbstoffe von den Fliegen entfernt werden. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter des experimentellen 1,5-Milliliter-Röhrchens in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte, wobei die Position jeder Probe auf der Platte notiert wird. Fügen Sie 200 Mikroliter Ethanol hinzu, um die Probe fünfmal zu verdünnen, um Versiegelungseffekte durch stark bestäubte Fliegen oder große Pflegefehler zu vermeiden.

Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um jede Probe bei 397 Nanometern zu analysieren. Nehmen Sie die Probe über den Plattenleser auf und speichern Sie die Tabelle mit den Aufnahmeproben auf der Platte. Wir verwendeten diese Methode, um DopR zu untersuchen, indem wir die Pflegeleistung eines starken Hypomorphs verglichen und Null-DopR-Mutanten mit einem Wildtyp-Stamm verglichen.

Die DopR-Mutanten behielten signifikant mehr Farbstoff als ihre wilden Artgenossen von geretteten Artgenossen, was darauf hindeutet, dass die DopR-Mutanten weniger effizient im Pflegeverhalten waren. In einem parallelen Experiment mit Rutabaga-Fliegen wiesen Mutanten eine höhere Farbakkumulation auf als DopR-Mutanten, was auf eine signifikante Rolle von DopR im Pflegeverhalten hindeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit Fliegen für Verhaltenstests umgeht und auch das Fellpflegeverhalten misst.